在基因水平診斷疾病課件

GeneDiagnosisfanh@1nucleusGeneDiagnosis

transcriptiontranslationFourtypesofdiagnosisClinicalmanifestationBiologicalDiagnosis

SerumDiagnosis

ClinicalDiagnosis

基因診斷的基本概念nucleusGeneDiagnosis

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SerumDiagnosis

ClinicalDiagnosis

定義：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),

在DNA或RNA水平，通過檢測(cè)致病基因（內(nèi)源或外源）的存在、基因結(jié)構(gòu)缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法。2第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)

一、概念

與傳統(tǒng)診斷的區(qū)別：直接以病理基因（致病基因、疾病相關(guān)基因和外源性病原生物基因等）為分析對(duì)象，即對(duì)待診生物材料某一（些）特定基因進(jìn)行分析判斷。3基因診斷的特點(diǎn)

1．屬于“病因診斷”，針對(duì)性和特異性強(qiáng)。

2．特異性和靈敏度高，微量標(biāo)本即可進(jìn)行診斷。

3．檢測(cè)標(biāo)本適應(yīng)性廣。

4．診斷感染性疾病早期、快速第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)4DNA或RNA水平變化：相關(guān)基因序列的有無受累基因表達(dá)的高低病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有癌基因表達(dá)水平從低到高等；基因結(jié)構(gòu)變化即突變：點(diǎn)突變引起基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活。第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)目標(biāo)序列的識(shí)別和定性定量分析是基因診斷的基礎(chǔ)51.DirectlyDetection:knownabnormalgenedotmutationdeletioninsertion

2.IndirectlyDetection:unknownabnormalgeneDNAmarker

DNApolymorphismLinkageanalysisGeneDiagnosis6核酸分子雜交和PCR擴(kuò)增是基因診斷的基本技術(shù)核酸分子雜交可進(jìn)行基因的特異的特異識(shí)別和分析。PCR可進(jìn)行已知序列或已知部分序列基因的檢測(cè)。二、基因診斷的常用技術(shù)第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)7第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)二、基因診斷的常用技術(shù)（一）核酸雜交81.制備合適的探針是核酸雜交用于基因診斷的關(guān)鍵

Whatisaprobe?

標(biāo)記的已知序列核酸片段，包括DNA,cDNA,RNA,Oligonucleotide第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)二、基因診斷的常用技術(shù)

針對(duì)具體情況選擇合適的探針序列是基因診斷準(zhǔn)確、特異、簡便、可靠的基礎(chǔ)。（一）核酸雜交91.制備合適的探針選擇探針的原則：致病微生物核酸中最保守、最特異的序列突變基因中含突變位點(diǎn)或突變區(qū)的序列待測(cè)基因編碼的mRNA序列等第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)二、基因診斷的常用技術(shù)

針對(duì)具體情況選擇合適的探針序列是基因診斷準(zhǔn)確、特異、簡便、可靠的基礎(chǔ)。102.不同形式的核酸分子雜交

Southernblot

Northernblot

dothybridization

reversedothybridizationFISH:fluorescenceinsituhybridization第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)二、基因診斷的常用技術(shù)11SouthernblotNorthernblotDotblotInsituhybridization檢測(cè)對(duì)象DNARNADNA/RNADNA/RNA優(yōu)點(diǎn)特異DNA片段，測(cè)定分子量基因突變分析定性、定量分析定性、定量分析定位定性定量缺點(diǎn)不能定量不能定位不能確定分子量，特異性不好2.不同形式的核酸分子雜交12第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)二、基因診斷的常用技術(shù)（二）PCR技術(shù)是基因診斷的一種基礎(chǔ)技術(shù)。

PCR在基因診斷中的作用從極少樣品即可擴(kuò)增出肉眼可見的產(chǎn)物。放大待診信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度

13

為適應(yīng)DNA診斷的需要，除上述常規(guī)PCR外，又逐步發(fā)展了不同目的特殊類型的PCR技術(shù)：（1）

長片段PCR（longfragmentPCR）（2）

錨定PCR（anchoredPCR）（3）

嵌套式PCR（nestingPCR）（4）

多重PCR（multiplexPCR）（5）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）（6）

不對(duì)稱PCR（asymmertricPCR）（7）

反向PCR（inversePCR）（8）

原位PCR（insituPCR）（9）

定量PCR（quantitativePCR）

(10)逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)14（二）

PCR技術(shù)

PCR及其衍生技術(shù)直接運(yùn)用PCR擴(kuò)增：異常缺失與存在PCR產(chǎn)物的限制性酶譜分析（PCR-RE)和限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP)RFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphism

