實(shí)驗(yàn)十 同工酶分析

實(shí)驗(yàn)四同工酶分析同工酶概述酶是以蛋白質(zhì)為主要成分的生物催化劑。在生物體內(nèi)，有一些酶催化相同的反應(yīng)，但其結(jié)構(gòu)不同。它們對底物的濃度、pH、溫度等的最適要求不同，酶活力的調(diào)控反應(yīng)及其所在的細(xì)胞分布也不一樣。把催化相同反應(yīng)而結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的酶的分子類型稱為同工酶（isozyme）。同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同組織起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反應(yīng)，但在其他性質(zhì)方面可以不盡相同。大量研究表明，同工酶在生物界是廣泛存在的。在動植物和微生物體中、同一物種的不同個體、同一個體的不同器官、組織和細(xì)胞、同一細(xì)胞的不同部位、生長發(fā)育的不同階段、不同的代謝條件下，都有不同的同工酶分布。現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的酶中，有一半以上的酶已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有同工酶存在?？梢赃M(jìn)行同工酶分析的酶已有100多種。不同同工酶可以根據(jù)電泳遷移率予以區(qū)別和編號，以向陽極方向泳動最快的編為同工酶1。從分子結(jié)構(gòu)上看，同工酶的形成有以下學(xué)說或原因：（一）亞單位結(jié)構(gòu)學(xué)說亞單位結(jié)構(gòu)學(xué)說是研究同工酶理論并對作用機(jī)理闡述的較為透徹的學(xué)說之一。該學(xué)說認(rèn)為同工酶是由不同亞基按不同方式結(jié)合而成的。這個學(xué)說有廣泛的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。如已經(jīng)證明乳酸脫氫酶（LDH）是由A、B兩個亞基，按不同比例結(jié)合成的四聚體，所以有5種同工酶：LDH]（A4）、LDH2（A3B]）、LDH3（A2B2）、LDH4（A1B3）、LDH5（B4）。（二） 不同基因編碼由不同的基因或等位基因編碼會形成一級結(jié)構(gòu)完全不同或有個別氨基酸殘基不同的多肽鏈。因而產(chǎn)生同工酶。由不同基因引起的同工酶存在于同一物種的所有個體中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族中。（三） 單一亞單位聚合程度不同有些同工酶的亞單位是完全相同的，如膽堿脂酶（ChE），但不同的酶分子中，亞基數(shù)目不同，這就形成分子量不同的5種同工酶。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，目前發(fā)現(xiàn)的100多種同工酶，其組成比例不同，但以單體（26%）、二聚體（52%）、四聚體（20%）較多，三聚體極少。（四） 多肽鏈的續(xù)發(fā)變化多肽鏈合成后的續(xù)發(fā)變化與遺傳因素?zé)o關(guān)。續(xù)發(fā)變化如果只改變部分分子的非活性中心局部結(jié)構(gòu)、組成或?qū)Σ糠址肿佑绊懗潭炔灰?，都回產(chǎn)生不同的同工酶。常見的續(xù)發(fā)改變有脫氨基作用、甲酰或乙?；饔?、巰基氧化、磷酸基團(tuán)相加、部分肽段脫落、多糖或輔酶的增減。（五） 酶空間構(gòu)象的差異組成、結(jié)構(gòu)相同但空間構(gòu)象不同的酶分子，其暴露在分子外表的殘基不同，會導(dǎo)致其理化性質(zhì)上的差異，從而形成不同的同工酶。