基因工程-工具酶生物工程所有課件

自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。這些酶類參與微生物的核酸代謝，在核酸復(fù)制和修復(fù)等反應(yīng)中具有重要作用，有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的DNA進而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用這些酶類對基因切割、拼接操作方法后，人類獲得了最好的基因工程工具。隨著越來越多的酶分子被發(fā)現(xiàn)，許多廠商已將其克隆并開發(fā)成產(chǎn)品，工具酶的數(shù)量和用途不斷增加，不僅簡化了分子克隆的操作，而且拓寬了研究領(lǐng)域。本章主要介紹用于基因工程的各種工具酶。第1頁/共169頁自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。這些酶類基因工程工具酶

限制性內(nèi)切酶連接酶

DNA聚合酶

DNA修飾酶

RNA聚合酶磷酸激酶和磷酸酶核酸酶第2頁/共169頁基因工程工具酶限制性內(nèi)切酶第2頁/共169頁一、細菌的限制—修飾作用和限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶①50年代后Luria和Human(1952)Bertani和Weigle(1953)發(fā)現(xiàn)細菌的“限制”現(xiàn)象.1、細胞的限制—修飾作用第3頁/共169頁一、細菌的限制—修飾作用和限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性Phageλ（k）感染E.colik不感染E.coliB(E.coliB限制λ（k）)②仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因

E.coliB對λ(K)進行了修飾。E.coliB修飾λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)細菌如何對λ噬菌體進行限制和修飾？第4頁/共169頁感染E.colik不感染E.coliB(E.col①1962年W.Arber(瑞士)發(fā)現(xiàn)，寄主對噬菌體的修飾是在Phage入的DNA上。

②1965年，Arber發(fā)現(xiàn)修飾與λ的降解有關(guān)，提出：細胞中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶，即細胞中有限制—修飾系統(tǒng)(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系統(tǒng)是細菌安內(nèi)御外的積極措施。細菌的限制—修飾系統(tǒng)第5頁/共169頁①1962年W.Arber(瑞士)發(fā)現(xiàn)，寄主對噬菌體的修飾是即限制性內(nèi)切酶和與其對應(yīng)的甲基化酶系統(tǒng)，稱R-Msystem限制性內(nèi)切酶識別特異的DNA序列并打斷DNA，同時對應(yīng)的甲基化酶能把該段特異的序列甲基化，使得限制性內(nèi)切酶無法識別。這種系統(tǒng)在細菌中起到了免疫的作用，即外來入侵的DNA在限制性內(nèi)切酶的作用下被水解，而細菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保護起來。

細菌的限制和修飾現(xiàn)象第6頁/共169頁即限制性內(nèi)切酶和與其對應(yīng)的甲基化酶系統(tǒng)，稱R-Msyste第7頁/共169頁第7頁/共169頁

①1968年Linn和Arber從E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶,M.Meselson和R.yuan從E.coliK中分離到另一限制性的內(nèi)切酶。1970年Smith(美)在流感嗜血桿菌又發(fā)現(xiàn)另一限制酶即限制酶Ⅱ。②限制酶的功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。③1978年W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻獲得諾貝爾獎。限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第8頁/共169頁①1968年Linn和Arber從E.coliB中發(fā)二、限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。（Restrictionendonuclease）第9頁/共169頁二、限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定2.性質(zhì)內(nèi)切酶。原核生物。即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。自我保護作用。3.功能細菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1.來源第10頁/共169頁2.性質(zhì)內(nèi)切酶。原核生物。即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制（Restriction）第11頁/共169頁限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制細菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。（2）修飾（Modification）①Dam甲基化酶(Mec甲基化酶)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基第12頁/共169頁細菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身的第13頁/共169頁第13頁/共169頁1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：三、限制性內(nèi)切酶的命名1.用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。第14頁/共169頁1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名4.

限制酶前面要帶上R（Restriction)，修飾酶前面要帶上M（Modification）。（現(xiàn)已省略）。2.

用一個右下標的大寫字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。3.

如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoRI，EcoRV。第15頁/共169頁4.限制酶前面要帶上R（Restriction)，2.用EcoRIEscherichia屬名Coli種類Ry13株系編號

