3基因工程的基本條件-全

生物工工程專專業(yè)核核心課課程基因工程基因工工程523416789基因工工程的的基本本概念念基因工工程的的基本本原理理基因工工程所所需的的基本本條件件基因工工程的的操作作過程程目的基基因的的克隆隆與基基因文文庫的的構(gòu)建建大腸桿桿菌基基因工工程酵母基基因工工程哺乳動(dòng)動(dòng)物基基因工工程高等植植物基基因工工程3基因工工程的的基本本條件件C用于基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移的的受體體菌或或細(xì)胞胞B用于于基因因克克隆隆的的載載體體A用于于核核酸酸操操作作的的工工具具酶酶A用于于核核酸酸操操作作的的工工具具酶酶3基因因工工程程的的基基本本條條件件限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶DNA連接接酶酶DNA聚合合酶酶核酸酸酶酶核酸酸修修飾飾酶酶限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶的的發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)及及其其生生物物功功能能識(shí)別別雙雙鏈鏈DNA分子子中中的的特特定定序序列列，，并并切切割割DNA雙鏈鏈主要要存存在在于于原原核核細(xì)細(xì)菌菌中中，，幫幫助助細(xì)細(xì)菌菌限限制制外外來來DNA的入入侵侵細(xì)菌菌的的限限制制與與修修飾飾作作用用hsdR：：編碼碼限限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶hsdM：：編碼碼限限制制性性甲甲基基化化酶酶hsdS：：編碼碼限限制制性性酶酶和和甲甲基基化化酶酶的的協(xié)協(xié)同同表表達(dá)達(dá)1968年年，，Smith等人人首首先先從從流感感嗜嗜血血桿桿菌菌d株中中分分離離出出HindII和HindIII限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶的的類類型型主要要特特性性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白白結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)異源源三三聚聚體體同源源二二聚聚體體異源源二二聚聚體體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識(shí)別序列TGAN8TGCT旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割割位位點(diǎn)點(diǎn)距識(shí)識(shí)別別序序列列1kb處識(shí)別別序序列列內(nèi)內(nèi)或或附附近近距識(shí)識(shí)別別序序列列下下游游隨機(jī)機(jī)性性切切割割特異異性性切切割割24-26bp處限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶的的命命名名屬名名種種名名株株名名HindIIIHindIIIHaemophilusinfluenzaed嗜血血流流感感桿桿菌菌d株同一一菌菌株株中中所所含含的的多多個(gè)個(gè)不不同同的的限限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶II型限限制制性性核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶的的基基本本特特性性識(shí)別別雙雙鏈鏈DNA分子子中中4-8對(duì)堿堿基基的的特特定定序序列列大部部分分酶酶的的切切割割位位點(diǎn)點(diǎn)在在識(shí)識(shí)別別序序列列內(nèi)內(nèi)部部或或兩兩側(cè)側(cè)識(shí)別別切切割割序序列列呈呈典典型型的的旋旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)對(duì)對(duì)稱稱型型回文文結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)5‘‘……GCTGAATTCGAG……3’’3‘‘……CGACTTAAGCTC……5’’EcoRI的識(shí)識(shí)別別序序列列EcoRI的切切割割位位點(diǎn)點(diǎn)EcoRI等產(chǎn)生的的5‘粘粘性末端端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘……G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘……C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPOHPPstI等產(chǎn)生的的3‘粘粘性末端端5‘……G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘……C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘……G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G…3’3‘……C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘……G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘……C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’’OHPOHPPvuII等產(chǎn)生的平頭頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶II型限制性核酸酸內(nèi)切酶酶解解反應(yīng)的操作作大部分II型核酸內(nèi)切酶酶需要相似的的反應(yīng)條件：：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸內(nèi)切酶的的酶活性：在在最佳反應(yīng)條條件下反應(yīng)1小時(shí)，，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶II型限制性核酸酸內(nèi)切酶酶解解反應(yīng)的操作作II型核酸內(nèi)切酶酶的多酶聯(lián)合合酶解：對(duì)鹽濃度要求求相同的酶，，原則上可以以同時(shí)酶切，，但應(yīng)注意：：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶II型限制性核酸酸內(nèi)切酶酶解解反應(yīng)的操作作II型核酸內(nèi