蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展課件

蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)組學(xué)的含義

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的手段

蛋白質(zhì)組信息學(xué)

差異蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組研究意義及前景蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展蛋白質(zhì)組學(xué)的含義1

講授內(nèi)容一、蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展（晏本菊）二、核酶、抗體酶（陳惠）三、蛋白質(zhì)定向進(jìn)化—DNAShuffling技術(shù)（陳惠）四、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、肽核酸（楊婉身）講授內(nèi)容一、蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展（晏本菊）2

生物化學(xué)專(zhuān)題主講教師楊婉身晏本菊陳惠生物化學(xué)專(zhuān)題主講教師楊婉身晏3蛋白質(zhì)組學(xué)的含義

蛋白質(zhì)組(Proteome)一詞最早由澳大利亞學(xué)者Ｗｉｌｋｉｎｓ等于1994年提出,指的是由一個(gè)基因組geneome或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有protein。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是在蛋白質(zhì)水平上定量、動(dòng)態(tài)、整體性地研究生物體。

同基因組學(xué)一樣,蛋白質(zhì)組學(xué)不是一個(gè)封閉的、概念化的、穩(wěn)定的知識(shí)體系,而是一個(gè)領(lǐng)域。它旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式,其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)定位、相互作用研究等,最終揭示蛋白質(zhì)功能,是基因組ＤＮＡ序列與基因功能之間的橋梁。蛋白質(zhì)組學(xué)的含義蛋白質(zhì)組(Proteome)4

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容蛋白質(zhì)表達(dá)模式(或蛋白質(zhì)組組成)的研究蛋白質(zhì)組組成的分析鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)中的與基因組學(xué)相對(duì)應(yīng)的主要內(nèi)容。它要求對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行表征,即實(shí)現(xiàn)所有蛋白質(zhì)的分離、鑒定及其圖譜化。雙向凝膠電泳(2-DＥ)和質(zhì)譜(Massspectrometry)技術(shù)是當(dāng)前分離鑒定蛋白質(zhì)的兩大支柱技術(shù)

蛋白質(zhì)組功能模式(目前主要集中在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系)的研究蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容蛋白質(zhì)表達(dá)模式(或蛋白質(zhì)組組成)5

原核及簡(jiǎn)單真核生物的蛋白質(zhì)組研究

流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究

大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究

致病微生物的蛋白質(zhì)組研究

釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究

原核及簡(jiǎn)單真核生物的蛋白質(zhì)組研究流感嗜血桿菌的蛋6

流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究

流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)是第一個(gè)獲得基因組全序列的生物.瑞士的一個(gè)小組通過(guò)2-DPAGE研究了流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組分,在ｐＨ3-10的范圍內(nèi)鑒定了約300個(gè)蛋白質(zhì)組分,然后用有兩個(gè)尿素濃度的麥黃酮(tricine)膠分離了很難分離到的5-20ku范圍內(nèi)的蛋白質(zhì),還鑒定了其中的80種.另外用肝素親和層析將堿性蛋白質(zhì)富集后,在ｐＨ6-11的范圍內(nèi)又鑒定了102個(gè)蛋白質(zhì),其中許多是核酸結(jié)合蛋白尤其是核糖體蛋白.華盛頓大學(xué)的另一個(gè)小組將雙向電泳得到的流感嗜血桿菌303個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,確定了263個(gè)蛋白質(zhì),其中大部分是外膜蛋白,以及與能量代謝和大分子合成相關(guān)的蛋白質(zhì).另外發(fā)現(xiàn)了幾種不能在基因組中找到對(duì)應(yīng)序列的蛋白質(zhì).令人驚奇的是,大約22%的被鑒定了的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與預(yù)計(jì)不同的等電點(diǎn)與分子質(zhì)量,顯示它們可能經(jīng)過(guò)了翻譯后加工.流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究7大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究

大腸桿菌全部4000多個(gè)基因的ＤＮＡ序列已被測(cè)定,人們想到如果把雙向電泳得到的蛋白質(zhì)譜與基因組分析結(jié)果聯(lián)合起來(lái),就會(huì)得到更多有用的信息.基于此想法,建立蛋白質(zhì)基因聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù),希望籍此來(lái)回答以下幾方面的問(wèn)題:ａ所有編碼基因的產(chǎn)物在雙向圖譜上的位置,ｂ各種蛋白質(zhì)的豐度,ｃ不同條件下各種蛋白質(zhì)表達(dá)水平及合成速率的變化,ｄ各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位,ｅ某些蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式及水平.目前,大腸桿菌的聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)已更新到第六版,大約包括1600個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的數(shù)據(jù),其中大約400個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)已與大約350個(gè)基因相對(duì)應(yīng)(有些基因可能有多個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物),對(duì)于這些蛋白質(zhì),這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可以提供基因名稱(chēng)、蛋白質(zhì)名稱(chēng)、EC編號(hào)、功能范疇、Swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)、Ｇenbank序列號(hào)、基因圖譜的位置、染色體上的轉(zhuǎn)錄方向以及一些生理信息(如在不同生長(zhǎng)條件下該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的豐度).大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究8致病微生物的蛋白質(zhì)組研究

蛋白質(zhì)組的一個(gè)重要應(yīng)用是在闡明新抗生素作用機(jī)理的研究上.當(dāng)今,細(xì)菌對(duì)大多數(shù)抗生素都有了抗性,尋找作用于細(xì)菌內(nèi)新的靶子的研究工作已經(jīng)展開(kāi),找到了許多有效的抗菌化合物.但目前遇到的困難在于難以揭示新的化合物的作用靶子及其作用機(jī)理.有時(shí)雖在體外發(fā)現(xiàn)新化合物能夠使某種蛋白質(zhì)失活,但在體內(nèi)是否有這種現(xiàn)象和這是否是抗菌的主要機(jī)制仍然未知,現(xiàn)在雙向電泳分析提供了一個(gè)有效手段.例如在研究抑制核糖體類(lèi)抗生素對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制時(shí),對(duì)12種作用于翻譯過(guò)程的不同階段和核糖體內(nèi)不同分子的抗生素加以考察,發(fā)現(xiàn)其中8種誘導(dǎo)冷休克反應(yīng)的一系列蛋白質(zhì),另4種誘導(dǎo)一系列熱休克反應(yīng)的蛋白質(zhì),因此預(yù)計(jì)新的作用于核糖體的化合物也是誘導(dǎo)這兩種反應(yīng),并且籍此可以推測(cè)大腸桿菌對(duì)冷熱的反應(yīng)發(fā)生于核糖體水平上.蛋白質(zhì)組研究的重要優(yōu)勢(shì)在于能夠從整體水平上分析不同條件下蛋白質(zhì)譜的變化.例如作為一種差異顯示技術(shù),這一技術(shù)已被用于比較結(jié)核分枝桿菌與牛結(jié)核分枝桿菌蛋白的不同,結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些在基因水平上很類(lèi)似的蛋白在蛋白質(zhì)水平上有很大差別,這可能部分解釋近年來(lái)牛痘作為結(jié)核病疫苗會(huì)出現(xiàn)失敗的現(xiàn)象

