抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用7課件

第七章抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用抗原抗體的特異性反應(yīng)可以在體內(nèi)進(jìn)行，也可以在體外進(jìn)行。這是血清學(xué)技術(shù)方法的依據(jù)?？贵w反應(yīng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)、甚至生命科學(xué)的范圍，成為一種微量、靈敏、快速的檢測(cè)分析方法。本章介紹的內(nèi)容有：抗體的制備抗原與抗體反應(yīng)原理免疫分析方法第一節(jié)抗體的制備抗血清：用抗原人工免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可以獲得含有抗體的血清，稱為抗血清（antiserum）。多克隆抗體（polyclonalantibody）：多個(gè)抗原決定簇→不同B細(xì)胞→克隆→多種抗體。一、抗血清的制備免疫動(dòng)物抗原：病毒、細(xì)菌、蛋白質(zhì)或半抗原。佐劑及乳化：佐劑是使抗原在注射部位緩慢釋放，增加免疫效果。免疫動(dòng)物：豚鼠、家兔、小鼠、大鼠、羊和馬。兩次注射，初次免疫和再次免疫，間隔3-4周（大動(dòng)物），10-14d（小動(dòng)物）。2.抗血清的純化采血：心臟或動(dòng)脈抗血清的純化：目的：去除血清中其它蛋白質(zhì)的干擾純化方法：硫酸銨鹽析法抗體在30%-50%飽和度白蛋白70%-80%飽和度

25度時(shí)飽和溶液為4.1M，即767克/升。層析法——分子篩層析法，離子交換層析法，親和層析法保存：低溫保存，4℃或-20℃；冷凍干燥保存?？寡宓奶匦澡b定檢測(cè)參數(shù)：效價(jià)、親和力和交叉反應(yīng)檢測(cè)方法:免疫沉淀、ELISA和放射免疫

①效價(jià)（滴度）：在給定的條件下，結(jié)合一定量抗原的抗血清的稀釋度（最大稀釋倍數(shù)）?？寡褰?jīng)一系列稀釋后與一定量的抗原反應(yīng)，以能檢測(cè)抗血清最大稀釋倍數(shù)即為該抗血清的效價(jià)。

效價(jià)是一個(gè)抗體相對(duì)含量的半定量指標(biāo)。二、單克隆抗體（MAb）的制備1.制備原理單克隆抗體：?jiǎn)我环NB細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的一種均一的免疫球蛋白分子。是B細(xì)胞克隆的標(biāo)志，是一種獨(dú)特型抗體，是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的。用B細(xì)胞克隆技術(shù)來(lái)制備。雜交瘤技術(shù)：1975年G.K?hler（科勒）和Milstein（米爾斯坦）創(chuàng)立的。獲得1984年的諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎(jiǎng)。米爾斯坦(C.Milstein)1927~英國(guó)和阿根廷雙重國(guó)籍

科勒(G.Kohler)1946~1995

德國(guó)人2.細(xì)胞來(lái)源及選擇原理B細(xì)胞——Balb/c小鼠脾臟。腫瘤細(xì)胞——誘變得到Balb/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞（次黃嘌呤和胸腺嘧啶缺陷型）。〖名稱〗：BALB/c小鼠1913年，貝格(Bagg)從美國(guó)商人歐希爾(Ohio)處購(gòu)得的白化小鼠原種，以群內(nèi)方法繁殖。麥克·多威爾(MacDowell)在1923年開(kāi)始作近交系培育，至1932年達(dá)26代，命名為BALB/c品系。安德?tīng)栁奶?Andervont)等人使BALB/c廣為傳播和應(yīng)用。1985年我國(guó)從美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）