若種名頭2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。第16頁/共169頁EcoRIEscherichia屬名Coli種類Ry13株I型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。四、限制性內(nèi)切酶的類型II類限制性內(nèi)切酶III類限制性內(nèi)切酶第17頁/共169頁I型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌B株和K株分離的。（1）識別位點序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I類限制性內(nèi)切酶如EcoB和EcoK。未甲基化修飾的特異序列，非對稱性。第18頁/共169頁首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用機理在距離特異性識別位點約1000—1500bp處隨機切開一條單鏈。Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位點第19頁/共169頁需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用機理I類酶與DNA識別位點結(jié)合依賴于M亞基與輔助因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的相互作用，后者通過變構(gòu)作用使酶處于活性狀態(tài)。酶分子與識別位點結(jié)合之后，根據(jù)該位點的甲基化狀態(tài)發(fā)揮相應(yīng)的酶活性，或限制、或修飾、或既不限制也不修飾。I類酶的切割位點與識別位點通常相距1,000-5,000bp，切割位點的序列并不表現(xiàn)出嚴格的特異性，兩條DNA鏈上的斷裂位點相距70-75個核苷酸，因此切開的DNA分子末端是單鏈形式。第20頁/共169頁I類酶與DNA識別位點結(jié)合依賴于M亞基與輔助因子S-腺苷甲硫如果識別位點是全甲基化的，則ATP使酶-SAM復(fù)合物脫離DNA雙鏈；如果識別位點是半甲基化的(即只有一條鏈甲基化)，則酶-SAM復(fù)合物在ATP的幫助下使非甲基化的DNA鏈甲基化，同時SAM轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的S-腺苷高半胱氨酸(SAH)；如果識別位點沒有甲基化，ATP可使酶分子再次變構(gòu)，暴露出限制性內(nèi)切酶的活性部位，先釋放SAM，然后以一種未知的機制在切割位點處將雙鏈DNA切斷，同時消耗ATP。第21頁/共169頁如果識別位點是全甲基化的，則ATP使酶-SAM復(fù)合物脫離DN首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。II類限制性內(nèi)切酶分離的第一個酶是HindⅡ該類酶是一種分子量較小的單體蛋白，其雙鏈DNA的識別與切割活性僅需要Mg2+，且識別與切割位點的序列大都具有嚴格的特異性，因而在DNA重組及分子生物學(xué)實驗中被廣泛使用。第22頁/共169頁首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970（1）識別位點序列未甲基化修飾的雙鏈DNA；四、五或六個堿基對，而且具有180°旋轉(zhuǎn)對稱的回文結(jié)構(gòu)。與DNA的來源無關(guān)。5‘

…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘

…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點第23頁/共169頁（1）識別位點序列未甲基化修飾的雙鏈DNA；四、五或六個堿基絕大多數(shù)的II類酶均在其識別位點內(nèi)切割DNA，切割位點可發(fā)生在識別序列的任何兩個堿基之間。一部分酶識別相同的序列，但切點不同，這些酶稱為同位酶（Isoschizomers），其中識別位點與切割位點均相同的不同來源的酶稱為同裂酶，如SstI與SacI、HindIII與HsuI等。有些酶識別位點不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，這些酶稱為同尾酶（Isocandamers）。根據(jù)被切開的DNA末端性質(zhì)的不同，所有的II類酶又可分為5’突出末端酶、3’突出末端酶以及平頭末端酶三大類。II類酶分類第24頁/共169頁絕大多數(shù)的II類酶均在其識別位點內(nèi)切割DNA，切割位點可發(fā)生（2）切割位點切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識別位點處。EcoRV5’-GATüATC-3’

3’-CTA?TAG-5’Sam

I5’-GGGCGC-3’3’-CCCGGG-5

EcoRI5’-GüAATTC-3’3’-CTTAA?G-5’PstI5’-CTGCAüG-3’3’-G?ACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端產(chǎn)生平齊末端第25頁/共169頁（2）切割位點切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickye（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個核苷酸單鏈突出的末端。分兩種類型：①5’端凸出（如EcoRI切點）GüAATTC

CTTAA

GGAATTCCTTAA?G5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’第26頁/共169頁（3）粘性末端（stickyends，cohensiveCTGCAüG

②3’端凸出（如PstI切點）G?ACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

GACGTC第27頁/共169頁CTGCAüG②3’端凸出（如PstI切點）G?ACG①連接便利（4）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這比連接兩個平齊末端容易的多。第28頁/共169頁①連接便利（4）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只第29頁/共169頁第29頁/共169頁③補平成平齊末端凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端標記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端。第30頁/共169頁③補平成平齊末端凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶。（5）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶(同位酶)：識別位點和切點完全相同。如HindⅢ和HsuI。HindⅢ5’-AüAGCTT-3’3’-TTCGA?A-5’HsuI5’-AüAGCTT-3’3’-TTCGA?A-5’第31頁/共169頁識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶。（5）同裂酶（IsoschXmaI5’-CüCCGGG-3’3’-GGGCC?C-5’SmaI5’-CCCüGGG-3’3’-GGG?CCC-5’識別位點相同，但切點不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：第32頁/共169頁XmaI5’-CüCCGGG-3’識別位點相識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（6）同尾酶(Isocaudamers）5’-GüGATCC-3’3’-CCTAG?G-5’BamHIBclI5’-TüGATCA-3’3’-ACTAG?T-5’

