m第十四章基因工程

臨床床醫(yī)醫(yī)學(xué)學(xué)院院生生物物化化學(xué)學(xué)教教研研室室佘集集凱凱基因因重重組組和和基基因因工工程程第十十四四章章目錄錄第一一節(jié)節(jié)DNA的重重組組DNARecombinationDNA重重組組細(xì)菌菌的的基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移與與重重組組接合合作作用用、、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化作作用用、、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)作作用用轉(zhuǎn)座座重重組組同源源重重組組特異異位位點(diǎn)點(diǎn)的的重重組組發(fā)生生在在同同源源序序列列間間的的重重組組稱稱為為同源源重重組組，又又稱稱基本本重重組組。是是最最基基本本的的DNA重重組組方方式式，，通通過過鏈鏈的的斷斷裂裂和和再再連連接接，，在在兩兩個(gè)個(gè)DNA分分子子同同源源序序列列間間進(jìn)進(jìn)行行單單鏈鏈或或雙雙鏈鏈片片段段的的交交換換。。以E.coli的同源源重組為為例，了了解同源源重組機(jī)機(jī)制的Holliday模型型。一、同源源重組Holliday模型型中，同同源重組組主要4個(gè)關(guān)鍵鍵步驟①兩個(gè)同同源染色色體DNA排列列整齊②一個(gè)DNA的的一條鏈鏈斷裂、、并與另另一個(gè)DNA對對應(yīng)的鏈鏈連接，，形成Holliday中間間體③通過分分支移動(dòng)動(dòng)產(chǎn)生異異源雙鏈鏈DNA④Holliday中中間體切切開并修修復(fù)，形形成兩個(gè)個(gè)雙鏈重重組體DNA，，分別為為：片段重組體拼接重組體

內(nèi)切酶(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄片段重組組體：切開的鏈鏈與原來來斷裂的的是同一一條鏈，，重組體體含有一一段異源源雙鏈區(qū)區(qū)，其兩兩側(cè)來自自同一親親本DNA。拼接重組組體：切開的鏈鏈并非原原來斷裂裂的鏈，，重組體體異源雙雙鏈區(qū)的的兩側(cè)來來自不同同親本DNA。。Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組組體拼接重組組體目錄二、細(xì)菌菌的基因因轉(zhuǎn)移與與重組接合作用用轉(zhuǎn)化作用用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用用細(xì)胞融合合（一）接接合作用用當(dāng)細(xì)胞或細(xì)菌菌通過菌毛相相互接觸時(shí)，，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至另一細(xì)細(xì)胞（細(xì)菌）），這種DNA轉(zhuǎn)移稱為為接合作用。質(zhì)?！?xì)菌染色體外外的小型環(huán)狀狀雙鏈DNA分子可接合質(zhì)粒如如F因子子(Ffactor)（二）轉(zhuǎn)化作作用通過自動(dòng)獲取取或人為地供供給外源DNA，使細(xì)胞胞或培養(yǎng)的受受體細(xì)胞獲得得新的遺傳表表型，稱為轉(zhuǎn)化作用。例：溶菌時(shí)，裂解解的DNA片片段被另一細(xì)細(xì)菌攝取。目錄（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被被感染的細(xì)細(xì)胞（供體體）釋放出出來、再次次感染另一一細(xì)胞（受受體）時(shí)，，發(fā)生在供供體細(xì)胞與與受體細(xì)胞胞之間的DNA轉(zhuǎn)移移及基因重重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。λ噬菌體的的生活史溶菌生長途途徑溶源菌生長長途徑例目錄目錄三、位點(diǎn)特特異重組位點(diǎn)特異重重組是由整合酶酶催化，在在兩個(gè)DNA序列的的特異位點(diǎn)點(diǎn)間發(fā)生的的整合。例（一）λ噬菌體DNA的整整合λ噬菌體的的整合酶識識別噬菌體體和宿主染染色體的特特異靶位點(diǎn)點(diǎn)發(fā)生選擇擇性整合；；反轉(zhuǎn)錄病病毒整合酶酶可特異地地識別、整整合反轉(zhuǎn)錄錄病毒cDNA的長末端重復(fù)復(fù)序列(LTR)。例（二）細(xì)菌菌的特異位位點(diǎn)重組鼠傷寒沙門門桿菌H片片段倒位決決定鞭毛相相轉(zhuǎn)變hix為反向重復(fù)復(fù)序列，它它們之間的的H片段可可在Hin控制下進(jìn)進(jìn)行特異位位點(diǎn)重組(倒位)。。H片段上上有兩個(gè)啟啟動(dòng)子P，，其一驅(qū)動(dòng)動(dòng)hin基因表達(dá)，，另一正向向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表表達(dá)，反向向(倒位)時(shí)H2和和rH1不不表達(dá)。rH1為H1的阻遏遏蛋白基因因。H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段H1鞭毛素沙門氏菌H片段倒位位決定鞭毛毛相轉(zhuǎn)變hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列hinH2IH1例（三）免疫疫球蛋白基基因的重排排免疫球蛋白白(Ig)，由兩條條輕鏈(L鏈)和兩兩條重鏈(H鏈)組組成，分別別由三個(gè)獨(dú)獨(dú)立的基因因族編碼，，其中兩個(gè)個(gè)編碼輕鏈鏈(和)，一個(gè)編編碼重鏈。。輕鏈的基因因片段：重鏈的基因因片段：LVJCLVDJC重鏈(IgH)基因因的V-D-J重排排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排排均發(fā)生在在特異位點(diǎn)點(diǎn)上。