引進(jìn)到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，為BALB/c第180代。

毛色：白化。

主要用途：廣泛地應(yīng)用于腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、核醫(yī)學(xué)研究，以及單克隆抗體的制備等。③缺陷型骨髓瘤細(xì)胞的特點(diǎn)：是次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤核酸轉(zhuǎn)移酶和胸腺嘧啶激酶的缺陷型在培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）后，能生長(zhǎng)。在培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T），再加入氨基喋呤（A）后，不能生長(zhǎng)。3.細(xì)胞雜交與選擇培養(yǎng)（1）融合：只有脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。（2）陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選抗體活性檢測(cè)方法：常用ELISA和凝集試驗(yàn)。（3）單克隆化克隆化：使許多細(xì)胞克隆混合生長(zhǎng)的細(xì)胞分離為單個(gè)的細(xì)胞克隆的過(guò)程。單克隆化方法：有限稀釋法，一般稀釋至0.8個(gè)細(xì)胞/孔熒光激活細(xì)胞分揀法。1234制備過(guò)程：1.融合2.篩選3.克隆化4.擴(kuò)大生產(chǎn)5.應(yīng)用（1）醫(yī)學(xué)診斷試劑

廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫分析、免疫組化和流式細(xì)胞儀等技術(shù)。①病原微生物抗原、抗體的檢測(cè)；

②腫瘤抗原的檢測(cè)；

③免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)；

④激素測(cè)定；

⑤細(xì)胞因子的測(cè)定。三、基因工程抗體的制備抗體的化學(xué)修飾抗體Fc段+雙功能連接劑+熒光素（同位素、酶、發(fā)光化合物、稀土元素、藥物、毒素等）藥物、毒素等→藥物的定向載體=“生物導(dǎo)彈”意義：診斷試劑；藥物的定向載體2.抗體基因文庫(kù)定義：將不同的重鏈和輕鏈基因隨機(jī)組合，克隆到合適的表達(dá)載體中，在原核細(xì)胞表達(dá)不同的抗體，從這個(gè)抗體庫(kù)中，用抗原可以篩選到相應(yīng)的抗體基因?？贵w基因來(lái)源：雜交瘤細(xì)胞或動(dòng)物B細(xì)胞的DNA和mRNA。載體：線裝噬菌體宿主：大腸桿菌抗體的噬菌體文庫(kù)：抗體以融合蛋白的形式表達(dá)于噬菌體表面?？乖Y選抗體——單克隆抗體優(yōu)點(diǎn):可獲得人源抗體，快速方便獲得單克隆抗體第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)原理一、抗原抗體作用的熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)溶液中抗原抗體的化學(xué)平衡抗原與抗體的結(jié)合是可逆的，以非共價(jià)鍵相連：范德華力、靜電引力、氫鍵和疏水鍵。結(jié)合與解離的強(qiáng)度取決于抗原與抗體的親和力?？乖c抗體結(jié)合的化學(xué)平衡如果以S代表抗體結(jié)合位，以L代表抗原決定簇，以SL代表抗原與抗體的復(fù)合物，則抗原與抗體在溶液中的反應(yīng)如下：復(fù)合物濃度[SL]，抗體結(jié)合位的濃度[S]，抗原決定簇濃度[L]，K+和K-分別為結(jié)合和解離反應(yīng)速度常數(shù)，Ka是平衡常數(shù)。K+K-K-K+Ag+AbAgAb即S+LSL[SL][S][L]K-K+Ka==濃度平衡點(diǎn)[SL][S]或[L]抗原抗體結(jié)合反應(yīng)示意圖時(shí)間二、抗體與多價(jià)抗原結(jié)合的濃度帶現(xiàn)象多價(jià)抗原：一個(gè)大分子抗原有多個(gè)抗原決定簇而成為多價(jià)抗原。單價(jià)抗原：一個(gè)抗原決定簇的抗原?？贵w與單價(jià)抗原形成的復(fù)合物是可溶性的抗體與多價(jià)抗原形成的復(fù)合物大多數(shù)能形成沉淀。沉淀反應(yīng)可用于研究抗體與大分子抗原結(jié)合的特性。沉淀反應(yīng)曲線測(cè)定方法：在一定量的抗體中，逐漸增加抗原濃度，沉淀的形成與抗體的比例密切相關(guān)。曲線分3個(gè)區(qū)：抗體過(guò)量區(qū)（前帶現(xiàn)象）：小分子復(fù)合物，不形成沉淀，。抗原抗體等帶區(qū)：大量沉淀，無(wú)游離的抗原或抗體?？乖^(guò)量區(qū)（后代現(xiàn)象）：沉淀少?？贵w過(guò)量（無(wú)沉淀）抗原抗體適量（有沉淀）抗原過(guò)量（無(wú)沉淀）沉淀的抗體量抗原量抗原抗體反應(yīng)與沉淀形成第三節(jié)常見(jiàn)免疫分析方法免疫分析方法定義：是利用抗原與抗體特異性反應(yīng)的特性對(duì)抗原或抗體進(jìn)行量或質(zhì)的測(cè)定分析。特點(diǎn)：特異、靈敏和快速。例如：?jiǎn)慰寺】贵w檢測(cè)法可測(cè)出蛋白質(zhì)的一個(gè)氨基酸的差異；放射免疫法測(cè)定的量達(dá)到μg甚至ng的水平；免疫沉淀法：反應(yīng)時(shí)間在幾小時(shí)，幾分鐘或更短的時(shí)間。應(yīng)用領(lǐng)域：醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)的幾乎各個(gè)領(lǐng)域，甚至食品科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、分析化學(xué)等。一、免疫沉淀溶液中的環(huán)狀沉淀試驗(yàn)在體外可溶性抗原與相應(yīng)抗體形成肉眼看見(jiàn)的沉淀物。在液相中形成的沉淀不容易觀察判斷，利用抗原和抗體溶液之間的界面形成的沉淀線便于觀察。對(duì)照1:101:201:401:801:160抗血清稀釋度抗原沉淀線抗血清環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)示意圖2.凝膠擴(kuò)散沉淀