5’-AüGATCT-3’3’-TCTAG?A-5’BglⅡ5’-UüGATCY-3’3’-YCTAG?U-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。第33頁/共169頁識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bg5’-üGATC----3’3’----CTAG?-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的“雜種位點”一般不能再被原來的酶識別。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A第34頁/共169頁5’-üGATC----3’Sau3A同尾酶的粘性末端互第35頁/共169頁第35頁/共169頁限制性內(nèi)切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點的專一性。（7）限制酶的酶活性如果改變反應(yīng)條件就會影響酶的專一性和切割效率，內(nèi)切酶出現(xiàn)切割與識別位點相似但不完全相同的序列，這一現(xiàn)象稱為星號（*）活性。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。①星號（*）活性

星活性可造成位點切割機率不等，降解不完全。第36頁/共169頁限制性內(nèi)切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、pH第37頁/共169頁第37頁/共169頁EcoRI和BamHI等都有*活性,使用時要注意?。≡诘望}、高pH（>8）時可識別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：如：ECORI★識別特異性放寬，GAATTC→AATT第38頁/共169頁EcoRI和BamHI等都有*活性,使用時要注意?。≡诘洼^高的甘油濃度（>5%v/v）；酶與底物DNA比例過高（不同的酶情況不同，通常為>100U/μg）；低鹽濃度（<25mM）高pH值（>pH8.0）存在有機溶劑（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等）用其他二價離子替代鎂離子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）導(dǎo)致星號活性的因素第39頁/共169頁較高的甘油濃度（>5%v/v）；導(dǎo)致星號活性的因素第3以下酶類易出現(xiàn)“星號活性”，它們是

BamHI，Bcl

I，BseBI，BssAI，EcoRI，EcoRV，HindIII，HpaI，Kpn

I，NcoI，NruI，Pst

I，PvuII，SalI，ScaI，SnaBI，SphI，SspI，XbaI。以上因素的影響程度因酶的不同而有所不同。例如EcoRI比PstI對甘油濃度更敏感，而后者則對高pH值更敏感一些(2)。第40頁/共169頁以下酶類易出現(xiàn)“星號活性”，它們是以上因素的影響程度因酶的不盡量用較少的酶進行完全消化反應(yīng)。這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度。盡量避免有機溶劑（如制備DNA時引入的乙醇）的污染。將離子濃度提高到100-150mM（若酶活性不受離子強度影響）。將反應(yīng)緩沖液的pH值降到7.0。二價離子用Mg++。

抑制星號活性的方法第41頁/共169頁盡量用較少的酶進行完全消化反應(yīng)。這樣可以避免過度消化以及過高在離它的不對稱識別位點一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。（8）Ⅱs型限制性內(nèi)切酶移動切割（shiftedcleavage):GACGCNNNNN?

HgaICTGCGNNNNNNNNNN?5’3’第42頁/共169頁在離它的不對稱識別位點一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。（8）3.III類限制性內(nèi)切酶在完全肯定的位點切割DNA，但反應(yīng)需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG第43頁/共169頁3.III類限制性內(nèi)切酶在完全肯定的位點切割DNA，但反III類限制-修飾酶由R亞基和MS亞基組成，其中MS亞基具有位點識別和甲基化修飾雙重活性。該類酶與DNA識別位點的結(jié)合嚴格依賴ATP，在與識別位點結(jié)合之后，修飾作用與限制作用取決于兩個亞基之間的競爭。修飾作用在識別位點內(nèi)進行，甲基化受體是腺嘌呤堿基，供體仍為SAM。切割位點位于識別位點一側(cè)的若干堿基對處，但無序列特異性，只與識別位點的距離有關(guān)，而且不同的III類酶具有各自不同的距離，從7至26bp不等。第44頁/共169頁III類限制-修飾酶由R亞基和MS亞基組成，其中MS亞基具有第45頁/共169頁第45頁/共169頁五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素

1、底物DNA1)DNA的純度DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。

RNA與E結(jié)合影響有效酶濃度；RNA影響(干擾)電泳區(qū)帶。

2)DNA濃度〔DNA〕過大，會抑制酶活(影響酶分子擴散)。第46頁/共169頁五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1、底物DNA1

如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl在37℃下15h

而1μgDNA/1UHPaⅠ50μl在37℃下1h3）識別位點及鄰近位點特異性序列

由于切點鄰近序列不同，水解速度不同。如：①λDNA有5個ECORI切點，其中兩個相差10倍。②pBR322DNA有4個NarⅠ切點(GGCGCC)其中2個切點用1U酶水解1h完全切開,2個切點用50U酶水解16h水解不完全。③XmaⅢ切點是CGGCCG，但在GGCGGCCGCC時不切割第47頁/共169頁如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl在374)DNA二級/三級結(jié)構(gòu)