致病微生物的蛋白質(zhì)組研究9釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究

利用雙向電泳技術(shù)分析酵母蛋白譜的工作早于蛋白質(zhì)組概念的提出.釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因組的完成及其蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)在互聯(lián)網(wǎng)上的建立,大大加速了這一工作.最新版的數(shù)據(jù)庫(kù)包括6000多頁(yè),每頁(yè)代表一個(gè)已知或推測(cè)的酵母蛋白.它包含以下幾方面的信息:ａ以序列為基礎(chǔ)的已知和推測(cè)的酵母蛋白的特征信息,如分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、多肽片段大小等;ｂ一些研究得到的關(guān)于各種蛋白質(zhì)在翻譯后加工、亞細(xì)胞定位、功能分類(lèi)方面的信息;ｃ從以往的超過(guò)5000篇關(guān)于酵母蛋白研究的文章中獲得的有關(guān)各種蛋白質(zhì)功能、相互作用、突變表型的信息.借助數(shù)據(jù)庫(kù)的有力推動(dòng),在雙向電泳蛋白質(zhì)譜上最明顯的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的大部分得到鑒定.釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究10正在丹麥進(jìn)行的一項(xiàng)研究計(jì)劃分別作出野生型和將基因系統(tǒng)缺失的缺陷型酵母的雙向蛋白質(zhì)圖譜.初步的研究表明,缺失單一基因?qū)?dǎo)致的結(jié)果并不只是缺乏此基因編碼的蛋白質(zhì),而是能導(dǎo)致其他一系列蛋白質(zhì)量的改變.一些蛋白質(zhì)減少而另一些蛋白質(zhì)增多,當(dāng)然還有一些蛋白質(zhì)被加工修飾而導(dǎo)致性狀改變.單一基因缺失的結(jié)果總是引起蛋白質(zhì)組全局性的變化.大約20%的酵母基因缺失是致死性的,另外80%則不然,這時(shí)機(jī)體能通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)對(duì)抗這種內(nèi)源性的變化.這種基因缺失的研究可能會(huì)告訴我們一些關(guān)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子間相互“對(duì)話(huà)”和“作用”的重要信息,如蛋白質(zhì)間的物理聯(lián)系(這些蛋白質(zhì)可能會(huì)組成蛋白質(zhì)復(fù)合物)、信號(hào)傳遞途徑,以幫助我們了解細(xì)胞是如何構(gòu)成的以及是如何協(xié)同工作的。正在丹麥進(jìn)行的一項(xiàng)研究計(jì)劃分別作出野生型和將基因系統(tǒng)11

多細(xì)胞真核生物的蛋白質(zhì)組研究

線(xiàn)蟲(chóng)的蛋白質(zhì)組研究

果蠅的蛋白質(zhì)組研究人類(lèi)的蛋白質(zhì)組研究

植物的蛋白質(zhì)組研究多細(xì)胞真核生物的蛋白質(zhì)組研究12線(xiàn)蟲(chóng)的蛋白質(zhì)組研究利用雙向電泳技術(shù),Ｂini對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)(Ｃ.elegans)進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析,在等電點(diǎn)3.5-9和分子質(zhì)量10-200kｕ的范圍內(nèi)可分辨2000個(gè)以上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn),然后利用Ｅｄｍａｎ微量測(cè)序技術(shù)對(duì)其中24個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行分析,得到其中12個(gè)蛋白質(zhì)的Ｎ端序列.其余的由于Ｎ端封閉而未能測(cè)出序列.已測(cè)出的12個(gè)中有1個(gè)未能找到與其匹配的基因.另外11個(gè)與能量代謝、酸性核蛋白、Ｇ蛋白等對(duì)應(yīng).Ｃ.elegans的19000個(gè)基因已于1998年12月全部測(cè)出,預(yù)計(jì)會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)組的研究提供幫助線(xiàn)蟲(chóng)的蛋白質(zhì)組研究13果蠅的蛋白質(zhì)組研究

不同性別果蠅(Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ)成蟲(chóng)的頭、胸、腹部的蛋白質(zhì)組圖譜已被分別作出,總共約有1200個(gè)蛋白質(zhì)被檢出,其中的大多數(shù)在頭、胸、腹中是相同的,但也發(fā)現(xiàn)了一部分其部位、性別特異的蛋白質(zhì).果蠅的蛋白質(zhì)組研究14

人類(lèi)的蛋白質(zhì)組研究

人類(lèi)的蛋白質(zhì)組研究吸引了最多的注意力.由于人有著大量的組織、細(xì)胞類(lèi)型和發(fā)育階段,對(duì)人蛋白質(zhì)組的研究主要聚焦在特異的組織、細(xì)胞和疾病上.已有的證據(jù)表明,盡管人的不同組織有著很大的功能差別,但其中的許多蛋白質(zhì)是看家蛋白,因此它們的雙向圖譜可能也是近似的.這點(diǎn)與簡(jiǎn)單生物不同,簡(jiǎn)單生物在不同的發(fā)育階段有著極不相同的蛋白質(zhì)組.因此對(duì)于人類(lèi)來(lái)說(shuō),一個(gè)高質(zhì)量的基本的雙向圖譜是非常有用的,它可以作為其他組織、細(xì)胞的參照?qǐng)D譜.人的各種組織、器官、細(xì)胞乃至各種細(xì)胞器已被廣泛研究.人類(lèi)的蛋白質(zhì)組研究15植物的蛋白質(zhì)組研究植物的蛋白質(zhì)組研究16

人的各種體液(血液、淋巴、脊髓、乳汁和尿等)都被用于研究與某些疾病的關(guān)系.最近澳大利亞科學(xué)家利用雙向電泳技術(shù)研究眼淚中的蛋白質(zhì)與生理狀態(tài)的關(guān)系.他們發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì),這個(gè)蛋白質(zhì)非常相似于在乳腺癌細(xì)胞里高表達(dá)的另一種蛋白質(zhì).這個(gè)發(fā)現(xiàn)可能會(huì)提供疾病診治的新的手段.在一項(xiàng)利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)進(jìn)行的酒精對(duì)人體毒性的研究中發(fā)現(xiàn),乙醇會(huì)改變血清蛋白糖基化作用,導(dǎo)致許多糖蛋白的糖基缺乏,如轉(zhuǎn)鐵蛋白。人的各種體液(血液、淋巴、脊髓、乳汁和尿等17

腫瘤至今仍是人類(lèi)的一個(gè)頑敵.癌細(xì)胞不僅有許多特異蛋白質(zhì)產(chǎn)物,而且這些產(chǎn)物還會(huì)影響其他蛋白質(zhì)的翻譯后加工及許多蛋白質(zhì)的表達(dá)水平.腫瘤的蛋白質(zhì)組研究能提供一些以往其他技術(shù)所不能提供的早期診斷依據(jù),例如利用不同細(xì)胞組織的特征蛋白質(zhì)譜,可以判別一些難以判定來(lái)源的腫瘤細(xì)胞的來(lái)源.丹麥的一個(gè)小組利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)結(jié)合組織冰凍切片技術(shù)分析了150例膀胱癌病人的組織,發(fā)現(xiàn)在所有的鱗狀細(xì)胞瘤的尿液中均能發(fā)現(xiàn)一種化學(xué)引誘劑———銀屑素(ｐｓｏｒｉａｓｉｎ),推測(cè)其極可能作為這種腫瘤的早期標(biāo)志物.腫瘤至今仍是人類(lèi)的一個(gè)頑敵.癌細(xì)胞不僅有許多特異蛋白18