)切酶酶的多酶聯(lián)合合酶解：對(duì)鹽濃度要求求不同的酶，，可采取下列列方法：使用較貴的酶酶的鹽濃度，，加大便宜酶酶的用量，同同時(shí)酶解低鹽酶先切，，然后補(bǔ)加鹽鹽，高鹽酶再再切一種酶先切，，然后更換緩緩沖液，另一一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷冷乙醇冰浴5分分鐘、高速冷冷凍離心10分鐘、干燥燥限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶影響限制性核核酸內(nèi)切酶活活性的因素DNA樣品的純度：：蛋白質(zhì)、苯酚酚、氯仿、乙乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量量，1mgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體體積延長反應(yīng)時(shí)間間限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶影響限制性核核酸內(nèi)切酶活活性的因素DNA樣品的甲基化化程度：大腸桿菌中的的dam甲基化酶在5‘GATC3’’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受受其影響的酶酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響大腸桿菌中的的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，，受其影響的酶酶有EcoRII等哺乳動(dòng)物中的的甲基化酶在在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶影響限制性核核酸內(nèi)切酶活活性的因素核酸內(nèi)切酶的的緩沖液性質(zhì)質(zhì)：高濃度的酶、、高濃度的甘甘油、低離子子強(qiáng)度、極端端pH值等，會(huì)使一些核核酸內(nèi)切酶酶的識(shí)別和和切割序列列發(fā)生低特特異性，即即所謂的Staractivity現(xiàn)象EcoRI在正常條件件下識(shí)別并并切割5‘‘GAATTC3’序列，但在在甘油濃度超過過5%（v/v）時(shí)，也可切切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’DNA連接酶DNA連接酶的基基本性質(zhì)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的的磷酸二酯酯鍵DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA連接酶DNA連接酶的基基本性質(zhì)修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處處的磷酸二二酯鍵T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA連接酶DNA連接酶的基基本性質(zhì)連接多個(gè)平平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶的反反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶酶活性：在在最佳反應(yīng)應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小小時(shí)，完全連接1mgl-DNA（（HindIII片段）所需需的酶量DNA連接酶平頭雙鏈DNA片段的連接接操作從分子動(dòng)力力學(xué)的角度度講，由限限制性核酸酸內(nèi)切酶創(chuàng)創(chuàng)造的粘性性末端的連連接屬于分分子內(nèi)部的的連接，而而平頭末端端的連接則則屬于分子子間的連接接，因此后后者反應(yīng)速速度要慢得得多提高平頭末末端連接效效率的方法法包括：加大連接酶酶用量（10倍大于粘性性末端的連連接）加大平頭末末端底物的的濃度，增增加分子間間碰撞機(jī)會(huì)會(huì)加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子子之間的有有效作用加入單價(jià)陽陽離子（NaCl），最終濃度150-200mMDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI））5‘→3‘‘的DNA聚合酶活性性5‘→3‘‘的核酸外切切酶活性3‘→5‘‘的核酸外切切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質(zhì)質(zhì)：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘‘pppdNMg2+3‘‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A……5’’5‘‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolIDNA聚合合酶酶大腸腸桿桿菌菌DNA聚合合酶酶I（（DNApolI））缺口口前前移移標(biāo)標(biāo)記記法法大腸腸桿桿菌菌DNA聚合合酶酶I的基基本本用用途途：：5‘‘……G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T……3’’3‘‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A……5‘‘Mg2+5‘‘dNTP5‘‘pppdA（（a-32P-dATP））5‘‘……G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T……3’’3‘‘……C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Nicktranslation制備32P標(biāo)記的探針DNaseIDNApolIDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本性質(zhì)質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋蛋白酶處理，，獲得N端三分之二的大大肽段，即為為Klenow酶Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核核酸外切酶活活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶酶活性DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)內(nèi)切酶產(chǎn)生的的5‘粘性末末端