抗原抗體在半透明的半固相介質(zhì)中進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn)。抗原分子與抗體分子在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散，相遇形成沉淀。以瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)較為常用。單向免疫擴(kuò)散：抗體混于瓊脂中，小孔中加入抗原，抗原向周圍均勻擴(kuò)散，與抗體形成沉淀環(huán)。可用于定量測(cè)定免疫球蛋白和補(bǔ)體的含量等。雙向免疫擴(kuò)散：抗原和抗體向周圍擴(kuò)散后可在兩孔之間形成白色沉淀線，可用于抗原或抗體的定性檢測(cè)。缺點(diǎn)：時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低。沉淀線形狀的變化顯示抗原間是否存在共同的抗原決定簇。3.免疫電泳火箭電泳：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散與電泳結(jié)合的一種方法。在電場(chǎng)作用下抗原向正極擴(kuò)散，與抗體形成沉淀峰（火箭型沉淀線）。需時(shí)短，能檢測(cè)微量抗原。對(duì)流電泳：在電場(chǎng)作用下抗原與抗體相對(duì)擴(kuò)散，形成沉淀線。對(duì)流電泳較雙擴(kuò)快速和靈敏。二、免疫標(biāo)記免疫標(biāo)記技術(shù)：將已知抗體或抗原標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)（示蹤物），通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物反映有無(wú)抗原抗體反應(yīng)，從而間接測(cè)出微量的抗原或抗體。目前有四種方法：放射免疫分析法：以同位素為示蹤物，為最靈敏、可靠的免疫標(biāo)記技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）免疫熒光技術(shù)親和標(biāo)記的免疫分析標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)1.放射免疫分析法標(biāo)記同位素：125I，131I、3H和35S檢測(cè)方法：液相體系用液體閃爍儀計(jì)數(shù)；固相體系用X射線膠片顯影。直接法與競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)法基本原理

采用定量的標(biāo)記抗原（Ag＋）和非標(biāo)記抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)。放射活性放射活性抗原濃度抗原濃度放射性同位素標(biāo)記分析法示意圖直接法竟?fàn)幏ǚ派湫酝凰貥?biāo)記分析法示意圖2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

(enzymelinkedimmunosorbentassay)(1)定義：抗原與抗體吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原與抗體反應(yīng)后，將固相與液相分離除去游離的抗原或抗體，而結(jié)合的抗原或抗體上被標(biāo)記的酶仍保持活性，催化底物形成有色產(chǎn)物。(2)測(cè)試方法：可目測(cè)或用分光光度計(jì)比色進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。(3)測(cè)試過(guò)程使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗體的形成）

在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)）用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的分離）