基因組計(jì)劃無(wú)疑為醫(yī)療、醫(yī)藥領(lǐng)域帶來(lái)一場(chǎng)革命,但也應(yīng)該看到,單純的遺傳分析很難診斷多因素的疾病.復(fù)雜的基因間相互作用,細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)和環(huán)境的影響都會(huì)影響基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的翻譯后加工.因此,可靠的診斷和治療應(yīng)基于機(jī)體漸進(jìn)發(fā)展過(guò)程的調(diào)控及失調(diào),并且必須考慮到環(huán)境因素的影響.蛋白質(zhì)組的研究正是探索這一領(lǐng)域的有力武器.人們不難預(yù)期,基因組計(jì)劃的不斷推進(jìn)會(huì)給蛋白質(zhì)組研究提供更多更全的數(shù)據(jù)庫(kù);生物信息學(xué)的發(fā)展會(huì)給蛋白質(zhì)組計(jì)劃提供更方便有效的計(jì)算機(jī)分析軟件;國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)會(huì)使各國(guó)各領(lǐng)域科學(xué)家有關(guān)蛋白質(zhì)組研究的成果出現(xiàn)新的集成;新的技術(shù)會(huì)不斷涌現(xiàn),蛋白質(zhì)組研究方法會(huì)象ＰＣＲ技術(shù)一樣易于操作,并滲透到人類(lèi)活動(dòng)的方方面面,對(duì)工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生各行各業(yè)帶來(lái)新的革命基因組計(jì)劃無(wú)疑為醫(yī)療、醫(yī)藥領(lǐng)域帶來(lái)一場(chǎng)革命,但也應(yīng)該看到19功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)的提出及概念

功能蛋白質(zhì)組學(xué)是指從動(dòng)態(tài)和整體的角度研究蛋白質(zhì)的功能及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是位于對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組研究之間的層次。功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容蛋白質(zhì)群體研究

功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)的提出及概念20數(shù)據(jù)庫(kù)說(shuō)明WWW地址蛋白質(zhì)序列庫(kù):SWISS-PROT內(nèi)容豐富,提示詳盡http://www.expasy.ch/sport/PIR較/pir/pir-psi.htmlTrEMBL(EMBL的翻譯)http://www.expasy.ch/sprot/OWL(非冗余庫(kù))http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/OWL.html核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù):EMBL歐州分子生物學(xué)http://www.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db/ebi/topembl.htmlGenBank美國(guó)生物工程信息中心/Web/Search/index.htmldbESTCDNA序列標(biāo)記/dbEST/數(shù)據(jù)庫(kù)說(shuō)明21模體與域:PROSITE序列模體http://www.expasy.ch/sport/prosite.htmlBLOCKS保守序列http://www./ProDom蛋白質(zhì)域http://protein.toulouse.inra.fr/prodom.htmlSBASE蛋白質(zhì)域http://base.icgeb.trieste.it/sbase/二維電泳(2DPAGE):WORLD-2DPAGE國(guó)際2DPAGE庫(kù)的完整索引http://www.expasy.ch/ch2d/2d-index.htmlLinksto2DPAGEPhoretix公司的連絡(luò)表/links.htm2DWG二維電泳圖譜元庫(kù)/2dwgDB/Flicker成對(duì)電泳圖譜比較/flicker/三維結(jié)構(gòu)庫(kù):PDB蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)庫(kù)/SWISS-MODEL從序列模建結(jié)構(gòu)http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.htmlSWISS-3DIMAGE三維結(jié)構(gòu)圖示http://www.expasy.ch/sw3d/DSSP二級(jí)結(jié)構(gòu)命名ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/dsspFSSP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)家族ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/fssp/模體與域:22翻譯后修飾:O-GLYCBASE糖基化http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE/PHOSPHOBASE磷酸化http://www.cbs.dtu.dk/databases/PhosphoBase/deltamass翻譯后修飾匯編.au/WWWDOCS/SVIMRDOCS/MassSpec/deltamassV2.html基因組庫(kù):dblist基因組庫(kù)目列http://www.expasy.ch/amos-www-links.html#organismsGDB基因組庫(kù)/OMIM遺傳病表型/omim/GeneCards生物醫(yī)學(xué)知識(shí)http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards/翻譯后修飾:GDB基因組庫(kù)http://gdbwww.gdb23代謝庫(kù):Boehringer圖代謝路徑圖http://www.expasy.ch/cgi-bin/search-biochem-indexENZYME酶及其反應(yīng)的命名http://www.expasy.ch/sprot/enzyme.htmlEcolyc大腸桿菌中間代謝/ecocyc/ecocyc.htmlHinCys嗜血流感中間代謝/ecocyc/hincyc.htmlWIT酶和代謝途徑/WIT/相互作用:GIF-DB果蠅發(fā)育中的基因相互作用http://gifts.univ-mrs.fr.GIF-DB/GIF-DB-home.htmlKEGG基因相互作用http://www.genome.ad.jp/keggDeletion酵母功能基因組/group/yeast-deletion-project/deletion.html

代謝庫(kù):24表3用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件屬性參數(shù)/軟件名稱(chēng)WWW地址蛋白質(zhì)質(zhì)量+蛋白質(zhì)序列標(biāo)記PeptideSearchhttp://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlTagIdenthttp://expasy.hcuge.ch/sprot/tagident.html蛋白質(zhì)的肽質(zhì)印記:MassSearchhttp://cbrg.inf.ethz.ch/subsection3-1-3.htmlMS-Fithttp://falcon.ludwig.ucl.ac.uk/ucsfhtml/msfit.htmPetideSearchhttp://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlProFound/PROWL/prot-id-main.html表3用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件25表3用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件屬性參數(shù)/軟件名稱(chēng)WWW地址蛋白質(zhì)質(zhì)量+蛋白質(zhì)序列標(biāo)記PeptideSearchhttp://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlTagIdenthttp://expasy.hcuge.ch/sprot/tagident.html蛋白質(zhì)的肽質(zhì)印記:MassSearchhttp://cbrg.inf.ethz.ch/subsection3-1-3.htmlMS-Fithttp://falcon.ludwig.ucl.ac.uk/ucsfhtml/msfit.htmPetideSearchhttp://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlProFound/PROWL/prot-id-main.htmlMultiIdenthttp://expasy.hcuge.ch/sprot/multiident.html表3用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件26

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的手段蛋白質(zhì)組分析概述蛋白質(zhì)組研究的核心──用于分離的雙向電泳(2-DE)

蛋白質(zhì)組研究的百科全書(shū)———數(shù)據(jù)庫(kù)(database)蛋白質(zhì)組技術(shù)的支柱———鑒定技術(shù)(Identication)蛋白質(zhì)組技術(shù)的規(guī)?！吡魍亢Y選(HTS)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的手段蛋白質(zhì)組分析概述蛋白質(zhì)組研究的核心──27

目前雙向凝膠電泳一般只能分辨到1000-3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(SPOT),而一個(gè)細(xì)胞系可以表達(dá)上萬(wàn)個(gè)基因,加上蛋白質(zhì)加工修飾的多樣性,一個(gè)樣品中的蛋白種類(lèi)可達(dá)106種。因此,對(duì)于一些低拷貝蛋白,通常先將蛋白粗提液通過(guò)親和柱純化,再由一維或二維電泳分離。單向電泳的優(yōu)點(diǎn)在于幾乎所有蛋白質(zhì)均溶于ＳＤＳ,分子量在10000-300000范圍內(nèi)均能有效分離,極酸、極堿蛋白極易檢出。雙向凝膠電泳(2-dimensionalgelelectrophoresis)原理簡(jiǎn)明,第一向進(jìn)行等電聚焦,蛋白質(zhì)沿ｐＨ梯度分離,至各自的等電點(diǎn);隨后,在沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離。80年代固相化ｐＨ梯度(ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｐＨｇｒａｄｉｅｎｔｓ,IPG)的發(fā)明和完善,解決了ｐＨ梯度不穩(wěn)的問(wèn)題,使2-ＤＥ的重復(fù)性和上樣量大為改善。目前雙向凝膠電泳一般只能分辨到1000-28雙向凝膠電泳（2-DE）樣品的制備高分辨率和重復(fù)性

