高效液相色譜柱效測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)六高效液相色譜(HPLC )柱效測(cè)定093858張亞輝實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)高效液相色譜儀的基本操作方法。2、了解高效液相色譜儀原理和條件設(shè)定方法。3、了解高效液相色譜法在日常分析中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)原理高效液相色譜法是以液體作為流動(dòng)相，借助于高壓輸液泵獲得相對(duì)較高流 速的液流以提高分離速度、并采用顆粒極細(xì)的高效固定相制成的色譜柱進(jìn)行分離 和分析的一種色譜方法。在高效液相色譜中，若采用非極性固定相，如十八烷基鍵合相，極性流動(dòng) 相，即構(gòu)成反相色譜分離系統(tǒng)。反之，則稱為正相色譜分離系統(tǒng)。反相色譜系統(tǒng) 所使用的流動(dòng)相成本較低，應(yīng)用也更為廣泛。定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測(cè)量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的

2、 分離度。分離度(R)的計(jì)算公式為：R= 2t -t /1.7*(W+W)(R2)(R1)12式中t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；t(Ri)為相鄰兩峰中前一峰的保留 時(shí)間；W及W為此相鄰兩峰的半峰寬。除另外有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。12本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為鄰苯二甲酸酯，又稱酞酸酯，縮寫(xiě) PAE，常被用作塑料增 塑劑。它被普遍應(yīng)用于玩具、食品包裝材料、醫(yī)用血袋和膠管、乙烯地板和 壁紙、清潔劑、潤(rùn)滑油、個(gè)人護(hù)理用品，如指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗 發(fā)液等數(shù)百種產(chǎn)品中。 但研究表明，鄰苯二甲酸酯在人體和動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮 著類似雌性激素的作用，是一類內(nèi)分泌干擾物。待測(cè)物性質(zhì)見(jiàn)表1。表1色譜柱測(cè)試條件出

3、峰次序樣品組成1鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)2鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)3鄰苯二甲酸二T(DBP)如果要檢測(cè)不同條件對(duì)譜圖分離的影響，可按表1配制幾種物質(zhì)的混合溶 液，在不同條件下進(jìn)行HPLC分離檢測(cè)。儀器與試劑1、儀器Agilent 1100高效液相色譜儀，50ul微量注射器。2、試劑甲醇(色譜專用)，高純水實(shí)驗(yàn)步驟1、色譜條件色譜柱：辛烷基硅烷鍵合硅膠(C8)柱溫：室溫流動(dòng)相：初始為高純水：20%，甲醇：80%檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；進(jìn)樣體積：20但定量環(huán)，實(shí)際注射每次可控制在40似。2、待測(cè)溶液的配制首先用甲醇做溶劑配制儲(chǔ)備液：鄰苯二甲酸二甲酯(0.3880g/L)，鄰

4、苯二甲 酸二乙酯(0.2770g/L)，鄰苯二甲酸二丁酯(0.3776g/L)。然后各取1mL儲(chǔ)備液 用水和甲醇(20： 80)稀釋至10mL，作為待測(cè)溶液。3、色譜測(cè)定按操作規(guī)程開(kāi)啟電腦，開(kāi)啟脫氣機(jī)、泵、檢測(cè)器等的電源，啟動(dòng)Agilent 1100 在線工作軟件，設(shè)定操作條件。流量為1.000ml/min。待儀器穩(wěn)定后，開(kāi)始進(jìn)樣。將進(jìn)樣閥柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸 取混合物溶液40ul，注入儀器進(jìn)樣口，順時(shí)針?lè)较虬鈩?dòng)進(jìn)樣閥至“INJECT位置， 此時(shí)顯示屏顯示進(jìn)樣標(biāo)志。記下各組分色譜峰的保留時(shí)間及峰面積及分離比。實(shí)驗(yàn)完畢，清洗系統(tǒng)及色譜柱。依次用甲醇-水(60： 40)、甲醇-水