DNA片段的同位素素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成成雙脫氧末端終終止法測定DNA序列DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)內(nèi)切酶產(chǎn)生的的5‘粘性末末端5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’’DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基基本用用途：：DNA片段的的同位位素末末端標(biāo)標(biāo)記5‘……G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G……3’3‘……C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C……5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘……G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G……3’3‘……C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C……5’DNA聚合酶酶T4-DNA聚合酶酶T4-DNA酶的基基本特特性：：在無dNTP時(shí)，可可以從從任何何3‘‘-OH端外切切在只有有一種種dNTP時(shí)，外外切至至互補(bǔ)補(bǔ)核苷苷酸暴暴露時(shí)時(shí)停止止在四種種dNTP均存在在時(shí)，，聚合合活性性占主主導(dǎo)地地位5‘→→3‘‘的DNA聚合酶酶活性性和3‘→→5‘‘的核酸酸外切切酶活活性DNA聚合酶酶T4-DNA聚合酶酶T4-DNA聚合酶酶的基基本用用途：：切平由由核酸酸內(nèi)切切酶產(chǎn)產(chǎn)生的的3’粘性末末端5‘……G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G……3’3‘……C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C……5’T4-DNA聚合酶酶5‘……G-C-T-C-OHP-G-G-A-G……3’3‘……C-G-A-G-PHO-C-C-T-C……5’注意：：該酶酶也能能降解解雙鏈鏈DNA，只是其其活性性比單單鏈降降解活活性低低很多多DNA聚合酶酶T4-DNA聚合酶酶T4-DNA聚合酶酶的基基本用用途：：DNA片段的的同位位素末末端標(biāo)標(biāo)記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdN5‘pppdA（（a-32P-dATP））5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘DNA聚合酶酶依賴于于RNA的DNA聚合酶酶（反反轉(zhuǎn)錄錄酶））反轉(zhuǎn)錄錄酶的的基本本特性性：以RNA為模板板聚合合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反轉(zhuǎn)錄錄酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNADNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶（反反轉(zhuǎn)錄酶））反轉(zhuǎn)錄酶的的基本特性性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的的RNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’DNA3’5’3’RNA5’DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’DNA3’核酸酶單鏈核酸外外切酶：核核酸外切酶酶VII（ExoVII）大腸桿菌的的核酸外切切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’核酸酶雙鏈核酸外外切酶：核核酸外切酶酶III（ExoIII）ExoVII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的的核酸外切切酶III特異性地從從3‘端端外切核酸酶雙鏈核酸外外切酶：l核酸外切酶酶（lExo）lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶酶特異性地地從5‘端端外切3’5’3’5’核酸酶單鏈核酸內(nèi)內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基基本特性：：來自稻谷谷曲霉菌（（Aspergillusoryzae）Zn2+必需最適pH范圍為4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降降解雙鏈DNA快75000倍降解單鏈DNA的速度比降降解單鏈RNA快7倍核酸酶單鏈核酸內(nèi)內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基基本反應(yīng)：：內(nèi)切單鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’’5‘dNMPs或5‘NMPs核酸酶單鏈核酸內(nèi)內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基基本反應(yīng)：：內(nèi)切帶缺口口或切口的的雙鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’’3‘…C-G-A-G-T-CA-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’’A-C-C-T-C-A…5‘核酸酶單鏈核酸酸內(nèi)切酶酶：S1核酸酶S1核酸酶的的重要用用途：在DNA上定位RNA（（S1mapping）DNAmRNA雜交S1EcoRI核酸酶單鏈內(nèi)切切雙鏈外外切的核核酸酶：：Bal31核酸酶S1核酸酶的的基本特特性：來來自艾氏氏交替單單胞菌（（A.espejiana）Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+核酸酶單鏈內(nèi)切雙雙鏈外切的的核酸酶：：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基基本用途：：誘發(fā)DNA突變EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA環(huán)化AC核酸修飾酶酶末端脫氧核核苷酰轉(zhuǎn)移