木瓜水溶性部位高效液相色譜法指紋圖譜研究

木瓜水溶性部位高效液相色譜法指紋圖譜研究【關(guān)鍵詞】木瓜；,,水溶性；,,指紋圖譜；,,高效液相色譜法摘要：目的研究不同采收時間和不同炮制方法的木瓜藥材水溶性部位高效液相色譜〔HPL〕指紋圖譜，為木瓜的標準化種植與合理應(yīng)用提供根據(jù)。方法以綠原酸為參照物，采用HPL法測定分析各指紋圖譜，色譜條件：18〔Krasil1810n~5μ，4.6×250〕色譜柱,流動相:(A)乙腈甲醇〔6：4〕(B)0.05%磷酸梯度洗脫，0～12in(10%~30%A,90%~70%B),12～30in(30%～50%A,70%～50%B),30～35in(50%～70%A,50%～30%B),35～45in(70%～90%A,30%～10%B),45～50in(90%～60%A,10%～40%B),50～60in(60%～10%A,40%～90%B),60～70in(10%A,90%B)；流速0.8l?in1,檢測波長283n。結(jié)果木瓜水溶性部位的指紋圖譜有較好的相關(guān)性。分析說明，木瓜不同采收時間的樣品分為3類―第2，3，6，9批歸為一類，有13，17，19in3個，共有峰；第1，5，8批歸為一類，出峰各有5個，有13，17，193個共有峰；第4，7歸為一類，有17，19兩個共有峰。其中又以第5批采收時間最好；不同炮制方法以曬的方法所含峰數(shù)目和含量要高；不同存放時間以存放時間短的較好。結(jié)論該研究有助于木瓜的質(zhì)量控制、采集和應(yīng)用。關(guān)鍵詞：木瓜；水溶性；指紋圖譜；高效液相色譜法Abstrat：bjetiveTstudytheHPLfingerprintftheaterslublepartfFruitfhaenelesfdifferentlletedtieandpressedethd,andtprvideappliatinandGAPbasisfrtheherb..ethdsHPLithUVdetetrasusedtanalyzethepatternsffruitfhaeneles.hlrgeniaidasusedasstandardsubstanes,18〔Krasil18,10n~5μ，4.6×250〕lunasusedithabilephasef(A)aetnitrileethnal(6:4)(B)0.05%phsphriaidgradientelutin,0～12in(10%~30%A,90%~70%B),12～30in(30%～50%A,70%～50%B),30～35in(50%～70%A,50%～30%B),35～45in(70%～90%A,30%～10%B),45～50in(90%～60%A,10%～40%B),50～60in(60%～10%A,40%～90%B),50～60in(10%A,90%B)；Theflrateas0.8l?in1,Theavelengthfdetetrassetat283n.ResultsThefingerprintffruitfhaenelesassetupandthefingerprintftheshedanexellentrrelatinship.nlusinThestudyishelpfulfrthequalityntrl,thegatheringandappliatinfhinesefleringquine.Keyrds：Fruitfhaeneles;aterslubility;Fingerprint;HPL木瓜(Fruitfhaeneles，rhinesequine)為薔薇科植物皺皮木瓜haenelesspeisa〔Seet〕Nakai的枯燥近成熟果實，為常用中藥［1，2］。