微生物下游加工工程課件

1、微生物發(fā)酵工程8.微生物下游加工工程 內(nèi)容提要1.下游工程的流程2.發(fā)酵液的預(yù)處理和過(guò)濾3.產(chǎn)物的分離純化方法Company Logo 產(chǎn)物在胞內(nèi)還是胞外產(chǎn)物濃度產(chǎn)物的理化性質(zhì)產(chǎn)物的用途產(chǎn)物的最低純度標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵液中的雜質(zhì)產(chǎn)物的市場(chǎng)價(jià)格選擇下游工藝的原則8.1第一節(jié) 下游工程的流程Company Logo一. 下游工程的特點(diǎn)和重要性代價(jià)高，回收率低產(chǎn)物穩(wěn)定性低雜質(zhì)種類多含量高產(chǎn)物濃度低微生物工程產(chǎn)品特點(diǎn) 特 點(diǎn)提高回收率降低分離純化成本下游加工研究的目的：Company Logo發(fā)酵液是復(fù)雜的多相體系，分離難；所占的成本比例高；決定產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵下游工程的重要性：Company Logo8.2發(fā)酵

2、液的預(yù)處理和過(guò)濾無(wú)論代謝產(chǎn)物是積累在胞內(nèi)還是胞外， 都要首先進(jìn)行預(yù)處理和過(guò)濾。一. 預(yù)處理: 加熱稀釋沉降絮凝預(yù)處理的方法目的：改變發(fā)酵液的性質(zhì)加快沉降產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到便于處理的相中部分除雜Company Logo預(yù)處理的作用與方法色素高價(jià)陽(yáng)離子雜蛋白交換吸附草酸-鈣三聚磷酸鈉黃血鹽沉淀加熱絮凝吸附Company LogoCompany LogoCompany LogoCompany Logo細(xì)胞破碎非機(jī)械法機(jī)械法高壓勻漿X-press超聲波法干燥凍融法滲透壓沖擊法酶解法化學(xué)溶胞Company Logo機(jī)械法-高壓勻漿法 原理:利用高壓使細(xì)胞懸液通過(guò)針形閥,由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán),造成細(xì)胞破碎

3、Company Logo機(jī)械法-超聲波法頻率：15-25kHz原因：超聲波的空穴作用。由于空穴泡又受到超聲波的迅速?zèng)_擊而閉合，從而產(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由此引起的粘滯性漩渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，造成細(xì)胞破碎。注意：溫度上升。 桿菌比球菌容易，革蘭氏陰性菌比陽(yáng)性菌容易，酵母差。Company Logo非機(jī)械法-酶法原理：利用酶反應(yīng)分解破碎細(xì)胞壁成分的特殊化學(xué)鍵，達(dá)到使細(xì)胞破碎的目的。優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，條件溫和缺點(diǎn)：成本高，易受條件影響。常用的酶有：溶菌酶，利用細(xì)胞的自溶：溶胞的酶是微生物自身產(chǎn)生的一種可以水解自身細(xì)胞壁上聚合結(jié)構(gòu)的酶，以利生長(zhǎng)過(guò)程繼續(xù)進(jìn)

4、行下去。 改變環(huán)境條件，可誘發(fā)這種酶過(guò)量產(chǎn)生或激發(fā)其他自溶酶。抑制細(xì)胞壁合成的物質(zhì)也可以起到酶解的目的。Company Logo原理：將細(xì)胞先放到高滲透壓的介質(zhì)中，達(dá)到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入到水或緩沖液中， 水會(huì)迅速進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞膨脹，引起細(xì)胞壁的破裂。洗滌高滲低滲冷凍離心30mM Tris-HClpH 7.020% 蔗糖 pH 7.20.1mM EDTA4 大腸桿菌中親水性的酶非機(jī)械法-滲透壓沖擊法Company Logo將細(xì)胞反復(fù)在低溫下突然冷凍后，在室溫下熔化，最后引起細(xì)胞破碎。非機(jī)械法-反復(fù)凍融Company Logo細(xì)胞破碎率的測(cè)定測(cè)定釋放的胞內(nèi)產(chǎn)物測(cè)定未破碎細(xì)胞量電

5、導(dǎo)率方法Company Logo8.3產(chǎn)物的分離純化方法一. 沉淀法:等電點(diǎn)法非離子型多聚物法聚電解質(zhì)法有機(jī)溶劑沉淀法鹽析法沉淀法通過(guò)改變條件或加入某種溶劑, 使溶劑中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龅倪^(guò)程特點(diǎn): 成本低,設(shè)備簡(jiǎn)單,收率高, 濃縮倍數(shù)高, 操作簡(jiǎn)單.Company Logo鹽析的原理：中性鹽的加入，能破壞蛋白質(zhì)，酶等膠體性質(zhì)，中和微粒上的電荷，促使蛋白質(zhì)等沉淀。Company Logo用鹽析分離蛋白質(zhì)12在一定離子強(qiáng)度下，改變?nèi)芤旱膒H 及溫度的沉淀法“K”分級(jí)鹽析在一定的pH和溫度下，改變離子強(qiáng)度或鹽濃度的方法?！啊?分級(jí)鹽析法Company Logo 有機(jī)溶劑如丙酮，乙醇，甲醇等

