2、《飼料添加劑中甘露寡糖的測(cè)定》 編制說明

四川省地方標(biāo)準(zhǔn)DB51/Txxxx-xxxx飼料添加劑中甘露寡糖的測(cè)定Determinationofmannanoligosaccharidesinfeedadditive—（送審稿）編制說明主要完成單位：四川省飼料工作總站《飼料添加劑中甘露寡糖的測(cè)定》編制說明（送審稿）標(biāo)準(zhǔn)制定背景及任務(wù)來源甘露寡糖又稱為甘露低聚糖，是從酵母培養(yǎng)細(xì)胞壁中提取的一類新型抗原活性物質(zhì)，典型機(jī)構(gòu)見圖1。由于它不僅具有低熱、穩(wěn)定、安全無(wú)毒等良好的理化性質(zhì)，還具有保護(hù)腸道和提高免疫力等作用，國(guó)外已將其作為飼料添加劑廣泛用于飼料工業(yè)。甘露寡糖廣泛存在于魔芋粉、瓜兒豆膠、田菁膠及多種微生物細(xì)胞壁內(nèi)，目前商品用甘露寡糖主要通過酶解法進(jìn)行生產(chǎn)，是從富含葡甘露寡糖(MOS)的酵母細(xì)胞壁中通過發(fā)酵法提取出來的葡甘露聚糖蛋白復(fù)合體。其中甘露寡糖主要為二、三和四糖等的混合物。它作為飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中時(shí)，可以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫能力，降低胃腸道疾病的發(fā)生率和死亡率，還能提高動(dòng)物的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，因此具有極大的發(fā)展?jié)摿?。甘露寡糖具有一定的免疫原性，能夠刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，而且它能與一定的毒素、病毒和真菌細(xì)胞的表面結(jié)合而作為這些外源抗原的佐劑(Adjuvants)，減緩抗原的吸收，增加抗原的效價(jià)，從而增強(qiáng)動(dòng)物體的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，也可通過刺激肝臟分泌甘露糖結(jié)合蛋白而影響免疫系統(tǒng)，這種蛋白質(zhì)能與細(xì)菌夾膜相粘接并觸發(fā)一連串的補(bǔ)體，從而啟動(dòng)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)。Kim等(2000)報(bào)道，甘露寡糖和β-葡聚糖均能加快仔豬已經(jīng)抑制了的免疫系統(tǒng)的恢復(fù)，并能有效的減少死亡率和降低腹瀉率。研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖能使肉雞膽汁中l(wèi)gA水平提高14.2％(Savvage等，1996a)，也可提高火雞腸粘膜中l(wèi)gA的水平，并顯著提高火雞血液中IgG的含量(Savvage等，1996b)。Spring(1998)研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖能夠顯著提高無(wú)菌仔豬血清與腸粘膜中l(wèi)gA、lgG和lgM的含量及血液中自細(xì)胞介素-2(IL-2)的水平，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞功能和小腸原始淋巴細(xì)胞的活性，增強(qiáng)小腸內(nèi)白細(xì)胞的吞噬能力和促進(jìn)激活的淋巴細(xì)胞釋放IFY-γ細(xì)胞素，后者可促使巨噬細(xì)胞、體液及蛋白質(zhì)移向感染部位，以及激活感染部位的巨噬細(xì)胞殺死吞噬的病原菌；對(duì)普通仔豬，甘露寡糖只是顯著提高了其血清lgA水平，而對(duì)lgG、lgM沒有明顯影響。甘露寡糖能夠顯著提高哺乳仔豬PHA-淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和吞噬細(xì)胞的吞噬能力(spring等，1997，1998；Ocarrca，1998；邵良平等，2000a)；顯著提高雞白細(xì)胞吞噬能力和PHA淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，有效改善雞腸道微生物環(huán)境并顯著減低大腸桿菌數(shù)和盲腸、回腸內(nèi)容物的pH值，并極顯著地提高雞血清中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活性(邵良平，2000b)。大量研究表明，甘露寡糖作為飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)時(shí)，能激活動(dòng)物的免疫反應(yīng)，提高肉雞、火雞、斷奶仔豬及犢牛的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，降低胃腸道疾病的發(fā)生率和死亡率。Vander(1997)和Dvorak(1998)試驗(yàn)證實(shí)，甘露寡糖能提高仔豬日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，其原因可能是其提高了仔豬的免疫力，抑制了病原菌在胃腸道的增殖。