超螺旋DNA(病毒或質(zhì)粒)比線狀DNA需更多酶。5)提取時混入雜質(zhì)可改變識別特異性

如：高濃度Hg2+、酚，氯仿、乙醇、EDTASDS、NaCl等。第48頁/共169頁4)DNA二級/三級結(jié)構(gòu)超螺旋DNA(病毒或質(zhì)大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。第49頁/共169頁大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2.DNA的甲基化程度不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。504525BanIMaeISmaI306055ApyIBstEIIMaeIII30505065ApaIBclIMaeIITaqI最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶3.溫度第50頁/共169頁不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)（1）緩沖液的化學(xué)組成金屬離子①如Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如HindⅢ，ECORI）則特異性改變。②離子濃度，合適→激發(fā)酶活；不合適→抑制酶活。

牛血清蛋白(BSA)第51頁/共169頁是影響限制酶活性的重要因素。4.緩沖液(Buffer)MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；BSA是酶穩(wěn)定劑，機制：減少蛋白酶及非特異性吸附作用。避免熱、表面張力、化學(xué)品導(dǎo)致的酶變性。過量BSA會引起電泳拖尾?？赏ㄟ^加SDS/65℃/5min除去。

水無離子水，ddH2O，雙蒸水。無菌、無污染、配成核心緩沖液，即幾種酶的相近buffer商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。第52頁/共169頁MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強度六、限制性內(nèi)切酶對DNA的消化1.內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模式1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。GAATTCCTTAAG第53頁/共169頁六、限制性內(nèi)切酶對DNA的消化1.內(nèi)切酶與識別序列的結(jié)合模內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。2.完全消化12341234第54頁/共169頁內(nèi)切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。2.完全消化只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。3.局部消化123414第55頁/共169頁只有有限數(shù)量的酶切位點被切開。通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活。或用乙醇沉淀DNA。4.限制酶酶切反應(yīng)的終止5.幾種常用限制酶識別位點第56頁/共169頁大多數(shù)酶可用65oC溫育5分鐘失活。4.限制酶酶切反應(yīng)的第57頁/共169頁第57頁/共169頁要做定向克隆，通常要作雙酶切。同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。酶切所用的緩沖液可以從各公司的酶活性圖表中選擇。6.雙酶切第58頁/共169頁要做定向克隆，通常要作雙酶切。同步雙酶切是一種省時省力的常用第59頁/共169頁第59頁/共169頁雙酶切注意事項

選活性至少都在80％以上的buffer

注意反應(yīng)溫度

1）溫度一致時可同時進行

2）溫度不一致時，先切溫度低的，再切溫度高的如果找不到同時適合兩種酶的緩沖液，可以按兩種酶的條件按順序進行酶切反應(yīng)。先用需要在低鹽條件下反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶來切割，然后提高鹽濃度以完成第二次切割。最好先切一個，回收后再切另一個.第60頁/共169頁雙酶切注意事項選活性至少都在80％以上的buffer第60由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液中進行雙酶切反應(yīng)時，反應(yīng)速度會減緩，因此需要增加酶量或延長酶切時間來提高酶切速率。第61頁/共169頁第61頁/共169頁從細菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口。第62頁/共169頁從細菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接DNA連接酶舊稱“合成酶”。是1967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的，最初發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5‘-PO4與另一DNA鏈的3’-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。第63頁/共169頁DNA連接酶舊稱“合成酶”。第63頁/共169頁（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。分子量74000dal,輔因子NAD+,其作用是封閉雙螺旋骨架上具有5‘-磷酰基和3’-羥基的缺口，形成磷酸二酯鍵。二、DNAligase的特點（2）T4噬菌體的連接酶T4DNA連接酶來自于T4噬菌體感染的E.coli，為T4噬菌體自身的表達產(chǎn)物。分子量6.8萬dal，輔因子位ATP，該酶既能連接粘性末端，亦能連接齊平末端。第64頁/共169頁（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個磷酸基團（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件第65頁/共169頁（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、連接反應(yīng)的機理2.ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。3.AMP與連接酶的賴氨酸e-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi第66頁/共169頁1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、連接反應(yīng)的機理4.AMP隨后從連接酶的賴氨酸e-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP第67頁/共169頁4.AMP隨后從連接酶的賴氨酸e-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5.3‘-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。第68頁/共169頁5.3‘-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出A

用DNA連接酶，可催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組分子。具體做法是，在體外將具有粘性末端的DNA限制片斷，插入到適當載體分子上，再用DNA連接酶連接，從而可以按照人們的意圖構(gòu)建出新的DNA雜種分子。粘性末端DNA片段的連接（連接酶的作用）