6、能使溶于水的小分子生物物質(zhì)及核酸，多糖，蛋白質(zhì)等生物分子發(fā)生沉淀作用注意: 一般冷卻加入同一溶劑，蛋白質(zhì)的分子量越大，沉淀所需的有機(jī)溶劑量越少沉淀法 - 有機(jī)溶劑沉淀法Company Logo有機(jī)溶劑沉淀法優(yōu)點(diǎn)分辨力高沉淀不需脫鹽易固液分離易蒸發(fā)，無(wú)殘留缺點(diǎn)蛋白易變性失活安全降溫增收Company Logo有機(jī)溶劑的選擇和使用濃度計(jì)算條件：與水互溶，但對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)作用乙醇，丙酮，甲醇，二甲基甲酰胺，二甲基椏砜，乙腈，氯仿，乙醚和2，戊二醇等是核酸，糖類，氨基酸和核苷酸最常用的異戊醇和二氧基乙醇Company Logo影響有機(jī)溶劑沉淀的因素：溶劑的種類和用量離子強(qiáng)度樣品濃度分子量溫度，時(shí)間Comp

7、any Logo原理：利用各種物質(zhì)在不同的溶劑中具有不同的溶解度料液萃取劑萃取液萃余液二溶劑萃取法Company Logo在一定溫度和壓力下，溶質(zhì)分配在兩不相溶的溶劑中，達(dá)到平衡時(shí)，溶質(zhì)在兩相的濃度之比Company Logo化學(xué)穩(wěn)定價(jià)廉安全與被萃液互溶度小黏度低，界面張力適中對(duì)產(chǎn)物有大的溶解度和良好的選擇性溶劑的選擇乙酸乙酯，乙酸丁酯，丁醇Company Logo影響因素帶溶劑溫度離子強(qiáng)度分配系數(shù)選擇性能與所提取的生物物質(zhì)形成復(fù)合物，而易溶于溶劑的物質(zhì)Company Logo萃取方法：混合分離回收攪拌罐管道萃取噴射萃取單級(jí)萃?。盒什桓叨嗉?jí)萃?。哄e(cuò)流：效果好用量大逆流：用量少收率高Compa

8、ny LogoCompany LogoCompany Logo三離子交換法特點(diǎn)用于前提樹(shù)脂設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，易自動(dòng)控制，高效率生物物質(zhì)的分離純化，脫鹽，濃縮，轉(zhuǎn)化，中和脫色等某條件下，待分離樣品能形成陰，陽(yáng)或偶極離子人工合成的不容于酸，堿和有機(jī)溶劑的高分子聚合物Company Logo離子交換樹(shù)脂陽(yáng)離子交換樹(shù)脂陰離子交換樹(shù)脂強(qiáng)酸弱酸強(qiáng)堿弱堿Company Logo無(wú)使用限制再生處理，水洗至中性；處理，水洗至備用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂Company Logo有以羧基（），酚羥基（）等為活性基團(tuán)的弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，交換性能與溶液的值有關(guān) 再生水洗到，易再生成型弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：Compan

9、y Logo型型RN(CH3)3CL+NaOH RN(CH3)3OH + NaCl強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂：無(wú)使用限制Company Logo活性基團(tuán): 伯胺基,仲胺基,叔胺基和吡啶基.交換能力隨pH值的變化而變化. pH越低,交換能力越大.RNH3OH + HCL RNH3CL + H2O再生易再生成羥型,耗堿量小弱堿性陰離子交換樹(shù)脂:Company Logo12合成樹(shù)脂時(shí), 單體中二乙烯苯的含量百分?jǐn)?shù). 8-12%.一定量樹(shù)脂中, 可交換基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù).。交換容量交聯(lián)度Company Logo樹(shù)脂的選擇:產(chǎn)物的酸堿性質(zhì)強(qiáng)酸性物質(zhì)應(yīng)選用弱減性陰離子交換樹(shù)脂弱酸性物質(zhì)應(yīng)選用強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂便

10、于洗脫交聯(lián)度大分子選用低交聯(lián)度小分子選用高交聯(lián)度但是在不影響交換容量的條件下, 盡可能提高交聯(lián)度Company Logo交換條件pH: 被吸附物穩(wěn)定; 被吸附物離子化; 樹(shù)脂離子化樹(shù)脂處理成一定型式,弱酸-鈉型; 弱堿-氯型; 強(qiáng)酸強(qiáng)堿任何形式, 若產(chǎn)物在酸性和堿性條件下易破壞, 不能采用氫型和羥型.產(chǎn)物濃度; 低價(jià)離子增加濃度， 高價(jià)離子減少濃度洗脫條件酸性上柱,堿性洗脫; 堿性上柱, 酸性洗脫;緩沖液洗脫 操作條件:Company Logo四.結(jié)晶法物質(zhì)從液態(tài)或氣態(tài)形成晶體的過(guò)程許多性質(zhì)相同的粒子在三維空間有規(guī)律地排列成格子狀固體的物質(zhì)物質(zhì)自身的性質(zhì)和適宜的條件晶體結(jié)晶能否結(jié)晶Company Logo生物物質(zhì)形成晶體條件:樣品的純度溶液的飽和度溶劑的性質(zhì)蛋白要50%以上稍或低過(guò)飽和不能與結(jié)晶物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)應(yīng)對(duì)結(jié)晶物質(zhì)有較高的溫度系數(shù)應(yīng)對(duì)雜質(zhì)有較大的溶解度安全,成本,易回收Company Logo 結(jié)晶的方法 濃縮冷卻化學(xué)反應(yīng)鹽析含有樣品的溶液減壓蒸發(fā)濃縮, 使溶液達(dá)到過(guò)飽和適于溶解度隨溫度變化不大的物質(zhì)先加熱