移酶（TdT）TdT的基本特性性：來自小小牛胸腺不需要模板板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTMg2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘TdT的基本特性性：5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘AAAAAAAAAAA核酸修飾酶酶堿性磷酸單單酯酶來自小牛胸胸腺的堿性性磷酸單酯酯酶（CIP）來自大腸桿桿菌的堿性性磷酸單酯酯酶（BAP）5‘pOH3‘DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘‘5‘‘HO5‘‘HOdN5‘‘HON核酸酸修修飾飾酶酶T4-多核核苷苷酸酸磷磷酸酸激激酶酶（（T4-PNP））T4-PNP的基基本本特特性性：：在在DNA、、RNA、、dNR、、NR的5‘‘-OH上加加磷磷5‘‘HO3‘‘HOOH3‘‘OH5‘‘T4-PNPMg2+pppATP（（g-32P-ATP））5‘‘p3‘‘HOOH3‘‘p5‘‘用于于探探針針的的末末端端同同位位素素標(biāo)標(biāo)記記：：B用于于基基因因克克隆隆的的載載體體3基因因工工程程的的基基本本條條件件質(zhì)粒粒（（plasmid））噬菌菌體體或或病病毒毒DNA考斯斯質(zhì)質(zhì)粒粒（（cosmid））與噬噬菌菌粒粒人造造染染色色體體載載體體載體體的的功功能能及及特特征征載體體的的功功能能及及特特征征載體體的的功功能能運(yùn)送送外外源源基基因因高高效效轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入入受受體體細(xì)細(xì)胞胞為外外源源基基因因提提供供復(fù)復(fù)制制能能力力或或整整合合能能力力為外外源源基基因因的的擴(kuò)擴(kuò)增增或或表表達(dá)達(dá)提提供供必必要要的的條條件件載體體的的功功能能及及特特征征載體體應(yīng)應(yīng)具具備備的的條條件件具有有針針對(duì)對(duì)受受體體細(xì)細(xì)胞胞的的親親緣緣性性或或親親和和性性（（可可轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移性性））具有有合合適適的的篩篩選選標(biāo)標(biāo)記記具有有較較高的的外外源源DNA的載載裝裝能能力力具有有多多種種單單一一的的核核酸酸內(nèi)內(nèi)切切酶酶識(shí)識(shí)別別切切割割位位點(diǎn)點(diǎn)具有有與與特特定定受受體體細(xì)細(xì)胞胞相相適適應(yīng)應(yīng)的的復(fù)復(fù)制制位位點(diǎn)點(diǎn)或或整整合合位位點(diǎn)點(diǎn)質(zhì)粒粒質(zhì)粒粒的的基基本本特特征征質(zhì)粒粒是是生生物物細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)固固有有的的、、能能獨(dú)獨(dú)立立于于寄寄主主染染色色體體而而自自主主復(fù)復(fù)制制、、并并被穩(wěn)穩(wěn)定定遺遺傳傳的的一一類類核核酸酸分分子子質(zhì)粒粒常常見見于于原原核核細(xì)細(xì)菌菌和和真真菌菌中中絕大大多多數(shù)數(shù)的的質(zhì)質(zhì)粒粒是是DNA型的的絕大大多多數(shù)數(shù)的的天天然然DNA質(zhì)粒粒具具有有共共價(jià)價(jià)、、封封閉閉、、環(huán)環(huán)狀狀的的分分子子結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)，，即cccDNA質(zhì)粒粒DNA的分分子子量量范范圍圍：：1-300kb質(zhì)粒粒質(zhì)粒粒的的基基本本特特征征質(zhì)粒粒的的自自主主復(fù)復(fù)制制性性質(zhì)粒粒能能利利用用寄寄主主細(xì)細(xì)胞胞的的DNA復(fù)制制系系統(tǒng)統(tǒng)進(jìn)進(jìn)行行自自主主復(fù)復(fù)制制質(zhì)粒粒DNA上的的復(fù)復(fù)制制子子結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)決決定定了了質(zhì)質(zhì)粒粒與與寄寄主主的的對(duì)對(duì)應(yīng)應(yīng)關(guān)關(guān)系系根據(jù)據(jù)在在每每個(gè)個(gè)細(xì)細(xì)胞胞中中的的分分子子數(shù)數(shù)（（拷拷貝貝數(shù)數(shù)））多多寡寡，，質(zhì)質(zhì)粒?？煽煞址譃闉閮纱蟠髲?fù)復(fù)制制類類型型：：嚴(yán)緊緊型型復(fù)復(fù)制制控控制制的的質(zhì)質(zhì)粒粒1-3拷拷貝貝stringentplasmid松弛型復(fù)制控控制的質(zhì)粒10-60拷拷貝stringentplasmid質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特特征質(zhì)粒的自主復(fù)復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制制機(jī)制–質(zhì)質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制制控制復(fù)制引物物與模板的結(jié)結(jié)合oriE.coliColE1plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特特征質(zhì)粒的自主復(fù)復(fù)制性：拷貝數(shù)的控制制機(jī)制–質(zhì)質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制制控制復(fù)制起始始因子與復(fù)制制起始位點(diǎn)（（ori）的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特特征質(zhì)粒的不相容容性任何兩種含有有相似復(fù)制子子結(jié)構(gòu)的不同同質(zhì)粒，不能能同時(shí)存在于于一個(gè)細(xì)胞中，，這種現(xiàn)象稱稱為質(zhì)粒的不相容容性，不相容性的的質(zhì)以大腸桿菌的的質(zhì)粒為例：：ColE1、、pMB1擁有相似的復(fù)復(fù)制子結(jié)構(gòu)，，彼此不相容容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)復(fù)制子結(jié)構(gòu)，，彼此不相容容p15A及其衍生質(zhì)粒粒擁有相似的的復(fù)制子結(jié)構(gòu)構(gòu)，彼此不相相容粒組成不相容性群質