第69頁/共169頁用DNA連接酶，可催化外源DNA和載體分子之同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG第70頁/共169頁同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'5'GAATTCCTTA用粘性末端構(gòu)建重組體DNA的最主要缺點：1、無法控制外源基因的插入方向；2、由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應(yīng)混合物中會發(fā)生自我環(huán)化作用，經(jīng)連接酶作用，形成共價閉環(huán)的穩(wěn)定環(huán)形結(jié)構(gòu)。克服該缺點的方法是，用堿性磷酸酶預(yù)先處理線性的載體DNA分子，以移去末端的5‘磷酸基團，于是在連接反應(yīng)中，它自身的兩個末端之間就再也不能被連接酶共價連接起來了。第71頁/共169頁用粘性末端構(gòu)建重組體DNA的最主要缺點：第71頁/共169頁第72頁/共169頁第72頁/共169頁1、同聚物加尾法

是由美國斯坦福大學(xué)的P.Labban和D.Kaiser1972年發(fā)展起來的，可以連接任何兩段DNA分子的普遍性方法。原理：利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能，將同種核苷酸（dNTP)加到DNA分子單鏈延伸末端的3‘-OH上。如果在目的基因兩側(cè)加polydA，則在載體兩側(cè)加polydT。長度一般10~40個殘基。

平末端DNA片段的連接

第73頁/共169頁1、同聚物加尾法平末端DNA片段的連接

第73頁/共169頁同聚物加尾法優(yōu)點:1)首先不易自身環(huán)化.2)因為載體和外源片段的末端是互補的黏性末端，所以連接效率較高.3)用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進行連接.缺點：1)插入的片段難以回收。2)無法控制外源基因插入方向。3)用任何一種方法制備的DNA都可以用這種方法進行連接.第74頁/共169頁同聚物加尾法優(yōu)點:1)首先不易自身環(huán)化.2)因為載體和外人工粘性末端的連接

平頭末端C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGC3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG第75頁/共169頁人工粘性末端的連接平頭末端C3'GG5'G3人工粘性末端的連接

3‘突出末端CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI第76頁/共169頁人工粘性末端的連接3‘突出末端CTGCA3'GG人工粘性末端的連接