在V片段的下下游，J片片段的上游游以及D片片段的兩側(cè)側(cè)均存在保保守的重組組信號序列列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的的重組酶基基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個(gè)個(gè)，分別產(chǎn)產(chǎn)生蛋白質(zhì)質(zhì)RAG1和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號序列基因片段V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯酯反應(yīng)單鏈切開轉(zhuǎn)移核苷酸酸修復(fù)、連接接免疫球蛋白白基因重排排過程目錄四、轉(zhuǎn)座重重組由插入序列列和轉(zhuǎn)座子子介導(dǎo)的基基因移位或或重排稱為為轉(zhuǎn)座(transposition)。典型的插入入序列(IS)組成：二個(gè)分離的的反向重復(fù)復(fù)(IR)序列一個(gè)轉(zhuǎn)座酶酶（transposase)編碼基基因特有的正向向重復(fù)序列列IRTransposaseGeneIR發(fā)生形式：：保守性轉(zhuǎn)座座復(fù)制性轉(zhuǎn)座座（一）插入入序列轉(zhuǎn)座座插入序列的的復(fù)制性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座目錄轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一一個(gè)染色體體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移移到另一位位點(diǎn)的分散散重復(fù)序列列。轉(zhuǎn)座子組成成：反向重復(fù)序序列轉(zhuǎn)座酶編碼碼基因抗生素抗性性等有用的的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座座子轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座座目錄第二節(jié)節(jié)重重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique重組DNA技術(shù)的發(fā)發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜雜交試驗(yàn)1944年年O.T.Avery的的肺炎球菌菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)1973年年美國國斯坦福大大學(xué)的科學(xué)學(xué)家構(gòu)建第一一個(gè)個(gè)重組組DNA分分子子1977年年美美國國南南舊舊金金山山由由博博耶耶和和斯斯旺旺森森建建立立世世界界上上第一一家家遺傳傳工工程程公公司司，，專專門門應(yīng)應(yīng)用用重重組組DNA技技術(shù)術(shù)制制造造醫(yī)醫(yī)學(xué)學(xué)上上重重要要的的藥藥物物。。1980年年開開始始建建造造第一一家家應(yīng)用用重重組組DNA技技術(shù)術(shù)生生產(chǎn)產(chǎn)胰胰島島素素的的工工廠廠1997年年英英國國羅羅林林研研究究所所成成功功的的克克隆隆了了多莉莉相關(guān)關(guān)概概念念DNA克克隆隆工具具酶酶目的的基基因因基因因載載體體基本本原原理理重組組DNA技技術(shù)術(shù)與與醫(yī)醫(yī)學(xué)學(xué)的的關(guān)關(guān)系系本節(jié)節(jié)主主要要內(nèi)內(nèi)容容一、重組DNA技術(shù)相關(guān)關(guān)概念克隆(clone)來自同一始祖祖的相同副本本或拷貝的集集合。獲取同一拷貝貝的過程稱為為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆技術(shù)水平：分子克隆即即DNA克隆隆細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)動(dòng)物或植物））DNA克隆隆應(yīng)用酶酶學(xué)的的方法法，在在體外外將各各種來來源的的遺傳傳物質(zhì)質(zhì)（同同源的的或異異源的的、原原核的的或真真核的的、天天然的的或人人工的的DNA））與載載體DNA接合合成一一具有有自我我復(fù)制制能力力的DNA分子子———復(fù)制制子，，繼而而通過過轉(zhuǎn)化化或轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染宿宿主細(xì)細(xì)胞，，篩選選出含含有目目的基基因的的轉(zhuǎn)化化子細(xì)細(xì)胞，，再進(jìn)進(jìn)行擴(kuò)擴(kuò)增提提取獲獲得大大量同同一DNA分子子。也也稱基因克克隆或或重組組DNA。生物技技術(shù)工工程:基因工工程、、蛋白白質(zhì)工工程、、酶工工程、、細(xì)胞胞工程程等目的①分分離獲獲得某某一感感興趣趣的基基因或或DNA②獲獲得感感興趣趣基因因的表表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物（（蛋白白質(zhì)））基因工工程(geneticengineering)——實(shí)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)基因因克隆隆所用用的方方法及及相關(guān)關(guān)的工工作稱稱基因因工程程，又又稱重組DNA工藝藝學(xué)。