從以上關(guān)于同工酶形成的來看，除了續(xù)發(fā)改變形成的次生同工酶外，可以說同工酶的差異都是由它們的基因決定的。因此同工酶作為基因表現(xiàn)的標(biāo)記是可靠的。同工酶多型性研究、原級和次級同工酶的鑒別、同工酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究等，必須將不同的同工酶分子分離，區(qū)帶電泳是分離同工酶的最佳方法之一，等電聚焦電泳可將一級結(jié)構(gòu)相同而空間構(gòu)象不同的同工酶分子分離開來，進(jìn)而拓寬了該技術(shù)的使用范圍。通過電泳分離出來的同工酶帶，再采用酶組織化學(xué)技術(shù)染色形成酶譜即可進(jìn)行分析鑒定。顯色的主要方法有以下幾種：（一） 呈色法直接利用酶作用于底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物。如以無色的磷酸酚酞作為底物，經(jīng)酸性磷酸脂酶催化水解脫出酚酞，反應(yīng)系統(tǒng)再改為堿性條件，酚酞即呈紅色，直接標(biāo)出同工酶帶。同理，用蘭色淀粉可測定淀粉同工酶譜，用聯(lián)苯胺可測定過氧化物酶同工酶酶譜。（二） 化學(xué)反應(yīng)顯色法采用不同的化學(xué)試劑使酶促反應(yīng)的產(chǎn)物或尚未分解的底物顯色，借以指示出酶所在的位置和活力大小。如酯酶作用于萘酯，再用堅牢藍(lán)和該酶反應(yīng)產(chǎn)物作用顯示出褐色，標(biāo)出酶的位置。又如用化學(xué)染色劑NBT（硝基四唑氮藍(lán)）照光后可還原成蘭色的甲，而超氧化物歧化酶（SOD）分布區(qū)域抑制了NBT光還原作用，故在蘭色的背景上呈現(xiàn)出清晰的SOD譜帶。前者稱為陽性染色法，后者為陰性染色法。（三） 電子轉(zhuǎn)移染色法應(yīng)用酶將電子轉(zhuǎn)移給染料，通過染料變色顯示出酶的區(qū)帶。此法僅使用于脫氫酶、氧化酶同工酶的染色，如下圖所示：（四） 熒光染色法借助酶促反應(yīng)使無熒光底物變成高熒光的產(chǎn)物或使有熒光的底物轉(zhuǎn)變成熒光熄滅的產(chǎn)物，用熒光儀進(jìn)行檢測。其中又有陽性和陰性染料之分：陽性熒光染料應(yīng)用較廣泛的是4-甲基傘形酮的衍生物。在水解酶催化過程中，在酸性或中性條件下得到的水解產(chǎn)物4-甲基傘形酮，用氨氣熏蒸或用堿性緩沖液將反應(yīng)系統(tǒng)調(diào)成堿性，則出現(xiàn)強(qiáng)烈熒光。該法靈敏度高，但易彌散，必須及時檢測并記錄酶譜。陰性熒光染料是利用還原型NADH和NADPH在紫外線照射下能產(chǎn)生黃色熒光，而氧化態(tài)的NAD+和NADP+不產(chǎn)生熒光的原理，在氧化還原酶作用的底物內(nèi)加入定量的還原態(tài)NADH和NADPH，在紫外燈照射下，有沒存在區(qū)域NADH或NADPH變成氧化態(tài)（NAD+或NADP+），顯示出暗帶或弱熒光譜帶。（五） 偶聯(lián)酶顯色法有些酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物均不能顯色，在反應(yīng)體系中加入特異性的酶，即可使產(chǎn)物顯色。如要分離鑒定己糖激酶同工酶，可偶聯(lián)6-磷酸-葡萄糖脫氫酶催化反應(yīng)，只要檢測脫氫酶的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即可測出己糖激酶的存在。上述顯色后的同工酶譜放置時間過長易退色，必須用照相或光電掃描儀等手段適時記錄。