5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow補平Klenow補平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火B(yǎng)amHIBamHIEcoRIBamHI第77頁/共169頁人工粘性末端的連接5‘突出末端5'GCCTAGGATC銜接物（linker)連接法所謂銜接物是指用化學(xué)方法合成的一段由10~12個核苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸段片斷。將銜接物的5‘末端和待克隆的DNA片段的5’末端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后通過T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來，接著用適當?shù)南拗泼赶咩暯游锏腄NA分子和載體分子，由此使兩者都產(chǎn)生出彼此互補的粘性末端。優(yōu)點：克隆后還可回收原插入片斷。第78頁/共169頁銜接物（linker)連接法第78頁/共169頁第79頁/共169頁第79頁/共169頁第80頁/共169頁第80頁/共169頁DNA銜接物連接法盡管有諸多優(yōu)點，但明顯的缺點是，如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部也含有與所加的銜接物相同的限制位點，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把所克隆的基因切成不同的片段，從而對后繼的亞克隆及其他操作造成麻煩。第81頁/共169頁DNA銜接物連接法盡管有諸多優(yōu)點，但明顯的缺DNA接頭(adaptor)連接法DNA接頭是由美國康奈爾大學(xué)吳瑞博士于1977年發(fā)明的，它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連接后，便會使后者成為具有粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。問題：各個DNA接頭分子的粘性末端之間，會通過互補堿基間的配對作用，形成如同DNA銜接物一樣的二聚體分子，失去接頭的本來意義?？朔姆椒ㄊ菍?‘末端的磷酸修飾移去，其結(jié)果為暴露出的5’-OH所取代。如此一來，雖然兩個接頭分子粘性末端之間仍具有互補堿基配對的能力，但終因DNA連接酶無法在5‘-OH和3’–OH之間形成磷酸二酯鍵而不會產(chǎn)生出穩(wěn)定的二聚體分子。第82頁/共169頁DNA接頭(adaptor)連接法第82頁/共169頁第83頁/共169頁第83頁/共169頁第84頁/共169頁第84頁/共169頁連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37°C。四、連接反應(yīng)的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2.實用溫度所以一般采用4~16°C。第85頁/共169頁連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37°C。四、連接反應(yīng)的溫度1.最佳增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。1.插入片段與載體的濃度比例2.反應(yīng)溫度五、影響連接反應(yīng)的因素10~20倍。一般14~16℃第86頁/共169頁增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。1.第三節(jié)DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(全酶)(E.coli)Klenowfragment(E.coli)T４DNA聚合酶(T４Phage感染的E.coli)T７DNA聚合酶(T７Phage感染的E.coli)修飾的T７DNA聚合酶(測序酶)DNA末端轉(zhuǎn)移酶(小牛胸腺)反轉(zhuǎn)錄酶(依賴RNA)聚合酶第87頁/共169頁第三節(jié)DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶DNA1.共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。第88頁/共169頁1.共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.高快有無TaqDNA聚合酶中低無無逆轉(zhuǎn)錄酶高快無無遺傳修飾T7DNA聚合酶高快無高T7DNA聚合酶低中無高T4DNA聚合酶低中無低Klenowfragment低中有低大腸桿菌DNA聚合酶持續(xù)能力聚合速率5’?3’外切酶活性3’?5’外切酶活性DNA聚合酶3.常用DNA聚合酶的特性比較第89頁/共169頁高快有無TaqDNA聚合酶中低無無逆轉(zhuǎn)錄酶高快無無遺傳修飾三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I主要用來制備帶放射性標記的DNA探針。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)①一條單鏈多肽。②5’?3’外切酶活性位于N端。③用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5’?3’外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。第90頁/共169頁三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③帶有3’—OH游離端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反應(yīng)條件-OH5’3’dNTPs第91頁/共169頁①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP標記①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補的待測序列雜交第92頁/共169頁標記①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異標記已知序列的核酸片斷②探針的標記方式標記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5’3’第93頁/共169頁標記已知序列的核酸片斷②探針的標記方式標記已知序列的核酸片③DNA聚合酶I對探針序列的標記切口轉(zhuǎn)移法(nicktranslation)：放射性同位素標記：DNA聚合酶I同時具備5’?3’外切酶活性和5’?3’的聚合酶活性（以及3’?5’外切酶活性）。第94頁/共169頁③DNA聚合酶I對探針序列的標記切口轉(zhuǎn)移法(nickt5’?3’外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5’端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在切口的上一段DNA的3’一側(cè)補上一個新的核苷酸。切口切口5’5’3’3’5’3’5’3’第95頁/共169頁5’?3’外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5’端除去一個純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈切口DNAPolI進行切口轉(zhuǎn)移一種a-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標記8第96頁/共169頁純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈切口DNAPol缺口平移法快速、簡便、成本相對較低、比活性較高、標記均一。主要利用了DNA聚合酶Ⅰ修復(fù)DNA的功能，用于大分子DNA標記（＞1000bp最好）；缺點：單鏈DNA、RNA不能用該法標記。第97頁/共169頁缺口平移法快速、簡便、成本相對較低、比活性較高、標記均一。主2.Klenowfragment(DNA聚合酶I大片段)

具有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性。（失去了5’?3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)第98頁/共169頁2.Klenowfragment(DNA聚合酶I大片段C端76，000dKlenow活性５′→３′聚合３′→5′外切＋N端36，0005′→３′外切Jacobsen(1974),Joyce和Grindley,(1983)克隆此大片段。DNAPolI枯草桿菌蛋白酶第99頁/共169頁C端＋N端Jacobsen(1974),Joyce①3’端補平5’5’klenow②DNA3’末端標記補平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標記的dNTP。klenow（2）主要用途第100頁/共169頁①3’端補平5’5’klenow②DNA3’末端標記補3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補平根據(jù)末端的順序選擇一種a-32P-dNTPs末端標記的DNA限制性內(nèi)切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHIa-32P-dATPa-32P-dGTP25oC1h第101頁/共169頁3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補平根③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物第102頁/共169頁③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,產(chǎn)物平均長度為400-600個核苷酸。④隨機引物法標探針第103頁/共169頁隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合,在Kl優(yōu)點：(1)Klenow片段沒有5‘→3’外切酶活性,反應(yīng)穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。(2)反應(yīng)時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進行反應(yīng)。(3)反應(yīng)產(chǎn)物的比活性較高,可達4×109cpm/μg探針缺點：不能標記環(huán)狀DNA第104頁/共169頁優(yōu)點：(1)Klenow片段沒有5‘→3’外切酶活性,反應(yīng)穩(wěn)純化的DNA片斷加熱變性klenow進行5’-3’聚合反應(yīng)隨機引物，一種a-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP第105頁/共169頁純化的DNA片斷加熱變性klenow進行5’-3’聚合反應(yīng)隨（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)3.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性（降解單鏈更快）。①來源②酶活性第106頁/共169頁（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)3.T4DNA聚合酶從T③特點當沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使3’?5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。第107頁/共169頁③特點當沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使3’?5’外切5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’第108頁/共169頁5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTP（2）T4DNA聚合酶的用途標記末端（取代合成法）用3’?5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’?3’聚合酶活性補平，并加入放射性標記的dNTP。①補平隱蔽末端②DNA3’末端標記第109頁/共169頁（2）T4DNA聚合酶的用途標記末端（取代合成法）用3’酶切中間產(chǎn)生兩個末端標記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’?5’外切）DNA酶切片斷T4DNA聚合酶（5’?3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’內(nèi)切酶切無dNTPs第110頁/共169頁酶切中間產(chǎn)生兩個末端標記加入某種32P-dNTP和dNTPs4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基：有5’?3’聚合酶和3’?5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：