5、(70： 30) 直到純甲醇作流動(dòng)相清洗，每次清洗至基線走穩(wěn)，至少清洗15min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)梯度洗脫條件如下t/min0237.5甲醇比例80%80%95%80%R二叫* 睥+。2 x (3.792 - 3.202)1.7 x (0.0970 + 0.1026)=3.48(注：此處及以下都為第一個(gè)峰和第二個(gè)峰的分離度)R= 2tR(2)-tR(i)=2 x Z-F =3.771.7*2(2) + *21.7 x (0.1002 + 0.1046)1.7 *2 + *21.7 x (0.0966 + 0.0930)(4)1.7*2 + *21.7 x (0.0799 + 0.0879)思考題

6、比較圖2和圖3可知，在緩沖液作流動(dòng)相的情況下，實(shí)驗(yàn)得出的峰形 較好。但為什么實(shí)驗(yàn)室盡量不用緩沖溶液作流動(dòng)相？DAD1 B. E：ig=22Li.16 Ref=3：iij. 100 (3118C1180004.D)mAU300BOO4002000nqp圖2緩沖液作流動(dòng)相得出的色譜圖圖3乙腈-水（5： 95）作流動(dòng)相得出的色譜圖用緩沖溶液作流動(dòng)相，可能造成色譜柱填料被化學(xué)破壞，這種對(duì)色譜柱固定 相及鍵合相的破壞通常是不可修復(fù)的。（2）流動(dòng)相在使用前為什么要用砂芯漏斗過(guò)濾？色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì) 使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加

7、進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加 泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損?？傊M量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和 使檢測(cè)器噪聲增加。（3）請(qǐng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，怎樣清洗柱子。分為兩種情況，第一種情況為流 動(dòng)相用到緩沖溶液，第二種情況為流動(dòng)相不用緩沖溶液？1）對(duì)于使用過(guò)緩沖液的柱子，必須先將體系中鹽分去除干凈，然后再以強(qiáng) 溶劑清洗。通常可以同濃度但不含緩沖液成分的流動(dòng)相洗20倍柱體積，亦可直 接以純水洗至柱內(nèi)無(wú)鹽后再改換成強(qiáng)溶劑洗脫。要確保緩沖溶液與沖洗溶劑互 溶。如果不能互溶，首先要用水含量相對(duì)較高的溶劑沖洗系統(tǒng)和色譜柱，然后再 用沖洗溶劑替換。2）對(duì)于不用緩沖溶液：以20倍

8、柱體積或更多一些的強(qiáng)溶劑加以清洗。例如， 90%100%的甲醇、乙醇、乙臘、四氫吠喃等。如果效果不理想，則可換用更強(qiáng)的 溶劑清洗，例如，將系統(tǒng)逐步置換至乙酸乙酯、異丙醇、氯仿、烴類（如己烷、 庚烷等）。也可以在甲醇、乙臘等水溶性溶劑之后，改用50%DMSO或DMF水溶液 加以清洗。清洗幾十倍柱體積后，再逐步置換返回原系統(tǒng)（4）根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，流動(dòng)相中水的比例多少對(duì)分離度、出峰時(shí)間的影 響及流速對(duì)分離度的影響。從五種梯度洗脫條件可以看出，隨著水的比例減小，分離度也減小，但出 峰時(shí)間加快。所以應(yīng)選擇一個(gè)合適的流動(dòng)相比例。流速較小，分離度更大，但出峰時(shí)間延長(zhǎng)。七、分析與討論1.與氣相色譜法比較，液相色譜法不受試樣揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，非 常適合于分離生物大分子，離子性化合物，不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物以及其它各種高分 子化合物等。液相色譜中的流動(dòng)相不僅起到使試樣沿色譜柱移動(dòng)的作用，而且與 固定相一樣，與試樣發(fā)生選擇性的相互作用，這就為控制改善分離條件提供了一 個(gè)額