Newman等(1993，1995)和Dilday等(1997)報(bào)道，甘露寡糖也能顯著提高犢牛的日增重，降低發(fā)病率。綜上所述，建立準(zhǔn)確檢測(cè)甘露寡糖的檢測(cè)方法能夠精準(zhǔn)指導(dǎo)生產(chǎn)，穩(wěn)定的檢測(cè)方法非常必要。本標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)來源于四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局，文件編號(hào)為川市監(jiān)函[2020]560號(hào)，任務(wù)名稱為《飼料添加劑中甘露寡糖的測(cè)定》。本標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)歸口單位是四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，主要起草單位是四川省飼料工作總站。參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)檢測(cè)方法，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果起草本標(biāo)準(zhǔn)。圖1.甘露寡糖的典型結(jié)構(gòu)二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則及主要工作內(nèi)容（一）標(biāo)準(zhǔn)編制主要原則本標(biāo)準(zhǔn)的編寫制定過程中以優(yōu)化測(cè)試方法的選擇性、準(zhǔn)確度、精密度、檢測(cè)限和分析效率為總原則，反映科學(xué)技術(shù)的先進(jìn)成果和先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)。使用性能的普遍性包括方法精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限等方面能滿足要求，確保標(biāo)準(zhǔn)既能保持技術(shù)上的先進(jìn)性，又具有經(jīng)濟(jì)上合理性。同時(shí)遵循了標(biāo)準(zhǔn)制定過程中的先進(jìn)性、經(jīng)濟(jì)性和適用性原則。在標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中嚴(yán)格遵循國(guó)家有關(guān)方針、政策、法規(guī)和規(guī)章，標(biāo)準(zhǔn)的編寫規(guī)則及表述按照《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》（GB/T1.1-2020）和《標(biāo)準(zhǔn)編制規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》（GB/T20001.4-2015）要求編寫，并參照了GB/T27404-2008和GB/T27417和GB/T23182-2008標(biāo)準(zhǔn)要求和編寫格式。在標(biāo)準(zhǔn)制定過程中力求做到：技術(shù)內(nèi)容的敘述正確無(wú)誤；文字表達(dá)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)明、易懂；標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)成嚴(yán)謹(jǐn)合理；內(nèi)容編排、層次劃分等符合邏輯與規(guī)定。（二）主要工作內(nèi)容接到標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)后，組織實(shí)驗(yàn)室相關(guān)人員對(duì)工作細(xì)節(jié)進(jìn)行分解安排，于2020年9-12月在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)庫(kù)，查閱相關(guān)產(chǎn)品中甘露寡糖測(cè)定的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和資料，初步制定了實(shí)驗(yàn)方案。2021年1月～2021年5月，初步擬定高效液相色譜儀的色譜條件、前處理?xiàng)l件、比較不同條件下對(duì)樣品提取、凈化和分離條件的優(yōu)化效果。2021年6月～2021年7月，根據(jù)擬定的優(yōu)化方案，按方法步驟逐一進(jìn)行條件優(yōu)化。2021年8月，色譜條件、前處理?xiàng)l件基本確定，為提高方法的穩(wěn)定性，又對(duì)方法中涉及的細(xì)節(jié)：如標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液、內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性和保存期進(jìn)行了測(cè)試分析，逐步確定了方法細(xì)節(jié)。