硫氧還蛋白。增加大亞基對模板的親和性。第111頁/共169頁4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細（2）T7DNA聚合酶的特點①持續(xù)合成能力強一旦與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補鏈。②3’?5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙第112頁/共169頁（2）T7DNA聚合酶的特點①持續(xù)合成能力強一旦與模板結(jié)②進行末端標記①以大分子量DNA為模板的合成如M13③補平隱蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法標記3’末端。與T4DNA聚合酶相同。合成補平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。第113頁/共169頁②進行末端標記①以大分子量DNA為模板的合成如M13③5.修飾的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾去除3’?5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7DNA聚合酶的用途①DNA測序雙脫氧法。②標記DNA3’隱蔽末端③更有效地補平末端第114頁/共169頁5.修飾的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學(xué)修來源：是一種只在前淋巴細胞和淋巴細胞分化早期階段中存在的罕見的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。結(jié)構(gòu)：MW=60，000d.活性：①催化dNTP摻入DNA3′-OH末端，形成同聚物末端②反應(yīng)不需模板DNA，需Co2+。用途：①克隆DNA片段時加上互補同聚物末端，便于與載體連接。②末端標記6.末端轉(zhuǎn)移酶(不依賴模板的DNA聚合酶)第115頁/共169頁來源：是一種只在前淋巴細胞和淋巴細胞分化早期階段中存在的罕見商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種①來自禽類成髓細胞瘤病毒(AMV)。②來自鼠類白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶。7.逆轉(zhuǎn)錄酶依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。（1）來源第116頁/共169頁商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種①來自禽類成髓細胞瘤病毒(AMV)。②來自酶類別肽鏈5’-3’聚合活性RNaseHAMV2條：α：62000β：94000有強MMLV1條84000有弱RNaseH：以5’?3’或3’?5’方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。第117頁/共169頁酶類別肽鏈5’-3’聚合活性RNaseHAMV2條：有強MM合成長cDNAM-MLV優(yōu)于AMV.RNaseHRNADNARNADNA第118頁/共169頁合成長cDNAM-MLV優(yōu)于AMV.RNaseHRNARN（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途①合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結(jié)合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA第119頁/共169頁（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途①合成cDNA以oligodT為引物

核酸探針是指帶有標記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測核酸樣品中特定基因序列的檢測。核酸探針(Nucleicacidprobe)第120頁/共169頁核酸探針是指帶有標記物的已知序列的核酸片段，它能和與其1).按來源及性質(zhì)劃分

可將核酸探針分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類。

較常使用的是基因組DNA探針和cDNA探針。

2).按標記物劃分

有放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類。1.核酸探針的種類第121頁/共169頁1).按來源及性質(zhì)劃分1.核酸探針的種類第121頁/共1放射性標記探針用放射性同位素做為標記物。常用的同位素32P、3H、35S。其中，以32P應(yīng)用最普遍。1.放射性標記探針優(yōu)點：靈敏度高，可以檢測到pg級。