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特特征質(zhì)粒的不相容容性：分子機(jī)制兩種含有相似似復(fù)制子結(jié)構(gòu)構(gòu)的不同質(zhì)粒粒，在復(fù)制時(shí)時(shí)受到同一種種拷貝數(shù)控制系系統(tǒng)的干擾，，致使兩種質(zhì)質(zhì)粒的最終拷拷貝數(shù)不同，，兩種含有不同同復(fù)制子結(jié)構(gòu)構(gòu)的不同質(zhì)粒粒，在復(fù)制時(shí)時(shí)各受自己的的拷貝數(shù)控制系系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，，致使兩種質(zhì)質(zhì)粒的最終拷拷貝數(shù)恒定，，因此在經(jīng)過若若干復(fù)制周期期和細(xì)胞分裂裂周期后仍能能共處于同一一細(xì)胞內(nèi)其中拷貝數(shù)多多的質(zhì)粒在以以后的細(xì)胞分分裂周期中更更具優(yōu)勢(shì)質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特特征質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移移性革蘭氏陰性菌菌的質(zhì)?？煞址殖蓛纱箢悾海航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件件下自發(fā)地從從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（（接合作用）），如F、Col、、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒粒不能在天然條條件下獨(dú)立地地發(fā)生接合作作用值得注意的是是，某些非接接合型質(zhì)粒（（ColE1））在接接合合型型質(zhì)質(zhì)粒粒的存存在在和和協(xié)協(xié)助助下下，，也也能能發(fā)發(fā)生生DNA轉(zhuǎn)移移，，這這個(gè)個(gè)過過程程由由bom和mob基因因決決定定質(zhì)粒粒質(zhì)粒粒的的基基本本特特征征攜帶帶特特殊殊的的遺遺傳傳標(biāo)標(biāo)記記野生生型型的的質(zhì)質(zhì)粒粒DNA上往往往往攜攜帶帶一一個(gè)個(gè)或或多多個(gè)個(gè)遺遺傳傳標(biāo)標(biāo)記記基基因因，，這這使得得寄寄主主生生物物產(chǎn)產(chǎn)生生正正常常生生長長非非必必需需的的附附加加性性狀狀，，包包括括：：物質(zhì)質(zhì)抗抗性性抗生生素素、、重重金金屬屬離離子子、、毒毒性性陰陰離離子子、、有有機(jī)機(jī)物物物質(zhì)質(zhì)合合成成抗生生素素、、細(xì)細(xì)菌菌毒毒素素、、有有機(jī)機(jī)堿堿這些些標(biāo)標(biāo)記記基基因因?qū)?duì)DNA重組組分分子子的的篩篩選選具具有有重重要要意意義義質(zhì)粒粒質(zhì)粒粒的的構(gòu)構(gòu)建建天然然存存在在的的野野生生型型質(zhì)質(zhì)粒粒由由于于分分子子量量大大、、拷拷貝貝數(shù)數(shù)低低、、單單一一酶酶切切位位點(diǎn)點(diǎn)少少、、遺遺傳傳標(biāo)標(biāo)記記不不理理想想等等缺缺陷陷，，不不能能滿滿足足克克隆隆載載體體的的要要求求，，因因此此往往往往需需要要以以多多種種野野生生型型質(zhì)質(zhì)粒粒為為基基礎(chǔ)礎(chǔ)進(jìn)進(jìn)行行人人工工構(gòu)構(gòu)建建。。目前實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室使用用的大腸腸桿菌質(zhì)質(zhì)粒大多多是由少少數(shù)幾個(gè)個(gè)野生型型質(zhì)粒構(gòu)構(gòu)建的：：pSC1018.8kb拷貝數(shù)5四四環(huán)素素抗性標(biāo)標(biāo)記基因因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大大腸桿桿菌內(nèi)毒毒素標(biāo)記記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒粒氨氨芐青霉霉素抗性性標(biāo)記基基因Apr質(zhì)粒質(zhì)粒的分分類人工構(gòu)建建的質(zhì)粒粒根據(jù)其其功能和和用途可可分成如如下幾類類：高拷貝質(zhì)質(zhì)粒突變拷貝貝數(shù)控制制基因拷拷貝貝數(shù)1000-3000擴(kuò)擴(kuò)增基基因低拷貝質(zhì)質(zhì)粒來自pSC101拷貝數(shù)小小于10表達(dá)某些些毒性基基因溫敏質(zhì)粒粒在不同溫溫度下表表現(xiàn)出拷拷貝數(shù)、、整合等等不同性性質(zhì)測序質(zhì)粒粒含有測序序通用引引物互補(bǔ)補(bǔ)序列和和多酶接接頭polylinker整合質(zhì)粒粒裝有整合合促進(jìn)基基因及位位點(diǎn)便便于外外源基因因的整合合穿梭質(zhì)粒粒裝有針對(duì)對(duì)兩種不不同受體體的復(fù)制制子便便于基基因克隆隆表達(dá)質(zhì)粒粒裝有強(qiáng)化化外源基基因表達(dá)達(dá)的轉(zhuǎn)錄錄、翻譯譯、純化化的元件件探針質(zhì)粒粒裝有報(bào)告告基因便便于于啟動(dòng)子子等元件件的克隆隆篩選質(zhì)粒重要的大大腸桿菌菌質(zhì)粒載載體松弛型復(fù)復(fù)制pBR322：：氯霉素可可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因因克隆質(zhì)粒重要的大大腸桿菌菌質(zhì)粒載載體pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因因克隆和和測序裝有多克克隆位點(diǎn)點(diǎn)（MCS））正選擇顏顏色標(biāo)記記lacZ’質(zhì)粒重要的大大腸桿菌菌質(zhì)粒載載體pUC18/19：正選擇標(biāo)標(biāo)記lacZ’的顯色原原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚哚基-b-D-半乳糖苷苷X-gal質(zhì)粒重要的大大腸桿菌菌質(zhì)粒載載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個(gè)個(gè)噬菌體體的強(qiáng)啟啟動(dòng)子裝有多克克隆位點(diǎn)點(diǎn)（MCS））正選擇顏顏色標(biāo)記記lacZ’用于外源源基因的的高效表表達(dá)注意：T7和SP6啟動(dòng)子特特異性地地由噬菌菌體DNA編碼的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