2021年9月，對(duì)方法性能包括方法適用性、線性范圍、準(zhǔn)確度、精確度、定量限、檢測(cè)限和穩(wěn)健度等性能指標(biāo)進(jìn)行了考察，形成了方法征求意見稿。2022年1月，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿廣泛征求相關(guān)單位多位專家意見，并對(duì)意見進(jìn)行匯總，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明進(jìn)行修改，形成標(biāo)準(zhǔn)預(yù)審稿。2022年3月，四川省農(nóng)藥檢定所、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京）、四川威爾檢測(cè)技術(shù)股份有限公司3家單位對(duì)標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿進(jìn)行了方法的驗(yàn)證。三、主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù)和試驗(yàn)驗(yàn)證的分析（一）方法的建立1.分析方法確定根據(jù)文獻(xiàn)匯總分析后初步確定的檢測(cè)方法，進(jìn)行了提取條件和糖柱分離的色譜條件的優(yōu)化。線性范圍通過標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合判斷。標(biāo)準(zhǔn)曲線則使用標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液稀釋的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，設(shè)置5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。本方法采取甘露寡糖水解成甘露糖來進(jìn)行定量甘露寡糖的含量，關(guān)于甘露寡糖是否可以完全轉(zhuǎn)化為甘露糖的問題：一、甘露寡糖主要為二、三和四糖等的混合物，從結(jié)構(gòu)上或者是原理上來說，可以實(shí)現(xiàn)完全的轉(zhuǎn)化，二、通過甘露四糖標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)驗(yàn)，證明甘露四糖可以完全轉(zhuǎn)化。三、從行業(yè)方來說，甘露寡糖的品質(zhì)也是由甘露糖來評(píng)定的，統(tǒng)一的尺子可以到達(dá)衡量產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的作用。在制定方法定量限時(shí)，根據(jù)《化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制實(shí)施指南》（GB/T35655-2017）、《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T27417-2017）和《飼料中獸藥及其他化學(xué)物檢測(cè)試驗(yàn)規(guī)程》（GB/T23182-2008），檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）的考察先通過3倍信噪比和10倍信噪比初步計(jì)算出檢測(cè)限和定量限的可能值，然后通過實(shí)際添加回收結(jié)果確定LOQ，以回收率結(jié)果和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合要求的最低樣品添加濃度為L(zhǎng)OQ值。然后按LOQ的一半進(jìn)行計(jì)算LOD。準(zhǔn)確度和精密度采用低、中、高共3個(gè)添加濃度進(jìn)行測(cè)定，分析各添加濃度條件下甘露寡糖的添加回收率結(jié)果和變異系數(shù)。添加濃度的回收率范圍應(yīng)該在70~120%之間，結(jié)果的變異系數(shù)應(yīng)在20%以內(nèi)。2、優(yōu)化前處理?xiàng)l件2.1色譜條件的確定2.1.1色譜柱的確定液相色譜具有分離速度快、靈敏度高等特點(diǎn)，從標(biāo)準(zhǔn)共同使用和重復(fù)使用的基本要求，本實(shí)驗(yàn)選用靈敏度中等的Waters公司e2695進(jìn)行方法開發(fā)和驗(yàn)證，在方法研制過程中，我們選用BIO-RADAminexHPX-87P（7.8×300mm）色譜柱和WatersSugar-PakTM1（6.5×300mm）色譜柱進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩家公司的色譜柱峰型都很好，AminexHPX-8此色譜柱上甘露糖保留時(shí)間相對(duì)較早，但價(jià)格較貴。Waters的色譜柱無(wú)論是保留時(shí)間還是分離度也都可以滿足要求，本標(biāo)準(zhǔn)選用AminexHPX-87P（7.8×300mm）色譜柱進(jìn)行樣品的分離檢測(cè)。色譜圖見圖2。