放射自顯影效果好。缺點：半衰期短（32P只有14.3天）不易保存、對人體有害。要求在專門實驗室操作。第122頁/共169頁放射性標記探針用放射性同位素做為標記物。1.放射性標記探針2.非放射性標記探針i）生物素標記：生物素（biotin），又稱維生素H、輔酶R可以與dNTP?；Y(jié)合成為生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素連接酶（biotinligase）催化與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。第123頁/共169頁2.非放射性標記探針i）生物素標記：生物素（biotin）純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進行缺口轉(zhuǎn)移生物素-dTTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口轉(zhuǎn)移法將生物素摻入DNA探針中第124頁/共169頁純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPol光敏生物素標記生物素連接臂光敏基團探針序列探針序列生物素連接臂光敏基團+光照第125頁/共169頁光敏生物素標記生物素連接臂光敏基團探針序列探針序列生物素連接在強光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團即可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標記效率不高，每100～150個堿基才能標記一個生物素，對于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標記數(shù)過少而影響靈敏度（Forsteretal1985）。第126頁/共169頁在強光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團即可與核酸中的堿基抗生物素蛋白（avidin）：鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素的識別——親和素：是一種雞卵清蛋白。細菌中avidin的類似物。能與生物素特異結(jié)合的蛋白或抗體，常用：第127頁/共169頁抗生物素蛋白（avidin）：鏈霉抗生物素蛋白（streptii）地高辛標記：可以與dNTP連接成地高辛-dUTP等，參入DNA合成過程。形成地高辛標記的DNA探針。生物素和地高辛標記的探針都有商品化的試劑盒(kit)。地高辛的結(jié)合物是抗地高辛抗體。第128頁/共169頁ii）地高辛標記：可以與dNTP連接成地高辛-dUTP等，參iii）偶聯(lián)酶及其底物常用的兩種酶：辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過程中發(fā)出熒光（或生成有色的產(chǎn)物）。酶的作用：第129頁/共169頁iii）偶聯(lián)酶及其底物常用的兩種酶：辣根過氧化物酶催化一些特HRPO和AP的顯色反應(yīng)底物第130頁/共169頁HRPO和AP的顯色反應(yīng)底物第130頁/共169頁堿性磷酸酶催化發(fā)光反應(yīng)機理金剛烷第131頁/共169頁堿性磷酸酶催化發(fā)光反應(yīng)機理金剛烷第131頁/共169頁iv）用非放射性標記的探針檢測原理生物素探針序列待測基因親和素酶底物中間產(chǎn)物產(chǎn)物發(fā)光探針DNA用生物素或地高辛標記。親和素或地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個發(fā)光或顯色反應(yīng)。親和素或地高辛抗體與生物素或地高辛結(jié)合。第132頁/共169頁iv）用非放射性標記的探針檢測原理生物素探針序列待測基因親和第133頁/共169頁第133頁/共169頁一、T4多核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細胞中分離出來。多種哺乳動物細胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2.功能催化g磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。不論5’-OH端突出與否。第四節(jié)DNA修飾酶第134頁/共169頁一、T4多核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的pseT基因編碼。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的g磷酸帶有32P標記，就會被轉(zhuǎn)移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。第135頁/共169頁5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’33.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標記DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(g-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’堿性磷酸酶（1）正向反應(yīng)（forwardreaction）第136頁/共169頁3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標記DN（2）交換反應(yīng)標記法反應(yīng)混合物中具有超量(g-32P)ATP和ADP時，多核苷酸激酶能催化(g-32P)ATP的g-32P與DNA5’端的磷酸交換。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(g-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應(yīng)效果不理想。第137頁/共169頁（2）交換反應(yīng)標記法反應(yīng)混合物中具有超量(g-32P)ATP

二、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。第138頁/共169頁二、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。2.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH堿性磷酸酶3.堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體份子自我連接第139頁/共169頁2.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶5’5’5’第140頁/共169頁單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTHindA-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能與脫磷酸的載體3’OH連接。第141頁/共169頁A-OHHO-AGCTTOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不aATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個nick，但轉(zhuǎn)入細菌后會被修復(fù)。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA第142頁/共169頁aAAGCTTAGCTTAATTCGA連接酶-OH與-OH連第五節(jié)RNA聚合酶1.RNA聚合酶①T7、T3RNA聚合酶在E.coli中的克隆表達。②T7、T3、RNA聚合酶在酵母中的克隆表達。③E.coliRNA聚合酶。2.酶活DNA指導(dǎo)下的RNA合成，結(jié)合于啟動子部位。轉(zhuǎn)錄無意義鏈(一)產(chǎn)生與有意義鏈相似(以U代替模板中T)的鏈。商品酶為:第143頁/共169頁第五節(jié)RNA聚合酶1.RNA聚合酶①T7、T32、多聚(A)聚合酶(E.coli)結(jié)構(gòu)：MW=58000，一條多肽鏈?；钚裕捍呋疪NA3′末端加AMP。用途：①在RNA3′末端加Poly(A)，以合成cDNA(Gethin等.1980)。②用32PATP標記RNA3′末端。第144頁/共169頁2、多聚(A)聚合酶(E.coli)結(jié)構(gòu)：MW=58000，3、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶(Guanylytransferase)來源：牛痘病毒。活性：催化GTP轉(zhuǎn)移GMP至5’PPP－—RNA的5′末端。5’PPP-RNA+GTP或5’PP――RNA。ppiG5’PPP5’N――RNA用途：體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物加帽。第145頁/共169頁3、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶(Guanylytransferase)來源第六節(jié)核酸外切酶（Exonucleases）是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解核苷酸的酶。一、單鏈DNA外切酶1.大腸桿菌核酸外切酶I（exoI）5’?3’外切識別5’-OH2.大腸桿菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’?3’、3’?5’外切識別3’-OH、5’-P第146頁/共169頁第六節(jié)核酸外切酶（Exonucleases）是一類從二、雙鏈DNA外切酶1.核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’?5’外切識別3’-OH主要用途：在DNA雙鏈的末端產(chǎn)生出單鏈區(qū)域。5’5’5’