分離后的斑點(diǎn)檢測(cè)(spotdetection)

概念雙向凝膠電泳（2-DE）樣品的制備高分辨率和重復(fù)性分離后的29

蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電泳技術(shù)作為核心.雙向電泳由Ｏ’Ｆarrell，s于1975年首次建立并成功地分離約1000個(gè)Ｅｃｏｌｉ蛋白,并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的,而是隨環(huán)境而變化。雙向電泳原理簡(jiǎn)明,第一向進(jìn)行等電聚焦,蛋白質(zhì)沿ｐＨ梯度分離至各自的等電點(diǎn),隨后,再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離.目前,隨著技術(shù)的飛速發(fā)展,已能分離出10000個(gè)斑點(diǎn)(ｓｐｏｔ)蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電泳技術(shù)作為核心.30

樣品制備和溶解同樣事關(guān)2-ＤＥ的成效,目標(biāo)是盡可能擴(kuò)大其溶解度和解聚,以提高分辨率用化學(xué)法和機(jī)械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白,兩者聯(lián)合有協(xié)同作用對(duì)ＩＥＦ樣品的預(yù)處理涉及溶解、變性和還原來(lái)完全破壞蛋白間的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物質(zhì)。理想的狀態(tài)是人們應(yīng)一步完成蛋白的完全處理。低豐度蛋白在細(xì)胞內(nèi)可能具有重要的調(diào)節(jié)功能,代表蛋白質(zhì)組研究的“冰山之尖”,故分高低豐度蛋白是一種挑戰(zhàn)亞細(xì)胞分級(jí)和蛋白質(zhì)預(yù)分級(jí)、提高加樣量(已達(dá)到1～15ｍｇ級(jí)的標(biāo)準(zhǔn))、應(yīng)用敏感性檢測(cè),可以提高其敏感性如一種多肽免疫2-ＤＥ印跡是利用幾種單克隆抗體技術(shù)來(lái)分析和檢測(cè)提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白的分離是另一難點(diǎn)，由于堿性ｐＨ范圍內(nèi)凝膠基質(zhì)的不穩(wěn)定及逆向電滲流的產(chǎn)生,對(duì)pI超過(guò)10的堿性蛋白,通過(guò)產(chǎn)生0～10%的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之，亦可用雙甲基丙烯酰胺來(lái)增加基質(zhì)的穩(wěn)定性。

樣品制備和溶解同樣事關(guān)2-ＤＥ的成效,目標(biāo)31

2-ＤＥ面臨的挑戰(zhàn)是高分辨率和重復(fù)性：高分辨率確保蛋白最大程度的分離,高重復(fù)性允許進(jìn)行凝膠間配比.對(duì)2-ＤＥ而言,有3種方法分離蛋白:1)ISO-DALT以Ｏ’Farrell,s技術(shù)為基礎(chǔ)第一向應(yīng)用載體兩性電解質(zhì),在管膠內(nèi)建立ｐＨ梯度隨著聚焦時(shí)間的延長(zhǎng),ｐＨ梯度不穩(wěn),易產(chǎn)生陰極漂.2)NEPHＧＥ用于分離堿性蛋白(ｐＨ>7.0)如果聚焦達(dá)到平衡狀態(tài),堿性蛋白會(huì)離開(kāi)凝膠基質(zhì)而丟失因此,在等電區(qū)域的遷移須在平衡狀態(tài)之前完成,但很難控制3)IPG-DALT發(fā)展于80年代早期.由于固相ｐＨ梯度的出現(xiàn)解決了ｐＨ梯度不穩(wěn)的問(wèn)題.ＩＰＧ通過(guò)immobiline共價(jià)偶聯(lián)于丙烯酰胺產(chǎn)生固定的ｐＨ梯度,克服了ＩＥＦ的缺點(diǎn),從而達(dá)到高度的重復(fù)性目前可以精確制作線(xiàn)性、漸進(jìn)性和Ｓ型曲線(xiàn),范圍或?qū)捇蛘模穑忍荻?新的酸性ｐＨ3-5或堿性ｐＨ6-11的IPG凝膠梯度聯(lián)合商品化的Ｐｈ4-7的梯度可對(duì)蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)組重疊群從而有效分離.2-ＤＥ面臨的挑戰(zhàn)是高分辨率和重復(fù)性：高分辨率32

分離后的斑點(diǎn)檢測(cè)(ｓｐｏｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎ)亦很重要.所采用的檢測(cè)策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的.此外,還需考慮反應(yīng)的線(xiàn)性、飽和閾/動(dòng)態(tài)范圍、敏感性、對(duì)細(xì)胞蛋白群的全體定量分析的適應(yīng)性、可行性.目前,沒(méi)有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和ＰＩ及分離后分析技術(shù).銀染已成為一種檢測(cè)2-DＥ的流行方法,可檢測(cè)少到2～5ｎｇ的蛋白,因此較考馬斯亮藍(lán)Ｒ-250敏感.多數(shù)糖蛋白不能被考馬斯亮藍(lán)染色,一些有機(jī)染料不適于ＰＶＤＦ膜放射性標(biāo)記不依賴(lài)其代謝的活性,并僅適于對(duì)合成的蛋白質(zhì)檢測(cè).另有一種改良的2-ＤＥ(差異凝膠電泳),即應(yīng)用兩種不同的染料熒光標(biāo)記兩個(gè)樣品,使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個(gè),避免了幾種2-ＤＥ的比較,可在納克級(jí)進(jìn)行檢測(cè).分離后的斑點(diǎn)檢測(cè)(ｓｐｏｔｄｅｔｅｃｔｉｏ33蛋白質(zhì)組技術(shù)的支柱——鑒定技術(shù)

與質(zhì)譜(massspectrometry)相關(guān)的技術(shù)氨基酸組分分析

圖象分析技術(shù)(Imageanalysis)微量測(cè)序(micro-sequencing)蛋白質(zhì)組技術(shù)的支柱——鑒定技術(shù)與質(zhì)譜(massspec34

肽質(zhì)指紋術(shù)（peptidemassfingerprint,PMF）

肽片段（peptidefragment)的部分測(cè)序質(zhì)譜技術(shù)的現(xiàn)狀質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用肽質(zhì)指紋術(shù)（peptidemassfingerpri35質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用蛋白質(zhì)和DNA的序列測(cè)定分析復(fù)合體的蛋白質(zhì)組研究蛋白質(zhì)修飾分析單核苷酸多態(tài)性研究生物分子的相互作用鑒定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用蛋白質(zhì)和DNA的序列測(cè)定36圖象分析技術(shù)