識(shí)別別，因此此相應(yīng)的的受體菌菌必須表表達(dá)噬菌菌體RNA聚合酶，，如：E.coliBL21（DE3）等質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純純化實(shí)驗(yàn)室一一般使用用下列三三種方法法制備質(zhì)質(zhì)粒DNA：：氯化銫密密度梯度度離心法法質(zhì)粒DNA純度高、、周期長長、設(shè)備備要求高高、溴乙乙錠污染染堿溶法質(zhì)粒DNA純度底、、快速、、操作簡簡便沸水浴法法質(zhì)粒DNA純度、操操作周期期介于氯氯化銫法法和堿溶溶法之間間質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化氯化銫密度梯梯度離心法：：用含有EDTA的緩沖液懸浮浮菌體加溶菌酶裂解解細(xì)菌細(xì)胞壁壁加CsCl和溴乙錠超速離心過夜夜在紫外燈下吸吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化堿溶法：用含有EDTA的緩沖液懸浮浮菌體加溶菌酶裂解解細(xì)菌細(xì)胞壁壁加NaOH和SDS的混合溶液，，去膜釋放內(nèi)內(nèi)含物加高濃度的醋醋酸鉀溶液，，沉淀染色體體，去除染色體DNA及大部分蛋白白質(zhì)離心取上清液液，用苯酚-氯仿萃取，，去除痕量的的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇醇沉淀水相質(zhì)質(zhì)粒DNA用無DNase的RNase去除殘余的RNAcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化沸水浴法：用含有EDTA和TritonX-100的緩沖液懸浮浮菌體加溶菌酶裂解解細(xì)菌細(xì)胞壁壁沸水浴40秒秒鐘離心，用無菌菌牙簽挑去沉沉淀物乙醇或異丙醇醇沉淀質(zhì)粒DNA噬菌體或病毒毒DNA噬菌體或病毒毒是一類非細(xì)細(xì)胞微生物，，能高效率高高特異性地侵侵染宿主細(xì)胞，然然后或自主復(fù)復(fù)制繁殖，或或整合入宿主主基因組中潛潛伏起來，而且在在一定的條件件下上述兩種種狀態(tài)還會(huì)相相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒毒的上述特性性使得它們的的DNA能被開發(fā)成為為基因工程的有用載體體，因?yàn)椋焊咝实母腥救拘阅苁雇庠丛椿蚋咝?dǎo)導(dǎo)入受體細(xì)胞胞自主復(fù)制繁殖殖性能使外源源基因在受體體細(xì)胞中高效效擴(kuò)增噬菌體或病毒毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生物物學(xué)特性：生物結(jié)構(gòu)l噬菌體是大腸桿菌的溫溫和型噬菌體體l噬菌體由外殼包裝蛋蛋白和l-DNA組成l-DNA全長48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)個(gè)基因l噬菌體生物學(xué)學(xué)特性：生物結(jié)構(gòu)5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因因尾部合成基因因溶菌控制基因因晚期控制基因因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因因阻遏基因重組基因刪除與整合基基因l-DNA噬菌體或病毒毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學(xué)學(xué)特性：感染周期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解噬菌體或病毒毒DNA大腸桿菌的的l噬菌體DNAl噬菌體生物物學(xué)特性：：感染周期體內(nèi)包裝100個(gè)左左右的拷貝貝包裝范圍為為原DNA的75-105%即36-51kbDA噬菌體或病病毒DNA大腸桿菌的的l噬菌體DNAl噬菌體生物物學(xué)特性：：溶原狀態(tài)l噬菌體感染染大腸桿菌菌后，除能能裂解細(xì)胞胞外，也可可能將其DNA直接整合到到宿主細(xì)胞胞的染色體體DNA上，并不產(chǎn)產(chǎn)生子代噬噬菌體顆粒粒，這種情情況為溶原狀態(tài)。整合主要要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)產(chǎn)物所激活活，而這兩兩個(gè)基因的的開放與關(guān)關(guān)閉又取決決于宿主細(xì)細(xì)胞本身的的性質(zhì)。人人們可以根根據(jù)需要改改變l-DNA或宿主細(xì)胞胞的性質(zhì)，，使噬菌體體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶溶菌狀態(tài)DNA重組技術(shù)一一般需要l噬菌體進(jìn)入入溶菌狀態(tài)態(tài)噬菌體或病病毒DNA大腸桿菌的的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)建建：縮短長度野生型l-DNA包裝的上限限為51kb，本身長度為為48.5kb，只有當(dāng)插入入的外源DNA片段不大于于2.5kb時(shí)，才能被包包裝成有感感染力的噬噬菌體顆粒粒。因此縮縮短野生型型l-DNA的長度，可可以提高裝裝載量。其其實(shí)野生型型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)復(fù)制和裂解解所非必需需的。根據(jù)據(jù)切除的多多少，可將將l-DNA分成兩大類類載體：插入型載體體取代型載體體噬菌體或病病毒DNA大腸桿菌的的l噬菌體DNAl-DNA載體體的的構(gòu)構(gòu)建建：：縮短短長長度度插入入型型載載體體體外外包包裝裝插入入位位點(diǎn)點(diǎn)體外外包包裝裝插入入片片段段載體體長長度度37kb插入入片片段段大大小小：：0-14kb（51––37））噬菌菌體體或或病病毒毒DNA大腸腸桿桿菌菌的的l噬菌菌體體DNAl-DNA載體體的的構(gòu)構(gòu)建建：：縮短短長長度度取代代型型載載體體體外外包包裝裝體外外包包裝裝插入入片片段段最小小裝裝載載長長度度10kb（51––26））載體體長長度度26kb插入入片片段段最大大裝裝載載長長度度25kb（36––26））噬菌菌體體或或病病毒毒DNA大腸腸桿桿菌菌的的l噬菌菌體體DNAl-DNA載體體的的構(gòu)構(gòu)建建：：刪除除重重復(fù)復(fù)的的酶酶切切位位點(diǎn)點(diǎn)野生生型型的的l-DNA鏈上上有有5個(gè)個(gè)EcoRI位點(diǎn)點(diǎn)和和7個(gè)個(gè)HindIII位點(diǎn)點(diǎn)，，不不利于于重重組組操操作作，，必必須須刪刪除除至至1-2個(gè)個(gè)同時(shí)時(shí)，，為為了了便便于于各各種種來來源源的的DNA片段段的的克克隆隆，，還還需需要要增增加加一一些單單一一的的酶酶切切位位點(diǎn)點(diǎn)除了了簡簡單單的的切切割割外外，，還還需需要要采采用用定定點(diǎn)點(diǎn)突突變變技技術(shù)術(shù)去去除除或或增增添添酶酶位點(diǎn)點(diǎn)噬菌菌體體或或病病毒毒DNA大腸腸桿桿菌菌的的l噬菌菌體體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：加裝選擇擇標(biāo)記與質(zhì)粒不不同，野野生型l-DNA上缺少合合適的選選擇標(biāo)記記，因此此加裝選擇標(biāo)記記是l-DNA克隆載體體構(gòu)建的的重要內(nèi)內(nèi)容l-DNA克隆載體體上的選選擇標(biāo)記記主要有有下列兩兩類：免疫功能能類標(biāo)記記顏色反應(yīng)應(yīng)類標(biāo)記記噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：加裝選擇擇標(biāo)記imm434imm434基因編碼碼一種阻阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌菌循環(huán)的的阻遏物物。含有有完整標(biāo)標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入入受體細(xì)細(xì)胞后，，建立溶溶原狀態(tài)，，細(xì)菌生生長緩慢慢，形成成渾濁斑斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)標(biāo)記基因因中，基基因滅活，l-重組分子子便進(jìn)入入溶菌循循環(huán)，形形成透明斑噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：加裝選擇擇標(biāo)記lacZlacZ基因編碼碼b-半乳糖苷苷酶，能能催化無色的X-gal生成藍(lán)色色化合物物。當(dāng)外外源基因插入到到lacZ基因中，，基因滅滅活，不不能合成藍(lán)色色化合物物；而空空載體l-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透透明斑噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構(gòu)構(gòu)建：構(gòu)建琥珀珀密碼子子的突變變體琥珀型突突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。。大腸桿桿菌的某某些菌株株含有特特異性的的校正基基因，其其編碼產(chǎn)產(chǎn)物校正正tRNA能專一性性地糾正正這一突突變。將野生型型l-DNA上D和E兩個(gè)頭部部包裝蛋蛋白的基基因中的的CAG密碼子突突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般般的大腸腸桿菌菌菌株后，，不能合合成有活活性的頭頭部蛋白白，也就就不能被被包裝和和裂解細(xì)細(xì)菌，這這樣就可可以阻止止有害重重組體的的生物污污染及擴(kuò)擴(kuò)散，而而基因工工程實(shí)驗(yàn)驗(yàn)中使用用的受體體則是具具有琥珀珀型突變變體校正正功能的的菌株噬菌體或或病毒DNA大腸桿菌菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的主主要類型型：插入滅活活型載體體Charon2、Charon6、lgt11取代型載載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型型載體lEMBL1、lL47、、l1059野生型的的l噬菌體不不能在P2噬菌體溶溶源性的細(xì)菌菌中繁繁殖（（Spi+），這種生生長抑抑制表表型受受l-DNA上的red和gam兩個(gè)基基因控控制。。若將將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體體便擁擁有Spi-表型，，能在在P2噬菌體溶源性性的大腸腸桿菌菌受體體菌中中繁殖殖，并并形成成透明明斑噬菌體體或病病毒DNA大腸桿桿菌的的l噬菌體體DNAl-DNA重組分分子的的體外外包裝裝：l-DNA重組分分子需需在體體外人人工包包裝成成有感感染力力的噬噬菌體體重組組顆粒粒，方方可高高效導(dǎo)導(dǎo)入受受體細(xì)細(xì)胞用于體體外包包裝的的蛋白白質(zhì)可可直接接從感感染了了l噬菌體體的大大腸桿桿菌中中提取取，現(xiàn)現(xiàn)已商商品化化。這這些包包裝蛋蛋白通通常分分為相相互互互補(bǔ)的的兩部部分：：一部部分缺缺少E組份，，另一一部分分則缺缺少D組份。包裝裝時(shí)，當(dāng)且且僅當(dāng)這兩兩部分包裝裝蛋白與重重組l-DNA分子混合后后，包裝才才能有效進(jìn)進(jìn)行，任何何一種蛋白白包裝液被被重組l-DNA污染后，均均不能被包包裝成有感感染力的噬噬菌體顆粒粒，這也是是基于安全全而設(shè)計(jì)的的噬菌體或病病毒DNA大腸桿菌的的l噬菌體DNAl-DNA及其重組分分子的分離離純化：將大腸桿菌菌在含有麥麥芽糖的培培養(yǎng)基中培培養(yǎng)至對(duì)數(shù)數(shù)生長期加入l噬菌體或重重組l噬菌體的懸懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)用新鮮培養(yǎng)養(yǎng)基稀釋，，繼續(xù)培養(yǎng)養(yǎng)4-12小時(shí)。這時(shí)時(shí)噬菌體顆顆粒密度已達(dá)1013-1014/L，大腸桿菌細(xì)細(xì)胞已完全全裂解超速離心，，沉淀噬菌菌體苯酚抽提，，釋放l-DNA乙醇或異丙丙醇沉淀l-DNA噬菌體或病病毒DNA大腸桿菌的的l噬菌體DNAl-DNA作為載體的的優(yōu)點(diǎn)：l-DNA可在體外包包裝成噬菌菌體顆粒，，能高效轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染大腸桿桿菌l-DNA載體的裝載載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)質(zhì)粒的裝載載量重組l-DNA分子的篩選較為為方便重組l-DNA分子的提取取較為簡便便l-DNA載體適合克克隆和擴(kuò)增增外源DNA片段，但不不適合表達(dá)達(dá)外源基因噬菌體或病病毒DNA大腸桿菌的的M13單鏈?zhǔn)删w體DNAM13噬菌體的生生物學(xué)特性性：生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外外型呈絲狀狀M13噬菌體由外殼包裝裝蛋白和正鏈DNA組成M13DNA全長6407個(gè)核苷酸M13DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)個(gè)外殼蛋白白分子M13噬菌體不裂解宿主主細(xì)胞，但但抑制其生生長噬菌體或病病毒DNA大腸桿菌的的M13單鏈?zhǔn)删w體DNAM13噬菌體的生生物學(xué)特性性：感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV噬菌體或病病毒DNA大腸桿菌的的M13單鏈?zhǔn)删w體DNAM13DNA載體的構(gòu)建建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘‘polylinker噬菌體或病病毒DNA大腸桿菌的的M13單鏈?zhǔn)删w體DNAM13DNA載體的特點(diǎn)點(diǎn)：使克隆的DNA片段以特定定單鏈的形形式輸出受受體細(xì)胞外外這在DNA定向突變中中非常有用用M13重組分子篩篩選簡便被M13噬菌體感染染的受體細(xì)細(xì)胞生長緩緩慢，形成成混濁斑，易于于辨認(rèn)挑選選。而且重重組分子越越大，混濁濁斑的混濁度度亦越大但M13-DNA載體的最大大缺陷是裝裝載量小，，只有1.5kb噬菌體或病病毒DNA與動(dòng)植物受受體細(xì)胞相相適應(yīng)的載載體一般選選擇相應(yīng)動(dòng)動(dòng)植物的病病毒基因組DNA。動(dòng)植物病毒毒種類繁多多，每一種種動(dòng)植物都都有多種特特異性的病病毒。按照基基因組的結(jié)結(jié)構(gòu)，可將將動(dòng)植物病病毒分成四四大類：單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自自我復(fù)制制時(shí)大多多存在相相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)應(yīng)物，這些中間間體可作作為載體體進(jìn)行常常規(guī)的DNA重組?？妓官|(zhì)粒粒與噬菌菌粒l-DNA載體和M13-DNA載體的裝裝載量最最大分別別為25kb和1.5kb，但在很多多情況下下，往往往需要克隆更大大的外源源DNA片段，考斯質(zhì)粒粒和噬菌菌粒載體體的構(gòu)建建就是為為了進(jìn)一一步提高高噬菌體體DNA的裝載量量。在包裝上上限固定定的條件件下，大大幅度縮縮短噬菌菌體DNA的長度，，就能同步步增加載載體的裝裝載能力力。將噬噬菌體DNA與包裝有有關(guān)的序序列與質(zhì)粒粒組裝在在一起，，既能最最大限度度地縮短短載體的的長度，，同時(shí)又能保證證重組DNA分子在體體外仍被被包裝成成有感染染力的顆顆粒，這這便是構(gòu)建建考斯質(zhì)質(zhì)粒和噬噬菌粒載載體的思思路。當(dāng)當(dāng)然，由由于考斯斯質(zhì)粒和噬菌粒粒不再攜攜帶包裝裝蛋白基基因，因因此重組組DNA分子在細(xì)細(xì)胞內(nèi)不能形成成噬菌體體顆粒。?？妓官|(zhì)粒粒與噬菌菌粒考斯質(zhì)粒粒（cosmid））考斯質(zhì)粒粒載體的的構(gòu)建：：考斯質(zhì)粒粒是一類類人工構(gòu)構(gòu)建的含含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制制子的特殊類型型的載體體cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍圍為31-45kb考斯質(zhì)粒粒與噬菌菌?？妓官|(zhì)粒粒（cosmid））考斯質(zhì)粒粒載體的的特點(diǎn)：：能像l-DNA那樣進(jìn)行行體外包包裝，并并高效轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染受體體細(xì)胞裝載量大（45kb）且克隆片段具具有一定的大大小范圍能像質(zhì)粒那樣樣在受體細(xì)胞胞中自主復(fù)制重組操作簡便便，篩選容易易不能體內(nèi)包裝裝，不裂解受體細(xì)胞考斯質(zhì)粒與噬噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒載體的的特點(diǎn)：噬菌粒是一類類人工構(gòu)建的的含有單鏈?zhǔn)墒删w包裝序列、復(fù)復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、、克隆位點(diǎn)、、標(biāo)記基因的的特殊類型的的載體能像M13-DNA那樣體外包裝裝，并高效轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞胞裝載量比常規(guī)規(guī)的M13mp系列要大很多多（10kb）能像質(zhì)粒那樣樣在受體細(xì)胞胞中自主復(fù)制重組操作簡便便，篩選容易易通過克隆雙鏈鏈DNA能獲得同等長長度的單一單單鏈DNA考斯質(zhì)粒與噬噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒粒載體：pUC118/119pUC118pUC18+M13間隔區(qū)IGpUC119pUC19+M13間隔區(qū)IG500個(gè)拷貝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13輔助噬菌體DNA考斯質(zhì)粒與噬噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒粒載體：pBluescript體外轉(zhuǎn)錄載體體pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動(dòng)子子PT3和PT7強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄錄提取出來的單單鏈DNA重組分子在噬菌體RNA聚合酶的存在下，又可實(shí)實(shí)現(xiàn)外源基因因的體外轉(zhuǎn)錄人造染染色體體載體體人類、、動(dòng)物物、植植物的的全基基因組組序列列分析析往往往需要克隆數(shù)數(shù)百甚至上上千kb的DNA片段，，此此時(shí)考考斯質(zhì)質(zhì)粒和和噬菌菌粒載載體的的裝載載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不不能滿滿足需需要。。將細(xì)菌菌接合合因子子或酵酵母菌菌染色色體上上的復(fù)復(fù)制區(qū)區(qū)、分分配區(qū)區(qū)、穩(wěn)穩(wěn)定區(qū)與與質(zhì)粒粒組裝裝在一一起，，即可可構(gòu)成成染色色體載載體。。當(dāng)大大片段段的外外源DNA克隆在在這些些染色色體載載體上上后，，便形形成重重組人人造染染色體體，它能像像天然然染色色體那那樣，，在受受體細(xì)細(xì)胞中中穩(wěn)定定的復(fù)復(fù)制并并遺傳