（二））工具具酶限制性性核酸酸內(nèi)切切酶DNA聚合合酶ⅠⅠ逆轉(zhuǎn)錄錄酶T4DNA連接接酶堿性磷磷酸酶酶末端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶酶TaqDNA聚合合酶重組DNA技術(shù)術(shù)中常常用的的工具具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性性核酸酸內(nèi)切切酶定義限制性性核酸酸內(nèi)切切酶(RE)是識別DNA的特特異序序列,并并在識識別位位點(diǎn)或或其周周圍切切割雙雙鏈DNA的一一類內(nèi)內(nèi)切酶酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用與甲基基化酶酶共同同構(gòu)成成細(xì)菌菌的限限制-修飾飾系統(tǒng)統(tǒng)，限限制外外源DNA，保保護(hù)護(hù)自身身DNA。。分類Ⅰ、Ⅱ、ⅢⅢ（基因工程程技術(shù)中常常用Ⅱ型））第一個(gè)字母母取自產(chǎn)生生該酶的細(xì)細(xì)菌屬名，，用大寫；；第二、第三三個(gè)字母是是該細(xì)菌的的種名，用用小寫；第四個(gè)字母母代表株；；用羅馬數(shù)字字表示發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的先后次次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿桿菌d株的第三種種酶Ⅱ類酶識別別序列特點(diǎn)點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)構(gòu)(palindrome)切口：：平端切口口、粘端切口口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口口粘端切口口同功異源源酶來源不同同的限制制酶，但但能識別別和切割割同一位位點(diǎn)，這這些酶稱稱同功異源源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制制性內(nèi)切切酶雖然然識別序序列不完完全相同同，但切切割DNA后，，產(chǎn)生相相同的粘粘性末端端，稱為為同尾酶。這兩個(gè)個(gè)相同的的粘性末末端稱為為配伍未端端。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA（三）目的基基因cDNA基因組DNA目的基因①分離獲得得某一感興趣趣的基因或DNA②獲得感興興趣基因的表表達(dá)產(chǎn)物（蛋蛋白質(zhì)）（四）基因載載體定義為攜帶目的基基因，實(shí)現(xiàn)其其無性繁殖或或表達(dá)有意義義的蛋白質(zhì)所所采用的一些些DNA分子子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的外外源DNA序序列被擴(kuò)增而而特意設(shè)計(jì)的的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外外源DNA序序列可轉(zhuǎn)錄翻翻譯成多肽鏈鏈而特意設(shè)計(jì)計(jì)的載體稱為為表達(dá)載體。載體的選擇標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；；具有兩個(gè)以上上的遺傳標(biāo)記記物，便于重重組體的篩選選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（（外源DNA插入點(diǎn)），，常具有多個(gè)個(gè)單一酶切位位點(diǎn)，稱為多多克隆位點(diǎn)；；分子量小，以以容納較大的的外源DNA。1.質(zhì)粒(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞胞內(nèi)獨(dú)立自主主復(fù)制；帶有有某些遺傳信信息,會(huì)賦賦予宿主細(xì)胞胞一些遺傳性性狀。目錄λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)統(tǒng)λgt系列（（插入型，適適用cDNA克?。〦MBL系列列（置換型，，適用基因組組克?。?.噬菌體體(phage)M13噬菌體體DNA改造造系統(tǒng)（含lacZ基因因）M13mp系系列pUC系列M13噬菌體體pUC系列列的物理圖譜譜3.粘性質(zhì)質(zhì)粒(cosmid)酵母人工染色色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載載體（如腺病毒，，腺病毒相關(guān)關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病毒）其他二、重組DNA技術(shù)基本本原理克隆基本過程目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程目錄（一）目的基基因的獲取1.化學(xué)合合成法要求：已知目目的基因的核核苷酸序列或或其產(chǎn)物的氨氨基酸序列。。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)（見第22章章）*1、化學(xué)學(xué)合成法獲取取目的基因由已知氨基酸酸序列推測可可能的DNA序列組織或細(xì)胞染染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分分子含重組分子的的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)細(xì)胞內(nèi)由克隆隆載體所攜帶帶的所有基因因組DNA的的集合*2、從基基因組DNA文庫獲取目目的基因目錄限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*3、從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄（二）克隆載載體的選擇和和構(gòu)建（三）外源基基因與載體的的連接1.