“滿(mǎn)天星”式的2ＤＥ圖譜分析不能依靠本能的直覺(jué),每一個(gè)圖象上斑點(diǎn)的上調(diào)、下調(diào)及出現(xiàn)、消失,都可能在生理和病理狀態(tài)下產(chǎn)生,必須依靠計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)處理,進(jìn)行定量分析在一系列高質(zhì)量的2－ＤＥ凝膠產(chǎn)生(低背景染色,高度的重復(fù)性)的前提下,圖象分析包括斑點(diǎn)檢測(cè)、背景消減、斑點(diǎn)配比和數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建。首先,采集圖象通常所用的系統(tǒng)是電荷耦合ＣＣＤ(chargecoupleddevice)照相機(jī);激光密度儀(laserdensitometers)和Phospho或Fluoro-imagers,對(duì)圖象進(jìn)行數(shù)字化并成為以象素(pixels)為基礎(chǔ)的空間和網(wǎng)格其次,在圖象灰度水平上過(guò)濾和變形,進(jìn)行圖象加工,以進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè).利用laplacianGaussian,DOG(differenceofGaussians)opreator使有意義的區(qū)域與背景分離,精確限定斑點(diǎn)的強(qiáng)度、面積、周長(zhǎng)和方向圖象分析檢測(cè)的斑點(diǎn)須與肉眼觀(guān)測(cè)的斑點(diǎn)一致在這一原則下,多數(shù)系統(tǒng)以控制斑點(diǎn)的重心或最高峰來(lái)分析,邊緣檢測(cè)的軟件可精確描述斑點(diǎn)外觀(guān),并進(jìn)行邊緣檢測(cè)和鄰近分析,以增加精確度通過(guò)閾值分析、邊緣檢測(cè)、銷(xiāo)蝕和擴(kuò)大斑點(diǎn)檢測(cè)的基本工具還可恢復(fù)共遷移的斑點(diǎn)邊界圖象分析技術(shù)“滿(mǎn)天星”式的2ＤＥ圖譜分析不能依靠本37聯(lián)邦數(shù)據(jù)庫(kù)互滲事例聯(lián)邦數(shù)據(jù)庫(kù)互滲事例38用肽序列標(biāo)記搜索dbEST庫(kù)

CID譜和肽序列標(biāo)記從dbEST中搜索到的匹配序列用肽序列標(biāo)記搜索dbEST庫(kù)CID譜和肽39從SWISS-2DPAGE的人肝參考圖中蛋白斑點(diǎn)的擊示事例從SWISS-2DPAGE的人肝參考圖中蛋白斑點(diǎn)的擊示事例40

a-乳清蛋白的一個(gè)酶解肽段的CID譜翻譯后修飾的自動(dòng)解釋的示意圖a-乳清蛋白的一個(gè)酶解肽段的CID譜翻譯后41ProteinsampleImageanalysisProteiningelProteinonmembraneProteininsolution2-DPAGEExcisionBlottingElutionPartialdegradationPeptidemixtureMassofproteinN-terminalsequenceMSEdmandegradationPeptidemassfingerprintPeptidesequenceMS/MSdataDatabasesearchingNovelorpreviouslystudiedproteinCharacterizationofpost-translocationmodifications蛋白質(zhì)組的分析流程ProteinsampleImageanalysisP42成像分析軟件MelanieII功能示意圖成像分析軟件MelanieII功能示意圖43差異蛋白質(zhì)組研究

差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究在技術(shù)上有更高的可實(shí)現(xiàn)性差異蛋白質(zhì)組學(xué)反映了蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)本質(zhì)差異蛋白質(zhì)組學(xué)具有廣泛和明確的應(yīng)用前景差異蛋白質(zhì)組研究差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究在技44差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法雙向電泳用于蛋白質(zhì)定量和比較研究的質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法雙向電泳45蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)組學(xué)的含義

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的手段

蛋白質(zhì)組信息學(xué)

差異蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組研究意義及前景蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展蛋白質(zhì)組學(xué)的含義46

講授內(nèi)容一、蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展（晏本菊）二、核酶、抗體酶（陳惠）三、蛋白質(zhì)定向進(jìn)化—DNAShuffling技術(shù)（陳惠）四、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、肽核酸（楊婉身）講授內(nèi)容一、蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展（晏本菊）47

生物化學(xué)專(zhuān)題主講教師楊婉身晏本菊陳惠生物化學(xué)專(zhuān)題主講教師楊婉身晏48蛋白質(zhì)組學(xué)的含義

蛋白質(zhì)組(Proteome)一詞最早由澳大利亞學(xué)者Ｗｉｌｋｉｎｓ等于1994年提出,指的是由一個(gè)基因組geneome或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有protein。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是在蛋白質(zhì)水平上定量、動(dòng)態(tài)、整體性地研究生物體。

同基因組學(xué)一樣,蛋白質(zhì)組學(xué)不是一個(gè)封閉的、概念化的、穩(wěn)定的知識(shí)體系,而是一個(gè)領(lǐng)域。它旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式,其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)定位、相互作用研究等,最終揭示蛋白質(zhì)功能,是基因組ＤＮＡ序列與基因功能之間的橋梁。蛋白質(zhì)組學(xué)的含義蛋白質(zhì)組(Proteome)49

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容蛋白質(zhì)表達(dá)模式(或蛋白質(zhì)組組成)的研究蛋白質(zhì)組組成的分析鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)中的與基因組學(xué)相對(duì)應(yīng)的主要內(nèi)容。它要求對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行表征,即實(shí)現(xiàn)所有蛋白質(zhì)的分離、鑒定及其圖譜化。雙向凝膠電泳(2-DＥ)和質(zhì)譜(Massspectrometry)技術(shù)是當(dāng)前分離鑒定蛋白質(zhì)的兩大支柱技術(shù)

蛋白質(zhì)組功能模式(目前主要集中在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系)的研究蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容蛋白質(zhì)表達(dá)模式(或蛋白質(zhì)組組成)50

原核及簡(jiǎn)單真核生物的蛋白質(zhì)組研究

流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究

大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究

致病微生物的蛋白質(zhì)組研究

釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究

原核及簡(jiǎn)單真核生物的蛋白質(zhì)組研究流感嗜血桿菌的蛋51

流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究

流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)是第一個(gè)獲得基因組全序列的生物.瑞士的一個(gè)小組通過(guò)2-DPAGE研究了流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組分,在ｐＨ3-10的范圍內(nèi)鑒定了約300個(gè)蛋白質(zhì)組分,然后用有兩個(gè)尿素濃度的麥黃酮(tricine)膠分離了很難分離到的5-20ku范圍內(nèi)的蛋白質(zhì),還鑒定了其中的80種.另外用肝素親和層析將堿性蛋白質(zhì)富集后,在ｐＨ6-11的范圍內(nèi)又鑒定了102個(gè)蛋白質(zhì),其中許多是核酸結(jié)合蛋白尤其是核糖體蛋白.華盛頓大學(xué)的另一個(gè)小組將雙向電泳得到的流感嗜血桿菌303個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,確定了263個(gè)蛋白質(zhì),其中大部分是外膜蛋白,以及與能量代謝和大分子合成相關(guān)的蛋白質(zhì).另外發(fā)現(xiàn)了幾種不能在基因組中找到對(duì)應(yīng)序列的蛋白質(zhì).令人驚奇的是,大約22%的被鑒定了的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與預(yù)計(jì)不同的等電點(diǎn)與分子質(zhì)量,顯示它們可能經(jīng)過(guò)了翻譯后加工.流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)組研究52大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究