圖2甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖2.1.2流動(dòng)相的確定流動(dòng)相：AminexHPX-87P色譜柱的樹脂離子型為鉛型，基質(zhì)為磺化聚苯乙烯二乙烯苯，推薦的流動(dòng)相為水。pH使用范圍為5-9。在室溫環(huán)境下，對(duì)于已加熱的Aminex糖柱操作流速不能高于0.3ml/min。首先，維持較低的流速的同時(shí)加熱柱溫箱，然后當(dāng)柱溫達(dá)到推薦溫度后開始提升操作流速。Sugar-PakTM1此色譜柱由鈣基樹脂填裝而成,氫離子或其它離子會(huì)取代鈣離子,或是引起與柱中糖的置換,尤其是像蔗糖這樣易于置換的糖.因此推薦在流動(dòng)相中加入一定量的鈣離子來保持平衡和防止與樣品的置換，流動(dòng)相使用水或者EDTA鈣鹽溶液（50mg/L）。流速：Sugar-PakTM1和AminexHPX-87P色譜柱最大流速均不應(yīng)超過0.6ml/min，一般情況下在柱溫達(dá)到70℃時(shí),流速才增至0.6mL/min，Waters公司e2695的柱溫箱最高溫度為65℃，考慮標(biāo)準(zhǔn)方法的通用性和檢測(cè)的效率等，流速設(shè)為0.5mL/min，柱溫設(shè)為60℃。2.1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性考察對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。將2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分成若干份置于-20℃儲(chǔ)存，分別在配制當(dāng)天、儲(chǔ)存1個(gè)月、2個(gè)月和3個(gè)月后用水稀釋至200μg/mL，液相測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，取峰面積的平均值觀察重復(fù)性，以RSD≤5%結(jié)果有效。結(jié)果如圖3所示，甘露糖的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于-20℃下儲(chǔ)存，在3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定，無(wú)明顯降解和變化。本文件將標(biāo)準(zhǔn)貯備液的有效期定為3個(gè)月。圖3.甘露糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液穩(wěn)定性2.1.4樣品的前處理根據(jù)甘露寡糖的理化特性，本方法參考了文獻(xiàn)和生產(chǎn)企業(yè)的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)甘露寡糖前處理的方法，對(duì)水解時(shí)間45min、60min和75min進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，水解60min時(shí)目標(biāo)物峰形和回收率均較好，具體結(jié)果見圖4。最終前處理過程確定為：稱取試樣1g于10mL的具塞離心管中，加入6.0mL鹽酸，放置30℃水浴中水解45min，期間渦旋振蕩2次。將提取液全部轉(zhuǎn)入100mL帶刻度的試劑瓶中，用60mL水分3次洗滌離心管，洗滌液并入試劑瓶中，蓋上試劑瓶蓋。移至高壓滅菌鍋中，于121℃下水解理60min，取出冷卻至室溫，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至6～7，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，加水定容，混勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜儀測(cè)定。圖4優(yōu)化水解時(shí)間與平均回收率情況采用實(shí)際樣品比較了采用“加入6.0mL鹽酸后放置30℃水浴中水解45min”和不通過“放置30℃水浴中水解45min”直接移至高壓滅菌鍋中，于121℃下水解理60min。具體結(jié)果見表1，由表1結(jié)果可以看出，采用了“放置30℃水浴中水解45min”的結(jié)果明顯比不經(jīng)過“放置30℃水浴中水解45min”要高，特別是對(duì)于混合型飼料添加劑影響比較大。再增加工作量不大的情況下，本標(biāo)準(zhǔn)采用“加入6.0mL鹽酸后放置30℃水浴中水解45min”。表1前處理二步水解與一步水解比較結(jié)果情況樣品編號(hào)樣品名稱經(jīng)30℃水浴結(jié)果未30℃水浴結(jié)果備注1飼料添加劑22.3%20.2%經(jīng)30℃水浴優(yōu)2飼料添加劑22.9%21.5%經(jīng)30℃水浴優(yōu)3飼料添加劑22.7%21.8%經(jīng)30℃水浴優(yōu)4混合型飼料添加劑12.6g/kg10.5g/kg經(jīng)30℃水浴優(yōu)5混合型飼料添加劑12.7g/kg10.2g/kg經(jīng)30℃水浴優(yōu)6混合型飼料添加劑12.9g/kg11.7g/kg經(jīng)30℃水浴優(yōu)2.1.5干擾試驗(yàn)考察在糖柱條件下，其他類似糖分析方法的干擾。