15（二）

PCR技術(shù)

PCR及其衍生技術(shù)

PCR－RFLP：通過PCR將包含待測(cè)位點(diǎn)的DNA片段擴(kuò)增后，用識(shí)別相應(yīng)位點(diǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶水解，根據(jù)所產(chǎn)生限制性片段的數(shù)量和長度作出診斷。用于已知突變位點(diǎn)的驗(yàn)證性診斷

16（二）

PCR技術(shù)

PCR及其衍生技術(shù)3.PCR-等位基因特異性寡核苷酸探針斑點(diǎn)雜交(PCR-ASO，PCR-DB)

ASO:AlleleSpecificOligonucleotide1).wildprobevsmutantprobe2).已知突變的驗(yàn)證性檢測(cè)

3).可區(qū)分純合子和雜合子

17

PCR及其衍生技術(shù)4.PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR-SSCP)

將PCR產(chǎn)物變性為單鏈后進(jìn)行非變性（中性）聚丙烯酰胺凝膠電泳，單個(gè)核苷酸的改變即可造成DNA單鏈構(gòu)象的改變，進(jìn)而導(dǎo)致電泳速率變化，從而檢測(cè)出基因突變。1）單鏈核酸堿基-構(gòu)象-電泳速率2）中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

（二）

PCR技術(shù)18PCR-SSCP分析原理示意19

PCR及其衍生技術(shù)

5.PCR-變性梯度凝膠電泳分析（PCR-DGGE）DenaturingGradientGelElectrophoresis（二）

PCR技術(shù)20

PCR及其衍生技術(shù)7.甲基化特異性PCR

MethylationspecificPCR,MS-PCR模板甲基化處理：Na2SO3C-U需設(shè)計(jì)特異性甲基化引物G:C/A:U（二）

PCR技術(shù)21

3’GGACGTAGA5’非甲基化引物5’---CCTGCATCT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------CGCGATCCG---5’5’GCGCATGGC3’

3’AAACATAAA5’甲基化引物5’---UUTGUATUT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------AUGUGATUU---5’5’TACACATAA3’223’GGACGTAGA5’5’---CCTGCmATCT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------CGCGATCmCmG---5’5’GCGCATGGC3’3’AAACATAAA5’5’---UUTGCmATUT-------GCGCTAGGC----3’3’---GGACGTAGA-------UGUGATCmCmG--5’5’ACACATAAC3’若存在甲基化位點(diǎn)

23

PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析

Q-PCR,QuantitativePCR

基本原理：PCR指數(shù)擴(kuò)增規(guī)律

N=N0(1+E）n

（二）

PCR技術(shù)24

PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析

（1）測(cè)定PCR產(chǎn)物量：

梯度（系列）稀釋法：先對(duì)已知量的靶

DNA進(jìn)行梯度稀釋（類似于比色）灰度掃描法

（二）

PCR技術(shù)25

PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析

（2）極限稀釋法基本依據(jù)：PCR擴(kuò)增的有效起始模板分子數(shù)為104～106個(gè)

（二）

PCR技術(shù)26

PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析（3）非競爭性對(duì)照法基本依據(jù)：同時(shí)擴(kuò)增靶序列和內(nèi)標(biāo)序列（擴(kuò)增效率相似）如看家基因（housekeeper)用于RT-PCR進(jìn)行表達(dá)分析

（二）

PCR技術(shù)27

PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析

（4）競爭抑制法需制備標(biāo)準(zhǔn)參照核酸

（二）

PCR技術(shù)28

PCR及其衍生技術(shù)8.靶核酸的定量分析（5）熒光標(biāo)記探針法分析：安全、簡便快捷、多重檢測(cè)

熒光定量PCR

實(shí)時(shí)(realtime)PCR

29（三）DNA序列測(cè)定是最直接、最準(zhǔn)確的基因診斷技術(shù)第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)二、基因診斷的常用技術(shù)30（四）DNA芯片技術(shù)是應(yīng)用前景廣闊的基因診斷技術(shù)（DNAchips)第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)二、基因診斷的常用技術(shù)生物芯片（biochip&bioarray)技術(shù)：根據(jù)生物分子間特異性相互作用，將生化分析過程集成于芯片表面，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)等各種生物成分的高通量快速檢測(cè)分析。疾病診斷芯片個(gè)性化用藥芯片31四、基因芯片（genechip）

生物芯片(biochip)