大腸桿菌全部4000多個(gè)基因的ＤＮＡ序列已被測(cè)定,人們想到如果把雙向電泳得到的蛋白質(zhì)譜與基因組分析結(jié)果聯(lián)合起來(lái),就會(huì)得到更多有用的信息.基于此想法,建立蛋白質(zhì)基因聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù),希望籍此來(lái)回答以下幾方面的問(wèn)題:ａ所有編碼基因的產(chǎn)物在雙向圖譜上的位置,ｂ各種蛋白質(zhì)的豐度,ｃ不同條件下各種蛋白質(zhì)表達(dá)水平及合成速率的變化,ｄ各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位,ｅ某些蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式及水平.目前,大腸桿菌的聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)已更新到第六版,大約包括1600個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的數(shù)據(jù),其中大約400個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)已與大約350個(gè)基因相對(duì)應(yīng)(有些基因可能有多個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物),對(duì)于這些蛋白質(zhì),這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可以提供基因名稱(chēng)、蛋白質(zhì)名稱(chēng)、EC編號(hào)、功能范疇、Swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)、Ｇenbank序列號(hào)、基因圖譜的位置、染色體上的轉(zhuǎn)錄方向以及一些生理信息(如在不同生長(zhǎng)條件下該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的豐度).大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究53致病微生物的蛋白質(zhì)組研究

蛋白質(zhì)組的一個(gè)重要應(yīng)用是在闡明新抗生素作用機(jī)理的研究上.當(dāng)今,細(xì)菌對(duì)大多數(shù)抗生素都有了抗性,尋找作用于細(xì)菌內(nèi)新的靶子的研究工作已經(jīng)展開(kāi),找到了許多有效的抗菌化合物.但目前遇到的困難在于難以揭示新的化合物的作用靶子及其作用機(jī)理.有時(shí)雖在體外發(fā)現(xiàn)新化合物能夠使某種蛋白質(zhì)失活,但在體內(nèi)是否有這種現(xiàn)象和這是否是抗菌的主要機(jī)制仍然未知,現(xiàn)在雙向電泳分析提供了一個(gè)有效手段.例如在研究抑制核糖體類(lèi)抗生素對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制時(shí),對(duì)12種作用于翻譯過(guò)程的不同階段和核糖體內(nèi)不同分子的抗生素加以考察,發(fā)現(xiàn)其中8種誘導(dǎo)冷休克反應(yīng)的一系列蛋白質(zhì),另4種誘導(dǎo)一系列熱休克反應(yīng)的蛋白質(zhì),因此預(yù)計(jì)新的作用于核糖體的化合物也是誘導(dǎo)這兩種反應(yīng),并且籍此可以推測(cè)大腸桿菌對(duì)冷熱的反應(yīng)發(fā)生于核糖體水平上.蛋白質(zhì)組研究的重要優(yōu)勢(shì)在于能夠從整體水平上分析不同條件下蛋白質(zhì)譜的變化.例如作為一種差異顯示技術(shù),這一技術(shù)已被用于比較結(jié)核分枝桿菌與牛結(jié)核分枝桿菌蛋白的不同,結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些在基因水平上很類(lèi)似的蛋白在蛋白質(zhì)水平上有很大差別,這可能部分解釋近年來(lái)牛痘作為結(jié)核病疫苗會(huì)出現(xiàn)失敗的現(xiàn)象

致病微生物的蛋白質(zhì)組研究54釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究

利用雙向電泳技術(shù)分析酵母蛋白譜的工作早于蛋白質(zhì)組概念的提出.釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因組的完成及其蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)在互聯(lián)網(wǎng)上的建立,大大加速了這一工作.最新版的數(shù)據(jù)庫(kù)包括6000多頁(yè),每頁(yè)代表一個(gè)已知或推測(cè)的酵母蛋白.它包含以下幾方面的信息:ａ以序列為基礎(chǔ)的已知和推測(cè)的酵母蛋白的特征信息,如分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、多肽片段大小等;ｂ一些研究得到的關(guān)于各種蛋白質(zhì)在翻譯后加工、亞細(xì)胞定位、功能分類(lèi)方面的信息;ｃ從以往的超過(guò)5000篇關(guān)于酵母蛋白研究的文章中獲得的有關(guān)各種蛋白質(zhì)功能、相互作用、突變表型的信息.借助數(shù)據(jù)庫(kù)的有力推動(dòng),在雙向電泳蛋白質(zhì)譜上最明顯的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的大部分得到鑒定.釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究55正在丹麥進(jìn)行的一項(xiàng)研究計(jì)劃分別作出野生型和將基因系統(tǒng)缺失的缺陷型酵母的雙向蛋白質(zhì)圖譜.初步的研究表明,缺失單一基因?qū)?dǎo)致的結(jié)果并不只是缺乏此基因編碼的蛋白質(zhì),而是能導(dǎo)致其他一系列蛋白質(zhì)量的改變.一些蛋白質(zhì)減少而另一些蛋白質(zhì)增多,當(dāng)然還有一些蛋白質(zhì)被加工修飾而導(dǎo)致性狀改變.單一基因缺失的結(jié)果總是引起蛋白質(zhì)組全局性的變化.大約20%的酵母基因缺失是致死性的,另外80%則不然,這時(shí)機(jī)體能通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)對(duì)抗這種內(nèi)源性的變化.這種基因缺失的研究可能會(huì)告訴我們一些關(guān)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子間相互“對(duì)話(huà)”和“作用”的重要信息,如蛋白質(zhì)間的物理聯(lián)系(這些蛋白質(zhì)可能會(huì)組成蛋白質(zhì)復(fù)合物)、信號(hào)傳遞途徑,以幫助我們了解細(xì)胞是如何構(gòu)成的以及是如何協(xié)同工作的。正在丹麥進(jìn)行的一項(xiàng)研究計(jì)劃分別作出野生型和將基因系統(tǒng)56

多細(xì)胞真核生物的蛋白質(zhì)組研究

線(xiàn)蟲(chóng)的蛋白質(zhì)組研究

果蠅的蛋白質(zhì)組研究人類(lèi)的蛋白質(zhì)組研究

植物的蛋白質(zhì)組研究多細(xì)胞真核生物的蛋白質(zhì)組研究57線(xiàn)蟲(chóng)的蛋白質(zhì)組研究利用雙向電泳技術(shù),Ｂini對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)(Ｃ.elegans)進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析,在等電點(diǎn)3.5-9和分子質(zhì)量10-200kｕ的范圍內(nèi)可分辨2000個(gè)以上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn),然后利用Ｅｄｍａｎ微量測(cè)序技術(shù)對(duì)其中24個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行分析,得到其中12個(gè)蛋白質(zhì)的Ｎ端序列.其余的由于Ｎ端封閉而未能測(cè)出序列.已測(cè)出的12個(gè)中有1個(gè)未能找到與其匹配的基因.另外11個(gè)與能量代謝、酸性核蛋白、Ｇ蛋白等對(duì)應(yīng).Ｃ.elegans的19000個(gè)基因已于1998年12月全部測(cè)出,預(yù)計(jì)會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)組的研究提供幫助線(xiàn)蟲(chóng)的蛋白質(zhì)組研究58果蠅的蛋白質(zhì)組研究

不同性別果蠅(Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ)成蟲(chóng)的頭、胸、腹部的蛋白質(zhì)組圖譜已被分別作出,總共約有1200個(gè)蛋白質(zhì)被檢出,其中的大多數(shù)在頭、胸、腹中是相同的,但也發(fā)現(xiàn)了一部分其部位、性別特異的蛋白質(zhì).果蠅的蛋白質(zhì)組研究59

