現(xiàn)代分子技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用課件

現(xiàn)代分子技術(shù)在食品檢測

中的應(yīng)用主要內(nèi)容1PCR技術(shù)及其在食品檢測中的應(yīng)用2生物傳感器及其在食品檢測中的應(yīng)用3基因芯片及其在食品檢測中的應(yīng)用1PCR技術(shù)及其在食品檢測

中的應(yīng)用1953年沃森（Waston)和克里克（Crick)對威爾金斯（MauriceWilkins)DNA的X-射線衍射圖分析發(fā)現(xiàn)了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，奠定了現(xiàn)代分子生物研究的基礎(chǔ)。他們3人因此獲得了1962年的諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴(kuò)增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。ReactionConditionforaTypicalPCRAssay檢測常用的PCR技術(shù)普通PCR技術(shù)巢式、半巢式PCR技術(shù)：是一種提高靈敏度的方法。通過設(shè)計(jì)兩對引物，其中一對引物結(jié)合的位點(diǎn)在另有所一對引物擴(kuò)增的產(chǎn)物之中。多重PCR技術(shù)：設(shè)計(jì)一組引物，在一個PCR反應(yīng)過程中，對多個目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時熒光定量PCR(real—timequantitativepolymerasechainreaction，RQ-PCR)又稱熒光定量PCR：就在普通PCR儀的基礎(chǔ)上配備了一個激發(fā)和檢測的裝置，實(shí)時監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程。按照PCR反應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，結(jié)合相應(yīng)的算法，加入相應(yīng)的內(nèi)對照，對待測樣品中的目標(biāo)基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量。具體步驟細(xì)菌的培養(yǎng)和基因組DNA的提取接種于EMB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)，挑一單個菌落復(fù)接種到30ml相應(yīng)增菌液內(nèi)增菌，提取1ml菌液用甘油保存于-80℃?zhèn)溆谩?000r/min離心1min，收集沉淀。用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取3種細(xì)菌DNA，用紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度，分裝數(shù)管，-20℃保存?zhèn)溆?。單基因PCR擴(kuò)增及特異性和敏感性分析先對3種菌進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增，反應(yīng)體系：模板DNA，上、下游引物各1，dNTP，Taq酶，10×Taq酶bufer，MgC12溶液，其余用無菌的去離子水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件：95℃變性3min，94℃變性50S、54℃退火50S、72℃延伸50s，共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物在1.5％的凝膠上進(jìn)行電泳。將3個PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，然后進(jìn)行核苷酸序列測定，并與Genbank中發(fā)表的相應(yīng)序列進(jìn)行比較。PCR技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