應(yīng)用微電子工業(yè)加工工藝，在玻璃、塑料、硅片等材料上加工出用于生物樣品分離、反應(yīng)或分析的微細(xì)結(jié)構(gòu)。

目前主要有兩大類：

1.生物活性微陣列(bioactivemicroarray)2.基因芯片(genechip),DNA微陣列(DNAmicroarray)

包括多肽、蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)胞等。蛋白質(zhì)芯片可直接從體液中檢測(cè)生物分子（免疫芯片只需少量樣品可一次完成對(duì)成千上萬種抗原或抗體等致病因素或生物樣品的檢測(cè)分析)。為最重要的生物芯片，廣泛用于基因表達(dá)譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、疾病診斷、藥物篩選、基因測(cè)序等。32DNAmicroarray33三.基因診斷有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)高特異性：診斷目標(biāo)高靈敏度：分子生物學(xué)方法結(jié)果穩(wěn)定可靠：核酸的化學(xué)本質(zhì)早期診斷性：分子遺傳學(xué)規(guī)律應(yīng)用廣泛性：疾病與非疾病檢查第一節(jié)基因診斷的基礎(chǔ)34基因診斷技術(shù)途徑：①直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)是否異常的直接診斷途徑；②利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進(jìn)行連鎖分析的間接診斷途徑。第四節(jié)遺傳病的基因診斷35直接診斷：檢測(cè)已知致病基因必要條件①被檢基因的突變類型與疾病發(fā)病有直接的因果關(guān)系：②被檢基因的正常分子結(jié)構(gòu)已被確定；③被檢基因突變位點(diǎn)固定而且已知。第四節(jié)遺傳病的基因診斷36

檢測(cè)是否存在已知的突變。適用于對(duì)發(fā)病具有直接因果關(guān)系的致病基因已明確，對(duì)致病基因的序列結(jié)構(gòu)已完全或部分了解，分子機(jī)制已完全或部分清楚者。

常用方法：

1.限制性酶切片段分析法

適用于基因內(nèi)的較大片段或位于酶切位點(diǎn)上的點(diǎn)突變

2.寡核苷酸探針斑點(diǎn)印跡雜交分析法。適用于檢測(cè)各種點(diǎn)突變，特別是不在酶切位點(diǎn)上的點(diǎn)突變。

（一）基因突變的直接檢測(cè)371、限制性酶切圖譜直接分析法

導(dǎo)致某一限制酶識(shí)別位點(diǎn)移位的大片段缺失或插入，

導(dǎo)致某一限制酶識(shí)別位點(diǎn)喪失或獲得的點(diǎn)突變，均可引起相應(yīng)限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化。分析限制性酶切圖，即可診斷出此類突變。38鐮狀細(xì)胞貧血：b-珠蛋白基因第六密碼子

GAG(Glu)→GTG(Val)MstIICCTNAGGbA

CCTGAGGAG1.15kb0.2

bS

CCTGTGGAG

1.35kb

1.15kb1.35kbbA/

bSbAbS（1）導(dǎo)致某一限制性位點(diǎn)喪失或獲得的點(diǎn)突變39

b-地中海貧血：b-珠蛋白基因3'末端缺失0.6kb||

BgIIIBgIII5.2kb||

BgIIIBgIII4.6kb

HomoHeteroNormal5.2kb4.6kb（2）導(dǎo)致某一限制性位點(diǎn)移位的大片段缺失或插入40

如果特定的限制酶識(shí)別位點(diǎn)周圍的DNA序列已知，即可應(yīng)用PCR簡便地檢測(cè)出這些限制酶識(shí)別位點(diǎn)的存在或丟失以及相應(yīng)限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化，稱為PCR-RFLP分析法。

H-ras基因第12密碼子點(diǎn)突變：GGC-->GTC

CCGGCCCGTC

HpaII

38bp100bpx138bp

411.點(diǎn)突變：（2）無限制性酶切位點(diǎn)改變直接診斷：檢測(cè)已知致病基因

PCR-ASO斑點(diǎn)雜交或反向斑點(diǎn)雜交及等位基因特異PCR（allelespecificPCR，AS-PCR）或稱為等位基因特異性擴(kuò)增（ASA）等技術(shù)。

PCR-ASO斑點(diǎn)雜交或反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)可快速、簡易地檢測(cè)已知突變。