本文主要對木瓜不同采收時間、不同炮制方法的水溶性部位進展了較為詳細的研究。1材料與儀器1.1藥材來源湖北省GAP種植基地不同采收時間：第1批至第9批分別是6月2日，6月12，6月22日，7月2日，7月12日，7月22日，8月2日，8月12日，8月22日。第1至第9批分別為曬制而采收時間不同的樣品；其中第8批又分為曬制〔8〕和燙制〔8＇〕兩種不同炮制方法；第9批分為新穎曬制〔9〕和存放1年時間〔9＇〕兩種。1.2儀器與試劑儀器:DINEX〔P680HPLPUP，SLVENTRAKSR100〕；試劑：乙腈、甲醇(色譜純)、磷酸、醋酸乙酯(均為分析純)，雙重蒸餾水；咖啡酸、綠原酸對照品〔購于中國藥品生物制品檢定所購于中國藥品生物制品檢定所，批號分別為：0885200001、0753200111〕。2方法與結(jié)果2.1參照物溶液制備分別精細稱取咖啡酸、綠原酸對照品適量，分別加甲醇制成每毫升含0.106g咖啡酸、0.492g綠原酸對照品溶液；然后分別精細汲取咖啡酸對照品溶液5l、綠原酸對照品溶液1l，加甲醇定容至25l，制成兩種對照品的混合溶液。2.2供試品溶液的制備［3~5］精細取藥材粉末0.25g于100l具塞錐形瓶中，精細汲取50l甲醇，稱重，蓋好瓶塞后超聲提取45in，稱量，并用甲醇補足重量，放冷至室溫，過濾，取續(xù)濾液，然后用0.45μ微孔濾膜過濾，制得水溶性溶液。2.3色譜分析條件［6~9］18〔Krasil1810n~5μ，4.6×250〕色譜柱,流動相:(A)乙腈甲醇〔6∶4〕(B)0.05%磷酸梯度洗脫，0～12in(10%～30%A,90%～70%B),12～30in(30%～50%A,70%～50%B),30～35in(50%～70%A,50%～30%B),35～45in(70%～90%A,30%B～10%B),45～50in(90%～60%A,10%～40%B),50～60in(60%～10%A,40%～90%B),60～70in(10%A,90%B)；流速0.8l?in1,檢測波長283n。所有組分均在60in之內(nèi)洗脫出柱。結(jié)果見圖1～3。3、4依次為綠原酸、咖啡酸圖13種對照品溶液、空白溶劑的HPL〔略〕圖2木瓜采收第1批藥材水溶性成分HPL指紋圖譜〔全圖〕〔略〕2.4系統(tǒng)適用性實驗與精細度考察2.4.1精細度實驗取同一供試品溶液，連續(xù)進樣5次，計算出峰時間和峰面積的精細度，結(jié)果說明各峰出峰時間的精細度在0.05%~0.75％之內(nèi)，出峰面積的精細度在0.35%~2.0％之內(nèi)，實驗說明精細度良好。2.4.2穩(wěn)定性實驗取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24h進樣，計算各峰的保存時間和峰面積〔以綠原酸為1，因為綠原酸在其中峰面積最大〕。結(jié)果顯示供試品溶液的指紋圖譜在24h內(nèi)穩(wěn)定，各峰相對保存時間的RSD在0.25%~1.46％內(nèi)，相對峰面積的RSD在0.57%~1.86％內(nèi)。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.4.3重現(xiàn)性實驗［10］取同一批號藥材粉末5份，照前述處理方法制得供試品溶液，分別進樣測定。實驗說明本法重現(xiàn)性良好。2.5不同采收時間、不同炮制方法、市售和新穎藥材HPL指紋圖譜的建立取不同采收時間、不同炮制方法、市售和新穎藥材，分別按上述2.2方法制備供試品溶液，進樣并記錄指紋圖譜。結(jié)果見圖4~6。