根據(jù)酵母細(xì)胞壁其他產(chǎn)物與甘露寡糖用途和性質(zhì)，我們選擇葡萄糖和半乳糖其作用類似物進(jìn)行干擾試驗(yàn)。在甘露糖的液相條件下，葡萄糖、半乳糖與甘露糖保留時(shí)間不一致，分離度達(dá)到要求。由此表明，葡萄糖和半乳糖對(duì)甘露糖的檢測(cè)沒有干擾。干擾試驗(yàn)的液相色譜圖見圖5。圖5.甘露糖干擾試驗(yàn)圖譜2.2方法學(xué)考察2.2.1線性精確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水稀釋，制得濃度分別為10μg/mL、50μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（臨用現(xiàn)配），由低濃度到高濃度供高效液相色譜儀測(cè)定。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性關(guān)系大于0.999，線性良好，見圖6。圖6.甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線2.2.2方法的靈敏度空白試樣（載體沸石粉）按相同步驟處理后，測(cè)定結(jié)果表明，在相應(yīng)的保留時(shí)間處，空白試料對(duì)所測(cè)藥物無(wú)干擾。檢測(cè)限（LOD）：添加1mg標(biāo)準(zhǔn)溶液（甘露四糖）于1g空白添加劑預(yù)混合飼料（載體蒙脫石）中，經(jīng)提取后測(cè)定，依據(jù)信噪比S/N≥3（按峰對(duì)峰計(jì)），考慮不同廠家不同型號(hào)儀器的靈敏度差異，擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)方法的適用范圍，在添加劑預(yù)混合飼料中的檢測(cè)限為1000mg/kg。定量限（LOQ）：添加2mg標(biāo)準(zhǔn)溶液（甘露四糖）于1g空白添加劑預(yù)混合飼料（載體蒙脫石）中，依據(jù)信噪比S/N≥10（按峰對(duì)峰計(jì)），考慮不同廠家不同型號(hào)儀器的靈敏度差異，擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)方法的適用范圍，在添加劑預(yù)混合飼料中的定量限為2000mg/kg。2.2.3方法的準(zhǔn)確度和精密度考察本方法采用飼料添加劑實(shí)際樣品中添加甘露四糖，考察了甘露寡糖在飼料添加劑中的添加回收情況；采用標(biāo)準(zhǔn)添加法考察了甘露寡糖在添加劑預(yù)混合飼料中的添加回收情況。結(jié)合甘露寡糖的使用量，在空白飼料中載體沸石粉、載體蒙脫石及實(shí)際樣品中添加3個(gè)不同水平2.0g/kg、10g/kg、200g/kg的甘露寡糖進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，添加濃度的回收率范圍在80.1~106.5%之間，結(jié)果的變異系數(shù)小于8.6%。計(jì)算結(jié)果見表2~5。表2飼料添加劑中甘露寡糖添加回收率試驗(yàn)結(jié)果添加濃度測(cè)定批次回收率（%）平均回收率批內(nèi)RSD批間RSD（%）12345（%）（%）（%）5Ⅰ89.188.789.295.395.391.53.85.7Ⅱ85.292.189.293.388.289.63.6Ⅲ99.693.286.899.8103.296.56.810Ⅰ95.386.395.095.894.293.34.34.8Ⅱ93.197.290.697.194.394.53.0Ⅲ82.797.893.189.299.192.47.220Ⅰ85.492.295.390.285.889.84.75.5Ⅱ89.392.392.593.694.592.42.1Ⅲ91.5104.386.597.798.195.67.1表3混合型飼料添加劑中甘露寡糖添加回收率試驗(yàn)結(jié)果（蒙脫石）添加濃度測(cè)定批次回收率（%）平均回收率批內(nèi)RSD批間RSD（g/kg）12345（%）（%）（%）2Ⅰ89.588.483.99585.188.44.93.9Ⅱ87.892.386.589.193.989.93.4Ⅲ94.393.589.389.186.190.53.820Ⅰ92.1102.391.8105.193.196.96.57.4Ⅱ103.587.597.198.784.894.38.4Ⅲ92.9107.0100.186.389.595.28.8200Ⅰ95.592.696.1100.889.794.94.44.7Ⅱ95.7101.3102.898.3104.2100.53.4Ⅲ101.790.6100.397.5103.698.75.1表4混合型飼料添加劑中甘露寡糖添加回收率試驗(yàn)結(jié)果（沸石粉）添加濃度測(cè)定批次回收率（%）平均回收率批內(nèi)RSD批間RSD（g/kg）12345（%）（%）（%）2Ⅰ96.699.793.5103.495.497.74.05.0Ⅱ103.192.389.597.1101.496.76.0Ⅲ99.1103.599.3103.289.899.05.620Ⅰ95.