實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)ABI熒光定量PCR儀ABI7000羅氏的熒光定量PCR儀濾鏡輪CCD相機(jī)多孔板物鏡均一的激發(fā)和檢測，無光程差采用折疊光路增加光程，降低激發(fā)高度羅氏LC480教學(xué)安排定量過程化學(xué)原理定量原理的數(shù)學(xué)依據(jù)定量要素應(yīng)用實(shí)例實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。傳統(tǒng)的終點(diǎn)PCR定量終點(diǎn)法的結(jié)果96個(gè)樣品的重復(fù)性PCR擴(kuò)增曲線Rn(熒光信號(hào))循環(huán)數(shù)CycleNumber指數(shù)增長期平臺(tái)期SampleNoTemplateThresholdBaselineRn-Cq閾值和Cq值Rn+標(biāo)準(zhǔn)曲線教學(xué)安排定量過程定量原理的數(shù)學(xué)依據(jù)化學(xué)原理定量要素應(yīng)用實(shí)例PCR理論方程Where:Rn=TotalfluorescencesignalRB=BasefluorescencesignalXO=InitialnumberoftargetmoleculesEX=Efficiencyoftargetamplificationn=NumberofcycleRS=Fluorescencesignalpertargetmolecule當(dāng)n=Cq時(shí)，Rn=Rq，即設(shè)定的閾值Rq=RB+XO(1+Ex)CqRs

log(Rq-RB)=logXO+Cqlog(1+Ex)+logRsCqlog(1+Ex)=log(Rq-RB)-logXO-logRs

Cq=a·logXO

+b教學(xué)安排定量過程定量原理的數(shù)學(xué)依據(jù)化學(xué)原理定量的要素應(yīng)用實(shí)例化學(xué)原理TaqMan?探針SYBR?GreenISYBR?GreenI熒光原理變性延伸擴(kuò)增完成SYBR?GreenI熔解曲線TaqMan?探針5’3’5’5’3’5’RQ正向引物TaqMan?

探針反向引物5’3’5’5’3’5’QR正向引物反向引物其它類型的熒光標(biāo)記分子信標(biāo)LUX

引物熒光分子比較以上是來自Invitrogen公司的比較。

TaqMan

ProbesMolecularBeaconsSYBR

GreenILUXPrimers靈敏度**********動(dòng)態(tài)范圍**********特異性*********多重反應(yīng)****N/A***熔解曲線分析N/AN/A******設(shè)計(jì)簡單********費(fèi)用********教學(xué)安排定量過程化學(xué)原理定量原理的數(shù)學(xué)依據(jù)定量的要素應(yīng)用實(shí)例目標(biāo)基因未知樣品產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品監(jiān)控試劑、系統(tǒng)陽性對(duì)照監(jiān)控污染陰性對(duì)照數(shù)據(jù)之間可比性內(nèi)對(duì)照(IPC)校正操作誤差參比熒光(ROX)降低定量誤差3-6復(fù)管定量的要素目標(biāo)基因可以是DNA、cDNA或者質(zhì)粒；RNA需要先反轉(zhuǎn)錄成cDNA；DNA純度：OD260/OD280=1.8，可以在1.6~2.0之間

=1.8:純DNA>2.0:RNA污染<1.6:蛋白質(zhì)/酚污染DNA用量：基因組DNA：0.1ng–1ug

目標(biāo)基因

標(biāo)準(zhǔn)品用來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立CT值與濃度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。

PCR擴(kuò)增效率盡量接近，越一致誤差越小。同樣條件下完成：同樣的儀器、試劑、循環(huán)參數(shù)、同一次實(shí)驗(yàn)。同樣質(zhì)量的模板、同樣Tm值的引物和探針。標(biāo)準(zhǔn)品陽性對(duì)照已知必定可以成功、得到擴(kuò)增曲線的樣品用于判斷儀器、試劑、操作是否存在問題（假陰性）陰性對(duì)照/空白對(duì)照除了模板DNA或RNA，具備其他全部成分以水代替模板用于判斷系統(tǒng)是否存在污染（假陽性）陽性對(duì)照和陰性對(duì)照內(nèi)對(duì)照(IPC)同樣重量或體積的樣品并不來源于同樣數(shù)目的細(xì)胞，即使細(xì)胞培養(yǎng)的起始量相同、條件相同IPC一般選用基因組中單拷貝的管家基因，其定量結(jié)果代表了基因組的數(shù)量，也就是檢材中細(xì)胞的數(shù)量CT