人類(lèi)的蛋白質(zhì)組研究

人類(lèi)的蛋白質(zhì)組研究吸引了最多的注意力.由于人有著大量的組織、細(xì)胞類(lèi)型和發(fā)育階段,對(duì)人蛋白質(zhì)組的研究主要聚焦在特異的組織、細(xì)胞和疾病上.已有的證據(jù)表明,盡管人的不同組織有著很大的功能差別,但其中的許多蛋白質(zhì)是看家蛋白,因此它們的雙向圖譜可能也是近似的.這點(diǎn)與簡(jiǎn)單生物不同,簡(jiǎn)單生物在不同的發(fā)育階段有著極不相同的蛋白質(zhì)組.因此對(duì)于人類(lèi)來(lái)說(shuō),一個(gè)高質(zhì)量的基本的雙向圖譜是非常有用的,它可以作為其他組織、細(xì)胞的參照?qǐng)D譜.人的各種組織、器官、細(xì)胞乃至各種細(xì)胞器已被廣泛研究.人類(lèi)的蛋白質(zhì)組研究60植物的蛋白質(zhì)組研究植物的蛋白質(zhì)組研究61

人的各種體液(血液、淋巴、脊髓、乳汁和尿等)都被用于研究與某些疾病的關(guān)系.最近澳大利亞科學(xué)家利用雙向電泳技術(shù)研究眼淚中的蛋白質(zhì)與生理狀態(tài)的關(guān)系.他們發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì),這個(gè)蛋白質(zhì)非常相似于在乳腺癌細(xì)胞里高表達(dá)的另一種蛋白質(zhì).這個(gè)發(fā)現(xiàn)可能會(huì)提供疾病診治的新的手段.在一項(xiàng)利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)進(jìn)行的酒精對(duì)人體毒性的研究中發(fā)現(xiàn),乙醇會(huì)改變血清蛋白糖基化作用,導(dǎo)致許多糖蛋白的糖基缺乏,如轉(zhuǎn)鐵蛋白。人的各種體液(血液、淋巴、脊髓、乳汁和尿等62

腫瘤至今仍是人類(lèi)的一個(gè)頑敵.癌細(xì)胞不僅有許多特異蛋白質(zhì)產(chǎn)物,而且這些產(chǎn)物還會(huì)影響其他蛋白質(zhì)的翻譯后加工及許多蛋白質(zhì)的表達(dá)水平.腫瘤的蛋白質(zhì)組研究能提供一些以往其他技術(shù)所不能提供的早期診斷依據(jù),例如利用不同細(xì)胞組織的特征蛋白質(zhì)譜,可以判別一些難以判定來(lái)源的腫瘤細(xì)胞的來(lái)源.丹麥的一個(gè)小組利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)結(jié)合組織冰凍切片技術(shù)分析了150例膀胱癌病人的組織,發(fā)現(xiàn)在所有的鱗狀細(xì)胞瘤的尿液中均能發(fā)現(xiàn)一種化學(xué)引誘劑———銀屑素(ｐｓｏｒｉａｓｉｎ),推測(cè)其極可能作為這種腫瘤的早期標(biāo)志物.腫瘤至今仍是人類(lèi)的一個(gè)頑敵.癌細(xì)胞不僅有許多特異蛋白63

基因組計(jì)劃無(wú)疑為醫(yī)療、醫(yī)藥領(lǐng)域帶來(lái)一場(chǎng)革命,但也應(yīng)該看到,單純的遺傳分析很難診斷多因素的疾病.復(fù)雜的基因間相互作用,細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)和環(huán)境的影響都會(huì)影響基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的翻譯后加工.因此,可靠的診斷和治療應(yīng)基于機(jī)體漸進(jìn)發(fā)展過(guò)程的調(diào)控及失調(diào),并且必須考慮到環(huán)境因素的影響.蛋白質(zhì)組的研究正是探索這一領(lǐng)域的有力武器.人們不難預(yù)期,基因組計(jì)劃的不斷推進(jìn)會(huì)給蛋白質(zhì)組研究提供更多更全的數(shù)據(jù)庫(kù);生物信息學(xué)的發(fā)展會(huì)給蛋白質(zhì)組計(jì)劃提供更方便有效的計(jì)算機(jī)分析軟件;國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)會(huì)使各國(guó)各領(lǐng)域科學(xué)家有關(guān)蛋白質(zhì)組研究的成果出現(xiàn)新的集成;新的技術(shù)會(huì)不斷涌現(xiàn),蛋白質(zhì)組研究方法會(huì)象ＰＣＲ技術(shù)一樣易于操作,并滲透到人類(lèi)活動(dòng)的方方面面,對(duì)工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生各行各業(yè)帶來(lái)新的革命基因組計(jì)劃無(wú)疑為醫(yī)療、醫(yī)藥領(lǐng)域帶來(lái)一場(chǎng)革命,但也應(yīng)該看到64功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)的提出及概念

功能蛋白質(zhì)組學(xué)是指從動(dòng)態(tài)和整體的角度研究蛋白質(zhì)的功能及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是位于對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組研究之間的層次。功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容蛋白質(zhì)群體研究

功能蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)的提出及概念65數(shù)據(jù)庫(kù)說(shuō)明WWW地址蛋白質(zhì)序列庫(kù):SWISS-PROT內(nèi)容豐富,提示詳盡http://www.expasy.ch/sport/PIR較/pir/pir-psi.htmlTrEMBL(EMBL的翻譯)http://www.expasy.ch/sprot/OWL(非冗余庫(kù))http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/OWL.html核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù):EMBL歐州分子生物學(xué)http://www.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db/ebi/topembl.htmlGenBank美國(guó)生物工程信息中心/Web/Search/index.htmldbESTCDNA序列標(biāo)記/dbEST/數(shù)據(jù)庫(kù)說(shuō)明66模體與域:PROSITE序列模體http://www.expasy.ch/sport/prosite.htmlBLOCKS保守序列http://www./ProDom蛋白質(zhì)域http://protein.toulouse.inra.fr/prodom.htmlSBASE蛋白質(zhì)域http://base.icgeb.trieste.it/sbase/二維電泳(2DPAGE):WORLD-2DPAGE國(guó)際2DPAGE庫(kù)的完整索引http://www.expasy.ch/ch2d/2d-index.htmlLinksto2DPAGEPhoretix公司的連絡(luò)表/links.htm2DWG二維電泳圖譜元庫(kù)/2dwgDB/Flicker成對(duì)電泳圖譜比較/flicker/三維結(jié)構(gòu)庫(kù):PDB蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)庫(kù)/SWISS-MODEL從序列模建結(jié)構(gòu)http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.htmlSWISS-3DIMAGE三維結(jié)構(gòu)圖示http://www.expasy.ch/sw3d/DSSP二級(jí)結(jié)構(gòu)命名ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/dsspFSSP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)家族ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/fssp/模體與域:67翻譯后修飾:O-GLYCBASE糖基化http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE/PHOSPHOBASE磷酸化http://www.cbs.dtu.dk/databases/PhosphoBase/deltamass翻譯后修飾匯編.au/WWWDOCS/SVIMRDOCS/MassSpec/deltamassV2.html基因組庫(kù):dblist基因組庫(kù)目列http://www.expasy.ch/amos-www-links.html#organismsGDB基因組庫(kù)/OMIM遺傳病表型/omim/GeneCards生物醫(yī)學(xué)知識(shí)http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards/翻譯后修飾:GDB基因組庫(kù)http://gdbwww.gdb68代謝庫(kù):Boehringer圖代謝路徑圖http://www.expasy.ch/cgi-bin/search-biochem-indexENZYME酶及其反應(yīng)的命名http://www.expasy.ch/sprot/enzyme.htmlEcolyc大腸桿菌中間代謝/ecocyc/ecocyc.htmlHinCys嗜血流感中間代謝/ecocyc/hincyc.htmlWIT酶和代謝途徑/WIT/相互作用:GIF-DB果蠅發(fā)育中的基因相互作用http://gifts.univ-mrs.fr.GIF-DB/GIF-DB-home.htmlKEGG基因相互作用http://www.genome.ad.jp/keggDeletion酵母功能基因組/group/yeast-deletion-project/deletion.html