粘性末末端連接方式：(1)同一限限制酶切位點(diǎn)點(diǎn)連接(2)不同限限制酶切位點(diǎn)點(diǎn)連接配伍末端連接接非配伍末端連連接BamHⅠ切割反應(yīng)應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4DNA連接酶酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切切位點(diǎn)連接目錄BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA不同限制酶切切位點(diǎn)（配伍伍末端）的連連接配伍末端的連連接情況和同同一限制酶切切位點(diǎn)連接相相似。不同限制酶切切位點(diǎn)（非配配伍末端）的的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體目錄2.平端連連接適用于：限制性內(nèi)切酶酶切割產(chǎn)生的的平端粘端補(bǔ)齊或切切平形成的平平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄3.同聚物物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶酶(terminaltransferase)的作用下，在在DNA片段段末端加上同同聚物序列、、制造出粘性性末端，再進(jìn)進(jìn)行粘端連接接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄4.人工接接頭(linker)連接由平端加上新新的酶切位點(diǎn)點(diǎn)，再用限制制酶切除產(chǎn)生生粘性末端，，而進(jìn)行粘端端連接。人工接頭及其其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄受體菌條件安全宿主菌（從大腸桿菌菌K-12改改造）限制酶和重組組酶缺陷處于感受態(tài)導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染感染（四）重組DNA導(dǎo)入受受體菌（五）重組體體的篩選1.直接接選選擇擇法法(1)抗藥藥性性標(biāo)標(biāo)記記選選擇擇(2)標(biāo)標(biāo)志志補(bǔ)補(bǔ)救救(markerrescue)(3)分分子子雜雜交交法法原位位雜雜交交Southern印印跡跡2.免免疫疫學(xué)學(xué)方方法法如免免疫疫化化學(xué)學(xué)方方法法及及酶酶免免檢檢測測分分析析等等(插插入入失失活活法法)抗藥藥性性標(biāo)標(biāo)記記選選擇擇目錄錄組氨氨酸酸缺缺陷陷型大大腸腸桿桿菌菌無組組氨氨酸酸的培培養(yǎng)養(yǎng)基基酵母母咪咪唑唑甘甘油油磷磷酸脫脫水水酶酶基基因因促進(jìn)進(jìn)組組氨氨酸酸合合成成λDNA重組組體體標(biāo)志志補(bǔ)補(bǔ)救救目錄錄α互互補(bǔ)補(bǔ)目錄錄α互互補(bǔ)補(bǔ)的的檢檢測測目錄錄原位位雜雜交交目錄錄Southern印印跡跡目錄錄雞的的ββ肌肌球球蛋蛋白白的的克克隆隆和和檢檢出出目錄錄重組組DNA技技術(shù)術(shù)操操作作過過程程可可形形象象歸歸納納為為小結(jié)結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體重組組DNA技技術(shù)術(shù)操操作作的的主主要要步步驟驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄錄表達(dá)達(dá)體體系系的的建建立立表達(dá)達(dá)載載體體的的構(gòu)構(gòu)建建受體體細(xì)細(xì)胞胞的的建建立立表達(dá)達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物物的的分分離離純純化化（六六））克克隆隆基基因因的的表表達(dá)達(dá)1.原原核核表表達(dá)達(dá)體體系系（E.coli表表達(dá)達(dá)體體系系最最為為常常用用））標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)：：選擇擇標(biāo)標(biāo)志志強(qiáng)強(qiáng)啟啟動(dòng)動(dòng)子子翻譯譯調(diào)調(diào)控控序序列列多多接接頭頭克克隆隆位位點(diǎn)點(diǎn)E.coli表表達(dá)達(dá)體體系系的的不不足足不宜宜表表達(dá)達(dá)真真核核基基因因組組DNA不能能加加工工表表達(dá)達(dá)的的真真核核蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)表達(dá)達(dá)的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)常常形形成成不不溶溶性性包包涵涵體體(inclusionbody)很難難表表達(dá)達(dá)大大量量可可溶溶性性蛋蛋白白大鼠鼠胰胰島島素素原原cDNA的表表達(dá)達(dá)和和分分泌泌目錄錄優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)：：可表表達(dá)達(dá)克克隆隆的的cDNA及及真真核核基基因因組組DNA可適適當(dāng)當(dāng)修修飾飾表表達(dá)達(dá)的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)表達(dá)達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物物分分區(qū)區(qū)域域積積累累缺點(diǎn)點(diǎn)：：操作作技技術(shù)術(shù)難難、、費(fèi)費(fèi)時(shí)時(shí)、、經(jīng)經(jīng)濟(jì)濟(jì)轉(zhuǎn)染染———將表表達(dá)達(dá)載載體體導(dǎo)導(dǎo)入入真真核核細(xì)細(xì)胞胞的的過過程程方法法：：磷酸酸鈣鈣轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染染DEAE葡葡聚