加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。（顯色反應(yīng)）酶來(lái)源底物檢測(cè)波長(zhǎng)/nm堿性磷酸酶牛小腸黏膜對(duì)硝基酚磷酸鹽405過(guò)氧化物酶辣根鄰苯二胺/過(guò)氧化氫492β-半乳糖酶大腸桿菌對(duì)硝基酚β-半乳糖405常用標(biāo)記的酶及其底物(4)ELISA技術(shù)類型

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。①雙抗體夾心法(直接夾心法）特點(diǎn)：非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測(cè)適用于分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)所用兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)抗原分子的不同抗原決定簇

②間接法③捕獲法（反向間接法）主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測(cè)定。④直接法

用酶標(biāo)記的抗原或抗體直接檢測(cè)包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原，其量與產(chǎn)物顏色成正比。3、均相酶免疫吸附測(cè)定

基本原理：利用酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原形成復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復(fù)合物與游離酶標(biāo)抗體分離的情況下，直接測(cè)定系統(tǒng)中總的標(biāo)記酶活性的改變，進(jìn)而推算出待檢樣品中的抗原量。

主要用于小分子抗原或半抗原的檢測(cè).酶放大免疫測(cè)定技術(shù):

（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）基本原理:半抗原與酶結(jié)合成酶標(biāo)半抗原，保留半抗原和酶的活性。當(dāng)酶標(biāo)半抗原與抗體結(jié)合后，所標(biāo)的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受影響而活性被抑制。⑤斑點(diǎn)酶免疫試驗(yàn)

(dot-ELISA)3.免疫熒光技術(shù)概念：以熒光素作為示蹤物，通過(guò)熒光顯微鏡觀察進(jìn)行定位檢測(cè)。熒光化合物：異硫氰熒光素、羅丹明熒光素。基本原理

利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待檢抗原特異結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透過(guò)濾色板發(fā)出一定波長(zhǎng)的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來(lái)判斷有無(wú)待檢抗原或抗體。熒光免疫測(cè)定技術(shù)——

時(shí)間分辨熒光免疫分析法原理：稀土銪離子Eu3+螯合物標(biāo)記抗體后，抗體與固相抗原結(jié)合，抗體上的Eu3+在紫外光（340nm）激發(fā)下，與增強(qiáng)液中的β-二酮體重新形成一種微膠體螯合物，發(fā)出長(zhǎng)壽命的高強(qiáng)度熒光（613nm），比未激發(fā)時(shí)增強(qiáng)了100萬(wàn)倍，可用時(shí)間分辯熒光計(jì)記錄。EuEuEuEuEu發(fā)射高強(qiáng)度熒光時(shí)間分辯熒光計(jì)記錄加入增強(qiáng)液紫外光激發(fā)（340nm）時(shí)間分辨熒光免疫分析原理直接法間接法夾心法間接夾心法4.親和標(biāo)記的免疫分析親和標(biāo)記物：金黃色葡萄球菌的A蛋白、生物素（維生素）、地高辛（小分子藥物）原理：金黃色葡萄球菌的A蛋白與IgG的Fc有高度親和力。用酶、同位素和熒光素等標(biāo)記A蛋白，與抗體結(jié)合，可用于抗原抗體反應(yīng)的分析。A蛋白親和標(biāo)記的免疫分析三、免疫定位分析1.免疫熒光定位分析2.酶標(biāo)記免疫定位3.免疫電子顯微鏡技術(shù)1.免疫熒光定位分析用不同發(fā)光顏色的熒光化合物標(biāo)記抗體用于免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)。（熒光化合物+抗體）生物大分子（抗原）在細(xì)胞或組織中的表達(dá)和定位熒光素：異硫氰熒光素、異硫氰四甲基羅丹明熒光顯微鏡觀測(cè)熒光激活細(xì)胞分揀器（流式細(xì)胞儀）應(yīng)用：CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)原理：流式細(xì)胞儀產(chǎn)生分析的電信號(hào)生要是光散射信號(hào)和熒光信號(hào)，流式細(xì)胞儀依據(jù)細(xì)胞流經(jīng)光照射區(qū)時(shí)電壓訊號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)分析和分選細(xì)胞。2.酶標(biāo)記免疫定位抗原（