免疫化學(xué)法是分離同工酶的另外一種方法，多基因位點(diǎn)與復(fù)等位基因決定的同工酶間，其氨基酸組成有較大的差異，故有不同的抗原性。利用分離、純化的同工酶，通過免疫學(xué)方法制備出相應(yīng)的抗血清，再加到同工酶混合樣品之中，該抗體即可與相應(yīng)的同工酶抗原形成免疫復(fù)合體沉淀，而將免疫性不同的同工酶留在樣品液中，從而達(dá)到分離的目的。有時可以從沉淀中回收全部酶活力。如肌酸激酶同工酶，只要測出上清夜中殘余酶活力，再從不加抗體樣品中測出總活力，兩者之差即為被沉淀同工酶的活力。采用免疫學(xué)方法鑒定同工酶，由于抗原抗體反應(yīng)特異性強(qiáng)，靈敏度高，可對同工酶進(jìn)行定性、定量分析，但此法僅適用于抗原性差異比較大的同工酶的鑒定。層析法可用于同工酶之間分子量比較接近，表面電荷差異較大的同工酶的分離。最后用一般酶活測定方法分別測定洗脫液中同工酶的活力。利用親和層析鑒定同工酶，依據(jù)同工酶和相應(yīng)的配基（如底物、輔酶、抑制劑、抗體等）親和力不同的原理，將同工酶混合樣品液緩緩流過固相配基層析柱，進(jìn)行親和吸附，然后再選用不同的緩沖液將吸附程度不同的同工酶順次洗脫下來，從而達(dá)到分離的目的。層析法樣品承載量大，操作條件溫和、簡單，更適于純化或制備不同型的同工酶，是研究同工酶結(jié)構(gòu)、功能的重要手段。同工酶技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生理學(xué)、分類學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)及育種學(xué)中。同工酶技術(shù)在遺傳育種中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在種質(zhì)資源的研究、雜交優(yōu)勢的預(yù)測、體細(xì)胞融合雜種的鑒定等方面。（1）按照一個基因編碼一個同工酶亞基的理論，可以從同工酶的表現(xiàn)型變異而直接推測其基因的變異水平。測定酶活力即可反應(yīng)出DNA結(jié)構(gòu)差異，甚至是DNA上一個堿基的微小差異。因此，同工酶分析技術(shù)是研究物種起源、演化及變異程度的最有價值的手段之一。種質(zhì)資源在品種改良中的應(yīng)用，關(guān)鍵在于對收集材料的鑒定研究的程度。對栽培植物和近源野生植物材料同工酶譜進(jìn)行分離和鑒定，依據(jù)同工酶譜相同值大小，直觀而科學(xué)地確定物種親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，演化過程中的變異程度。（2）在雜種優(yōu)勢的預(yù)測中，具有優(yōu)勢的雜種，常出現(xiàn)新的為雙親所不具備的同工酶譜。通過PAGE并染色后會發(fā)現(xiàn)，有優(yōu)勢的雜種一代除出現(xiàn)雙親的酯酶譜型之外，還出現(xiàn)了新的“雜種酶帶”。這種新酶譜在代謝中，具有比親代更高的活性。同工酶分析技術(shù)還可用于遺傳基因定位、遠(yuǎn)緣雜種鑒定、雄性不育等領(lǐng)域。植物生長發(fā)育的不同階段，不同組織、不同器官不僅酶分子表現(xiàn)出階段特異性和組織特異性，同工酶也有同樣的趨勢。種子活力、組織與器官分化、生長及胚胎發(fā)育、環(huán)境因素和植物激素等均可額影響同工酶的變化，使得同工酶技術(shù)在生理學(xué)中也得到了廣泛的應(yīng)用。同工酶技術(shù)還廣泛應(yīng)用于病理診斷和臨床治療中。同工酶是生物體中的天然標(biāo)記物，根據(jù)同工酶的變化，可以反映生物體的感病情況。如在正常人的血清中，乳酸脫氫酶的存在是LDH2>LDH]>LDH3>LDH4>LDH5。