1食品加工中外源DNA污染的檢測病原微生物的檢測摻假量的檢測2轉(zhuǎn)基因食品的檢測病原微生物的檢測常見食源性病原微生物的PCR檢測已有相應(yīng)的商品試劑盒出售。表1是一些應(yīng)用PCR技術(shù)檢測食物中病原微生物的成功例子。常見的食源性病原微生物的PCR檢測試劑盒主要有BioCon—trol公司的肉毒梭菌、大腸桿菌0157：H7、李斯特菌、沙門氏菌PCR檢測試劑盒(商品名Probelia)和Qual—icon公司的大腸桿菌0157：李斯特菌、沙門氏菌PCR檢測試劑盒(商品名BAX)等。大量研究表明，PCR技術(shù)在對食品中病原微生物的確證試驗(yàn)方面與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比至少具有相同的靈敏度，而多數(shù)情況下則表現(xiàn)出更高的靈敏度，而且檢測周期大為縮短。Aabo等對96個碎肉樣品中自然污染的沙門氏菌進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，一種PCR檢測方法的檢出率達(dá)到0.92，而由于樣品本身所攜帶的菌群的干擾，傳統(tǒng)方法漏掉了很多陽性樣品，檢出率僅為0.50。摻假量的檢測由于DNA比蛋白質(zhì)具有更高的熱穩(wěn)定性，與免疫學(xué)檢測技術(shù)相比，利用PCR分析時不需要特異性抗體。特異性抗體的制備時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于合成引物所需要的時間，所以RQ-PCR就成了檢測食品摻假量的一種優(yōu)勢選擇。SandbergM等人利用RQ—PCR定量檢測谷物基因來控制那些缺乏麥麩的嬰兒食物。轉(zhuǎn)基因植物所采用的啟動予主要為來源于花揶菜花葉病毒的Camv35S啟動子、根瘤農(nóng)桿菌的nos啟動子及玄參花葉病毒的FMV35s啟動子；廣泛應(yīng)用的終止子分別來源于根瘤農(nóng)桿菌的nos終止子、花揶菜花葉病毒的camv終止子以及新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶NPtⅡZ終止子。針對這些基因的PCR擴(kuò)增可涵蓋95％的現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因植物的需要。因此通過檢測樣品是否含有特定啟動子、終止子或標(biāo)志基因序列作為鑒別轉(zhuǎn)基因食品依據(jù)是一種可行方法。2生物傳感器及其在食品檢測中的應(yīng)用生物傳感器是一種新興的生物技術(shù)產(chǎn)品，在分析領(lǐng)域中具有極大的發(fā)展?jié)摿颓熬?，它是由生物活性物質(zhì)制成、制成的生物功能敏感元件，在配上適當(dāng)?shù)男盘栟D(zhuǎn)換器。生物活性物質(zhì)包括酶、抗原、抗體、細(xì)胞器、完整細(xì)胞、激素、核酸等。生物傳感器具有結(jié)構(gòu)緊湊、操作方便、檢測迅速、選擇性好、靈敏度高等特點(diǎn)，能夠從微量的試樣中測定其痕量物質(zhì)。生物傳感器的分類按生物敏感材料的不同分為：酶傳感器，免疫傳感器，微生物傳感器，細(xì)胞傳感器等。按轉(zhuǎn)換器的不同分為：電化學(xué)生物傳感器，光生物傳感器，聲波生物傳感器，仿生傳感器，生物量傳感器等。按生物反應(yīng)的基本原理分為：催化型和親和型生物傳感器。生物傳感器在食品檢測中的應(yīng)用病原菌的檢測抗生素殘留的檢測毒素的檢測國內(nèi)，盧智遠(yuǎn)等人研制成一種能快速測定乳制品中細(xì)菌含量的電化學(xué)生物傳感器，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該生物傳感器能有效的測定鮮奶中的微生物含量。蔡豪斌研制了一種電化學(xué)生物傳感器對大腸桿菌、啤酒酵母、霍亂弧菌及卡介菌苗的響應(yīng)，并實(shí)際測量了發(fā)酵罐中啤酒酵母菌總數(shù)及消毒鮮牛奶中的細(xì)菌總數(shù)?？股貧埩舻臋z測β-內(nèi)酰胺類抗生素(包括青霉素)常用來治療奶牛乳房炎，因此它是牛奶中最常見的抗生素殘留。2002年，Gustavsson等人用基于生物傳感器的表面等離子共振(SPR)設(shè)計(jì)了檢測牛奶中口一內(nèi)酰胺類抗生素的實(shí)驗(yàn)。他們將帶有羧肽酶活性的微生物受體蛋白用作探測分子，這種受體蛋白和抗體相比，其優(yōu)點(diǎn)是只能分辨出活性、完整的β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)。在β-內(nèi)酰胺類抗生素存在時，受體蛋白和抗生素之間形成穩(wěn)定的復(fù)合物，抑制了蛋白酶的活性，從而可以通過酶活性的降低值，定性地檢測出牛奶中的青霉素G。這種方法的檢測極限為2.6μg／kg，低于歐洲4μg／kg的最大殘留限(MRL)。3基因芯片及其在食品檢測中的應(yīng)用基因芯片(DNA芯片、DNA微陣列)技術(shù)是近十幾年來在生命科學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)，是一項(xiàng)基于基因表達(dá)和基因功能研究的革命性技術(shù)，他綜合了分子生物學(xué)、半導(dǎo)體微電子、激光、化學(xué)染料等領(lǐng)域的最新科學(xué)技術(shù)，在生命科學(xué)和信息科學(xué)之間架起了一道橋梁，是當(dāng)今世界上高度交叉、高度綜合的前沿學(xué)科和研究熱點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)的基本原理將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上的寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品靶分子的數(shù)量?；蛐酒谑称窓z測中的應(yīng)用在食品微生物檢測中的應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用在食品毒理學(xué)研究中的應(yīng)用在食品微生物檢測中的應(yīng)用DNA微陣列技術(shù)被廣泛用于食品的快速檢測，是因?yàn)镈NA微陣列技術(shù)可以確定某種病原體污染的特異分子標(biāo)志物，因?yàn)檫@些標(biāo)志物建立在成千上萬個基因之上，即使檢測結(jié)果只有部分符合這些標(biāo)志物也能反映病原體的一些特性，根據(jù)這些分子標(biāo)志物而制造的商業(yè)化DNA微陣列可以快速靈敏地檢測出病原體。DNA微陣列中廣泛應(yīng)用的標(biāo)志基因是16SrRNA，此外還包括rpoB、recA、gyrB、groEL和atpD等基因。AngelikaLehner等利用DNA微陣列成功地從牛奶中檢測出Enterococcusfaecium和Enterococcusfaecalis。GeorgiosKeramas等設(shè)計(jì)的DNA微陣列3h可以檢測6-60fg的Campylobacter基因組，而且成功地檢測并區(qū)分兩個親緣關(guān)系非常近的Campylobacterjejuni和Campylobactercoli。MasafumiIkeda等從新鮮蔬菜中檢測出SalmonellaentericaserovarEnteri—tidis、Yersiniaenterocolitica和Bacilluscereus。DNA微陣列技術(shù)可以在不同的水平上檢測轉(zhuǎn)基因生物的生理和代謝上的變化。如UKFoodsStandardsAgency已建立了西紅柿成熟的不同階段的cDNA文庫，由此制造的微陣列不僅可以檢測基因表達(dá)的變化，而且還可以檢測一些部分相關(guān)的代謝途徑的激活與否。DNA微陣列技術(shù)不僅可以檢測轉(zhuǎn)基因食品自身基因表達(dá)。還可以用來檢測食用轉(zhuǎn)基因食品的人或動物的基因表達(dá)，從而為轉(zhuǎn)基因食品的安全評價(jià)提供更全面、更準(zhǔn)確的依據(jù)。在食品毒理學(xué)研究中的應(yīng)用飲食補(bǔ)充劑和一些微量元素的使用已成為一個趨勢．這些補(bǔ)充劑的功效、安全性和劑量有待進(jìn)一步研究，飲食中的多種營養(yǎng)物和組分被認(rèn)為具有化學(xué)預(yù)防或抗癌作用，可以降低癌癥和其他退行性疾病和衰老的發(fā)生。已有詳實(shí)證據(jù)表明VA、VC、VE和β-胡蘿卜素具有抗癌作用，然而一些具有化學(xué)預(yù)防作用的物質(zhì)被大量食用時，會產(chǎn)生一