代謝庫(kù):69表3用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件屬性參數(shù)/軟件名稱(chēng)WWW地址蛋白質(zhì)質(zhì)量+蛋白質(zhì)序列標(biāo)記PeptideSearchhttp://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlTagIdenthttp://expasy.hcuge.ch/sprot/tagident.html蛋白質(zhì)的肽質(zhì)印記:MassSearchhttp://cbrg.inf.ethz.ch/subsection3-1-3.htmlMS-Fithttp://falcon.ludwig.ucl.ac.uk/ucsfhtml/msfit.htmPetideSearchhttp://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlProFound/PROWL/prot-id-main.html表3用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件70表3用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件屬性參數(shù)/軟件名稱(chēng)WWW地址蛋白質(zhì)質(zhì)量+蛋白質(zhì)序列標(biāo)記PeptideSearchhttp://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlTagIdenthttp://expasy.hcuge.ch/sprot/tagident.html蛋白質(zhì)的肽質(zhì)印記:MassSearchhttp://cbrg.inf.ethz.ch/subsection3-1-3.htmlMS-Fithttp://falcon.ludwig.ucl.ac.uk/ucsfhtml/msfit.htmPetideSearchhttp://www.mann.embl-heidelberg.de/Services/PeptideSearch/PeptideSearchIntro.htmlProFound/PROWL/prot-id-main.htmlMultiIdenthttp://expasy.hcuge.ch/sprot/multiident.html表3用于蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件71

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的手段蛋白質(zhì)組分析概述蛋白質(zhì)組研究的核心──用于分離的雙向電泳(2-DE)

蛋白質(zhì)組研究的百科全書(shū)———數(shù)據(jù)庫(kù)(database)蛋白質(zhì)組技術(shù)的支柱———鑒定技術(shù)(Identication)蛋白質(zhì)組技術(shù)的規(guī)模———高流通量篩選(HTS)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的手段蛋白質(zhì)組分析概述蛋白質(zhì)組研究的核心──72

目前雙向凝膠電泳一般只能分辨到1000-3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(SPOT),而一個(gè)細(xì)胞系可以表達(dá)上萬(wàn)個(gè)基因,加上蛋白質(zhì)加工修飾的多樣性,一個(gè)樣品中的蛋白種類(lèi)可達(dá)106種。因此,對(duì)于一些低拷貝蛋白,通常先將蛋白粗提液通過(guò)親和柱純化,再由一維或二維電泳分離。單向電泳的優(yōu)點(diǎn)在于幾乎所有蛋白質(zhì)均溶于ＳＤＳ,分子量在10000-300000范圍內(nèi)均能有效分離,極酸、極堿蛋白極易檢出。雙向凝膠電泳(2-dimensionalgelelectrophoresis)原理簡(jiǎn)明,第一向進(jìn)行等電聚焦,蛋白質(zhì)沿ｐＨ梯度分離,至各自的等電點(diǎn);隨后,在沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離。80年代固相化ｐＨ梯度(ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｐＨｇｒａｄｉｅｎｔｓ,IPG)的發(fā)明和完善,解決了ｐＨ梯度不穩(wěn)的問(wèn)題,使2-ＤＥ的重復(fù)性和上樣量大為改善。目前雙向凝膠電泳一般只能分辨到1000-73雙向凝膠電泳（2-DE）樣品的制備高分辨率和重復(fù)性

分離后的斑點(diǎn)檢測(cè)(spotdetection)

概念雙向凝膠電泳（2-DE）樣品的制備高分辨率和重復(fù)性分離后的74

蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電泳技術(shù)作為核心.雙向電泳由Ｏ’Ｆarrell，s于1975年首次建立并成功地分離約1000個(gè)Ｅｃｏｌｉ蛋白,并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的,而是隨環(huán)境而變化。雙向電泳原理簡(jiǎn)明,第一向進(jìn)行等電聚焦,蛋白質(zhì)沿ｐＨ梯度分離至各自的等電點(diǎn),隨后,再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離.目前,隨著技術(shù)的飛速發(fā)展,已能分離出10000個(gè)斑點(diǎn)(ｓｐｏｔ)蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電泳技術(shù)作為核心.75

樣品制備和溶解同樣事關(guān)2-ＤＥ的成效,目標(biāo)是盡可能擴(kuò)大其溶解度和解聚,以提高分辨率用化學(xué)法和機(jī)械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白,兩者聯(lián)合有協(xié)同作用對(duì)ＩＥＦ樣品的預(yù)處理涉及溶解、變性和還原來(lái)完全破壞蛋白間的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物質(zhì)。理想的狀態(tài)是人們應(yīng)一步完成蛋白的完全處理。低豐度蛋白在細(xì)胞內(nèi)可能具有重要的調(diào)節(jié)功能,代表蛋白質(zhì)組研究的“冰山之尖”,故分高低豐度蛋白是一種挑戰(zhàn)亞細(xì)胞分級(jí)和蛋白質(zhì)預(yù)分級(jí)、提高加樣量(已達(dá)到1～15ｍｇ級(jí)的標(biāo)準(zhǔn))、應(yīng)用敏感性檢測(cè),可以提高其敏感性如一種多肽免疫2-ＤＥ印跡是利用幾種單克隆抗體技術(shù)來(lái)分析和檢測(cè)提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白的分離是另一難點(diǎn)，由于堿性ｐＨ范圍內(nèi)凝膠基質(zhì)的不穩(wěn)定及逆向電滲流的產(chǎn)生,對(duì)pI超過(guò)10的堿性蛋白,通過(guò)產(chǎn)生0～10%的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之，亦可用雙甲基丙烯酰胺來(lái)增加基質(zhì)的穩(wěn)定性。

樣品制備和溶解同樣事關(guān)2-ＤＥ的成效,目標(biāo)76

2-ＤＥ面臨的挑戰(zhàn)是高分辨率和重復(fù)性：高分辨率確保蛋白最大程度的分離,高重復(fù)性允許進(jìn)行凝膠間配比.對(duì)2-ＤＥ而言,有3種方法分離蛋白:1)ISO-DALT以Ｏ’Farrell,s技術(shù)為基礎(chǔ)第一向應(yīng)用載體兩性電解質(zhì),在管膠內(nèi)建立ｐＨ梯度隨著聚焦時(shí)間的延長(zhǎng),ｐＨ梯度不穩(wěn),易產(chǎn)生陰極漂.2)NEPHＧＥ用于分離堿性蛋白(ｐＨ>7.0)如果聚焦達(dá)到平衡狀態(tài),堿性蛋白會(huì)離開(kāi)凝膠基質(zhì)而丟失因此,在等電區(qū)域的遷移須在平衡狀態(tài)之前完成,但很難控制3)IPG-DALT發(fā)展于80年代早期.由于固相ｐＨ梯度的出現(xiàn)解決了ｐＨ梯度不穩(wěn)的問(wèn)題.ＩＰＧ通過(guò)immobiline共價(jià)偶聯(lián)于丙烯酰胺產(chǎn)生固定的ｐＨ梯度,克服了ＩＥＦ的缺點(diǎn),從而達(dá)到高度的重復(fù)性目前可以精確制作線(xiàn)性、漸進(jìn)性和Ｓ型曲線(xiàn),范圍或?qū)捇蛘模穑忍荻?新的酸性ｐＨ3-5或堿性ｐＨ6-11