若LDH]失常即LDH/LDH?，為急性心肌梗塞、心肌損傷、心肌病及溶血性貧血的征兆；若LDH5>LDH4，多見于肝臟損傷、皮肌炎、肌肉損傷等疾病。同工酶技術(shù)還可作為植物抗病性鑒定和篩選的生化指標(biāo)。當(dāng)病原微生物侵染生物體后，可引起組織內(nèi)的代謝變化，進(jìn)而可誘導(dǎo)產(chǎn)生許多新的同工酶，而且新產(chǎn)生的同工酶帶活性高，病情越重同工酶數(shù)目越多，染色也就越濃。因此同工酶的活性和數(shù)量變化可作為生物抗病性鑒定的生化指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)方法同工酶的提取與一般蛋白質(zhì)提取原則相同，電泳方法同聚丙烯酰胺凝膠電泳，不再陳述。以下介紹幾種同工酶染色方法。酯酶同工酶染色液配制：稱取堅牢藍(lán)RR鹽30毫克，溶于30毫升pH值6.4磷酸緩沖溶液中，過濾后，加2毫升1%a-醋酸萘酯（少許丙酮溶解后，用80%酒精配），1毫升2%B-醋酸萘酯（同上）于濾液中。染色方法：電泳完畢將脫去的凝膠立即轉(zhuǎn)移至染色液中，37°C10—15分鐘，即可呈現(xiàn)出棕紅色的酯酶同工酶譜帶，然后用水漂洗幾次，置于7%醋酸中保存。酯酶的不同同工酶對醋酸-a萘酯和醋酸-B萘酯有不同的親和力，而且這種親和力是穩(wěn)定的，即每次先與醋酸-a萘酯或醋酸-B萘酯作用的同工酶，每次都顯褐色或紅色，如果是醋酸-a萘酯和醋酸-B萘酯同時能作某些同工酶的底物，則該同工酶帶總是染成紫褐色。過氧化物同工酶染色液的配制：以下三種染色液中任選一種。0.1%聯(lián)苯胺（在0.1mol/L,pH5.6醋酸緩沖液100ml中含0.1g聯(lián)苯胺）100ml,臨用前加1.0ml3%過氧化氫。2%聯(lián)苯胺（2g聯(lián)苯胺溶于18ml冰醋酸，加蒸餾水至100ml）20ml，抗壞血酸70.4mg,20ml0.6%過氧化氫和60ml水，臨用前混合。聯(lián)大茴香胺250mg溶于140ml95%乙醇中，加水20ml,臨用前加過氧化氫4?5ml（13%）。固定保存液：甲醇：冰醋酸：水=5：1：5染色：將配好的染色液倒入白瓷盤內(nèi)（或試管內(nèi)）的凝膠板（或柱）上，室溫放置1?5分鐘即顯現(xiàn)出蘭色區(qū)帶。以無離子水漂洗數(shù)次，放在固定保存液中，區(qū)帶漸漸變成棕色。乳酸脫氫酶同工酶染色液的配制臨用前按20:1的比例混合下列甲、乙二試劑：試劑甲：于一棕色瓶中加入碘化硝基四唑藍(lán)（INT）20mg，加蒸餾水8ml,避光置50C水浴中作用30min，不時振搖助溶，溶解后加入CoI20mg，乳酸鋰0.2g，乙氨基乙甲基1、3丙二醇緩沖液2ml,全部溶解后冰箱儲存，至少可用兩周。試劑乙：取吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）配制1mg/ml溶液，置棕色瓶中保存。此溶液不宜久置，顯微紅色即棄取。甲、乙二液混合配制好后應(yīng)立即使用，整個顯色過程都應(yīng)該避光。染色方法：約于電泳終止前10min，將甲、乙兩種溶液混合，待電泳結(jié)束后，將凝膠浸如染色液中37°C保溫染色。保溫lhr可顯現(xiàn)藍(lán)紫色的同工酶區(qū)帶。改進(jìn)的染色方法改進(jìn)的染色方法的原理是：以PMS為介體使乳酸脫氫酶催化的反應(yīng)中產(chǎn)生的NADH將K4Fe(CN)6，在利用K4Fe(CN)6與FeCl3生成普魯氏藍(lán)的性質(zhì)來實(shí)現(xiàn)染色的。4 6 4 6 3經(jīng)典染色方法：NAD+25mg、NBTl5mg>PMSlmg、lmol/L乳酸鈉(pH7.0)5ml、O.lmol/L