42寡核苷酸探針斑點(diǎn)印跡雜交分析法受檢者基因組DNA或含突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記的ASO探針雜交主要適用于檢測(cè)已知點(diǎn)突變ASO1ASO2NormalHeteroHomo43鐮狀細(xì)胞貧血：

b-珠蛋白基因點(diǎn)突變

GAG(Glu)-->GTG(Val)

bA

probeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC

bSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC

HeterobA

probebSprobeHomoNormal44ASOPKU，ARNormalprobeMutationprobe？45間接診斷：檢測(cè)與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)志DNA多態(tài)性：指群體中的DNA分子存在至少兩種不同的類型，即個(gè)體間同一染色體的相同位置上DNA核苷酸序列存在一定的差異或變異。第四節(jié)遺傳病的基因診斷46多態(tài)性在人群中出現(xiàn)的頻率應(yīng)大于1%（如小于1%常認(rèn)為是異常突變）。在生物進(jìn)化過程中形成的，它本身并不致病或于遺傳病有直接聯(lián)系，故稱為“中性突變”。人類的23對(duì)染色體中，每一條上都帶有許多遺傳多態(tài)性位點(diǎn)，其中一些位點(diǎn)在染色體上的位置與致病基因靠的很近，甚至連鎖在一起遺傳，并且呈孟德爾式遺傳。因此，可利用這一多態(tài)性位點(diǎn)作為遺傳指示標(biāo)記。

第四節(jié)遺傳病的基因診斷47

同一染色體上兩個(gè)或以上基因或位點(diǎn)，位置上互相靠近并且共分離的現(xiàn)象稱為遺傳連鎖。將與致病基因連鎖的某種多態(tài)性標(biāo)志作為遺傳標(biāo)志，在同一個(gè)家系成員中探查是否存在致病基因的方法即為基因連鎖分析法（Linkageanalysis）。

（二）基因連鎖分析48間接診斷：檢測(cè)與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)志三代遺傳標(biāo)志：

1.RFLP2.STR(shorttandemrepeats),

VNTR(variablenumberoftandemrepeats)3.SNP(singlenucleotidepolymorphism)第四節(jié)遺傳病的基因診斷49DNApolymorphismmarksystem:1.RestrictionFragmentLengthPolymorphysm(RFLP)

MostofRFLPsdonotrepresentamutationbutalinkagemark

EcoR1SiteSouthernblot

threedifferentmoleculargenotypespolymorphicsite*(About100,000RFLPsinhumangenome)第四節(jié)遺傳病的基因診斷502.Microsatellitemarkers

VariableNumberofTandemRepeats(VNTRs)

2~4bpShortTandemRepeats(STR)

threedifferentmoleculargenotypespolymorphicsequencesPCRproducts(Atleast650,000RFLPsinhumangenome)第四節(jié)遺傳病的基因診斷51DNA指紋分析用于個(gè)體鑒定

52ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT-ATATGGTAAACCTGAGTTGACTTAGCGTCAT

SNPSNPinsert3.Singlenucleotide

polymorphysms(SNPs)

Singlebase-pairdifferencesbetweenindividualsareprettycommonandeasytofindincontrasttoRFLPsandVNTRs(thereare1,400,000SNPsinhumangenome,about1in1000bp)第四節(jié)遺傳病的基因診斷53第五節(jié)腫瘤的基因診斷腫瘤基因診斷的內(nèi)容基礎(chǔ)：腫瘤發(fā)病分子機(jī)制深入探索臨床：早期及預(yù)警診斷易感性評(píng)估及監(jiān)測(cè)腫瘤的鑒別、分級(jí)、分期及預(yù)后輔助治療方案確定療效監(jiān)測(cè)及評(píng)估54

95%慢性髓細(xì)胞性白血病患者存在異常的Ph染色體，其成因是染色體易位使9號(hào)染色體上的原癌基因abl易位至22號(hào)染色體的bcr基因附近，產(chǎn)生bcr-abl融合基因； 幾乎100%急性早幼粒性白血病，表現(xiàn)為15號(hào)染色體上的PML基因與17號(hào)染色體上的維甲酸受體（RARa）基因連接，形成

PML-RARa融合基因。融合基因檢測(cè)方法：一般采用PCR技術(shù)

例如,用分別位于bcr和abl基因的一對(duì)特異引物作PCR，只有當(dāng)abl基因易位至bcr基因附近時(shí)才能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。策略一：易位染色體和融合基因檢測(cè)55Ph1染色體酪氨酸蛋白激酶活性56第五節(jié)腫瘤的基因診斷策略二：癌基因和抑癌基因檢測(cè)

如原癌基因K-ras第12、13和61位密碼子點(diǎn)突變：GGT-TGT/GTT/GAT/GCT；抑癌基因p53密碼子130～290之間的基因突變

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