6107.1101.895.396.799.35.16.1Ⅱ93.887.9103.193.194.194.45.8Ⅲ102.987.790.796.489.793.56.6200Ⅰ95.1102.3105.190.789.496.57.26.4Ⅱ90.191.592.881.394.290.05.7Ⅲ91.597.387.397.198.194.35.0表5混合型飼料添加劑中甘露寡糖添加回收率試驗(yàn)結(jié)果（實(shí)際樣品）添加濃度測(cè)定批次回收率（%）平均回收率批內(nèi)RSD批間RSD（g/kg）12345（%）（%）（%）2Ⅰ106.598.493.1105.495.299.76.08.5Ⅱ92.899.496.789.588.393.35.0Ⅲ82.186.288.380.185.484.43..920Ⅰ92.492.5101.795.5103.497.15.34.1Ⅱ103.4105.3104.598.3101.5102.62.7Ⅲ102.9102.1100.1102.3102.7102.01.1200Ⅰ105.392.696.1100.889.196.86.66.7Ⅱ90.591.882.7101.594.792.27.4Ⅲ88.190.890.887.7101.391.76.0（注：實(shí)際樣品的回收率計(jì)算時(shí)扣除實(shí)際樣品中的含量。）2.3實(shí)際樣品檢測(cè)根據(jù)所建立的檢測(cè)方法對(duì)市售不同規(guī)格的添加劑預(yù)混合飼料進(jìn)行甘露寡糖的檢測(cè)，共計(jì)21份，具體結(jié)果見表6。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一份添加劑預(yù)混合飼料的甘露寡糖未檢出，質(zhì)控的回收率符合實(shí)驗(yàn)要求。表6實(shí)際樣品中甘露寡糖檢測(cè)結(jié)果情況編號(hào)名稱標(biāo)示量檢測(cè)結(jié)果備注Y1甘露寡糖（添加劑）20%22.1%合格Y2甘露寡糖（添加劑）20%21.8%合格Y3甘露寡糖（添加劑）20%22.5%合格Y4甘露寡糖（添加劑）5%5.6%合格Y5甘露寡糖（添加劑）5%6.2%合格Y6甘露寡糖（添加劑）5%5.8%合格Y7甘露寡糖（添加劑）10%11.3%合格Y8甘露寡糖（添加劑）10%12.5%合格Y9甘露寡糖（添加劑）40%43.1%合格Y10甘露寡糖（添加劑）40%42.8%合格Y11甘露寡糖（混合型）30g/kg35.8g/kg合格Y12甘露寡糖（混合型）30g/kg36.1g/kg合格Y13甘露寡糖（混合型）30g/kg33.5g/kg合格Y14甘露寡糖（混合型）30g/kg未檢出不合格Y15甘露寡糖（混合型）50g/kg52.6g/kg合格Y16甘露寡糖（混合型）50g/kg51.5g/kg合格Y17甘露寡糖（混合型）10g/kg11.8g/kg合格Y18甘露寡糖（混合型）10g/kg12.3g/kg合格Y19甘露寡糖（混合型）0.5%0.57%合格Y20甘露寡糖（混合型）0.5%0.62%合格Y21甘露寡糖（混合型）10g/kg12.5g/kg合格2.4方法驗(yàn)證情況方法經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所、四川省農(nóng)藥檢定所和四川威爾檢測(cè)技術(shù)股份有限公司3家單位進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室間的方法驗(yàn)證，對(duì)方法進(jìn)行了空白飼料基質(zhì)在3個(gè)濃度添加水平上的回收試驗(yàn)，三個(gè)單位進(jìn)行了復(fù)核試驗(yàn)，以進(jìn)行本方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性驗(yàn)證。復(fù)核實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：該標(biāo)準(zhǔn)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.999，回收率范圍在69.3%～110.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10.9％，方法檢出限、定量限可滿足本方法要求，該方法通過驗(yàn)證。四、與國(guó)際、國(guó)外同類標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容的對(duì)比情況本標(biāo)準(zhǔn)為化學(xué)分析方法標(biāo)準(zhǔn)，與國(guó)際、國(guó)外同類標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容基本一致，并不涉及有關(guān)國(guó)家安全、保護(hù)人體健康和人身財(cái)產(chǎn)安全、環(huán)境質(zhì)量要求等有關(guān)強(qiáng)制性地方標(biāo)準(zhǔn)或強(qiáng)制性條文等的八項(xiàng)要求之一，建議將其作為推薦性標(biāo)準(zhǔn)頒布實(shí)施。五、采標(biāo)情