=CTSmpl-CTIPC將定量結(jié)果校正為以基因組為單位，不同樣品之間具可比性絕對(duì)定量和相對(duì)定量絕對(duì)定量：確定待測樣品中某一目的基因的絕對(duì)量值，即確切拷貝數(shù)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對(duì)定量：確定待測樣品中某一目的基因在不同條件下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）。

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法；2-ΔΔc(q)法教學(xué)安排定量過程化學(xué)原理定量原理的數(shù)學(xué)依據(jù)定量的要素應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例定量檢測絕對(duì)定量：基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因食品檢測、病原體檢測相對(duì)定量：基因在不同組織中的表達(dá)差異、藥物療效考核點(diǎn)突變檢測SNP檢測與疾病相關(guān)的等位基因點(diǎn)突變檢測轉(zhuǎn)基因食品檢測轉(zhuǎn)基因生物又稱遺傳修飾生物（GeneticallyModifiedOrganisms，GMO）食物中轉(zhuǎn)基因成分規(guī)定：歐盟出臺(tái)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)制度(1990)，規(guī)定0.9%閾值標(biāo)準(zhǔn)（2003)標(biāo)準(zhǔn)品：GMO生物與對(duì)應(yīng)的非GMO生物按不同比例混合，提取DNA；選擇目標(biāo)基因A(只有GMO生物表達(dá))與內(nèi)標(biāo)基因B(在GMO和非GMO生物中等量表達(dá))，分別擴(kuò)增得到不同混合比例下的Cq值。材料RoundupReady大豆（RTC公司，IRMM-41050-56）普通非轉(zhuǎn)基因大豆從超市買來的測試樣品：大豆餅,豆制甜點(diǎn)和兩個(gè)牌子的大豆粉標(biāo)準(zhǔn)品的制備:

轉(zhuǎn)基因成分含量分別為0%,0.1%,0.5%,1%,2%和5%目標(biāo)基因：EPSPS；內(nèi)標(biāo)基因：Lectin轉(zhuǎn)基因大豆檢測%GMO=A/B（A,EPSPS;B,lectin)log(%GMO)=log(A/B)=logA-logB=ΔC(q)*MDNAfromStandard/SamplePCRmixGMOprimersTUBE1TUBE2PCRmixLectinprimers轉(zhuǎn)基因大豆檢測Standards/SampleC(q)epspsC(q)Lectin?C(q)0ND22.6ND0.1ND22.6ND0.528.222.55.71.027.222.54.72.026.222.83.45.024.622.71.9SoyDessert24.622.42.1SoyFlourND22.2NDSoyBurger24.223.40.7y=-0.264x+1.202R2=0.998-0.40-0.200.000.200.400.600.800123456?C(q)LogpercentGMO轉(zhuǎn)基因大豆檢測結(jié)果Standards/Sample?C(q)%GMOSoyDessert2.14.40SoyFlourND<0.5SoyBurger0.7>5ERBB2

在乳腺腫瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)差異（雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法/2-ΔΔc(q)

法）已知在50%的乳腺腫瘤樣本中，ERBB2表達(dá)異常，因此可以作為一個(gè)檢測標(biāo)準(zhǔn);選用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因FAM標(biāo)記的ERBB2探針VIC標(biāo)記的GAPDH探針雙標(biāo)準(zhǔn)曲線Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2樣品擴(kuò)增：正常vs腫瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH腫瘤腫瘤正常正常實(shí)驗(yàn)結(jié)果MultiplexReactions:C(q)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0426.24±0.17ERBB2表達(dá)MultiplexReactions:C(q)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8623.34±0.1022.83±0.03GAPDH表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.0190.0110.0180.018/0.011＝1.6300.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpressionHealthyRNATumorRNA2-ΔΔc(t)

法HealthyRNAERBB2GAPDHΔC(t)28.4023.275.1328.4623.415.0528.43±0.0423.34±0.105.09±0.18CarcinomaRNAERBB2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1722.83±0.034.41±0.21ΔΔC(t)=4.41-5.09=-0.68±0.182-ΔΔc(t)=1.41~1.82結(jié)果與雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相近SNP檢測SNP（單核苷酸多態(tài)性）人類基因組中的單堿基突變大約93%的基因至少含有一個(gè)SNPSNP分型的意義可能引起疾病或疾病的易感性作為基因缺陷型疾病的標(biāo)志物SNP的漂變可作為進(jìn)化研究手段藥物的抗藥性研究SNP檢測AACCTGCATAATGCCAG AACCTGCAGAATGCCAG單核苷酸多態(tài)性SingleNucleotidePolymorphismsFAM=等位基因II純合子VIC=等位基因I純合子FAM+VIC=等位基因I、II雜合子SNP檢測（等位基因分型）