圖3木瓜采收第1批藥材的HPL指紋圖譜〔部分圖〕〔略〕指紋圖譜1，2，3，4，5，6，7，8，9〔自下向上〕依次為木瓜采收第1，2，3，4，5，6，7，8，9次曬制樣品圖4木瓜不同采收季節(jié)以及不同炮制方法樣品水溶性HPL〔略〕1.第8批燙制樣品；2.第8批曬制樣品圖5木瓜不同炮制方法比擬圖〔略〕1.第9批存放1年的曬制樣品；2.第9批新穎曬制樣品圖6木瓜不同存放時間比擬圖〔略〕3討論從指紋圖譜共有峰的峰位和峰形看，11個樣本較為相似。說明該指紋圖譜具有一定的特征性，根本能反映木瓜藥材的特征。但是，來自不同采收時間、不同炮制方法、不同存放時間樣本的非共有峰和各峰峰面積存在著明顯差異，說明不同來源樣本所含的化學成分及其含量有明顯不同。采收時間：第5號樣本，即采收的第5批藥材峰數(shù)最多、特征峰的峰面積最大，因此木瓜采收時間應(yīng)選用第5批的采收時間7月12日。炮制方法：曬制方法比燙制方法的藥材峰數(shù)多、特征峰的峰面積大。因此藥材應(yīng)采用曬的方法。存放時間：對藥材而言，新穎藥材的成分要比存放1年時間藥材的成分含量高，說明存放時間對藥物成分含量也有一定影響。3.1共有峰與非共有峰的標定［10］3.1.1共有峰綜合比擬，11個樣本具有2個共有峰：17.339in〔綠原酸〕、19.796in〔咖啡酸〕；另外還有很多批含有13.257in的峰。30in之后和7~10in內(nèi)的峰為溶劑峰。3.1.2非共有峰標定從色譜圖可知，第1批藥材中非共有峰保存時間是12.635，14.287，15.158in，第5藥材中非共有峰保存時間是15.34，16.88，22.79in，第8批藥材中非共有峰保存時間是20.75，21.19in，第2，3，4，6，7，9批藥材無非共有峰。3.1.3聚類分析對采收時間不同的9批藥材HPL指紋圖譜中各特征峰相對峰面積〔以綠原酸為對照峰進展計算〕進展聚類分析〔以夾角余弦為測度〕，利用Exel軟件,分別采用相關(guān)系數(shù)和夾角余弦作測度。結(jié)果見表1，聚類分析結(jié)果見圖7。表1不同采收時間木瓜聚類分析〔略〕圖7聚類分析圖〔略〕通過聚類分析以及上述共有峰、非共有峰的比擬，以出峰多少為比擬根底，11批藥材可以分為3類第2，3，6，9，9批為一類，有13，17，19in3個共有峰；第1，5，8，8/批為一類，出峰各有5個，并有13，17，19in3個共有峰；第4，7批為一類，有17，19in兩個共有峰。從上述聚類分析看，5，6，7采集時間較好，其中又以第5批為最正確采集時間。其他采集時間不是很好。3.2提取方法采用60％乙醇、乙醇、甲醇、水4種不同溶劑，對提取時間、提取次數(shù)、藥材粒徑進展了正交實驗，同時對甲醇超聲提取〔提取時間、提取溶劑〕進展了優(yōu)化實驗，最終選擇上述供試品制備方法。3.3參照物選擇實驗初期，我們選擇了綠原酸、咖啡酸、齊墩果酸3種標準混合物〔如圖〕，后通過比照藥材圖譜，選用綠原酸、咖啡酸為對照品即可〔因為圖譜中此波長齊墩果酸沒有吸收，咖啡酸含量很低，故僅選擇綠原酸為對照品〕。3.4色譜條件選擇本實驗試圖采用醋酸乙酯部位的色譜條件〔另文發(fā)表〕，結(jié)果發(fā)現(xiàn)別離情況很差，因此做了相應(yīng)修改，獲得了較好的別離效果。3.5水溶性成分與中等極性成分比擬甲醇和醋酸乙酯提取的主要成分很相似，但甲醇提取物的峰相對要多一些。通過本實驗，對木瓜藥材的控制有了一個比擬明確的定量和定性標準，便于藥材的標準化種植。但是由于木瓜資源多樣性以及采集時間差異性，導(dǎo)致測定結(jié)果變化較大，同時試驗設(shè)計還需要更全面考慮，如制備樣品的方法、藥材資源還應(yīng)該更廣泛、實驗中出現(xiàn)炮制方法、存放時間引起的變化由于樣本數(shù)量影響還不能明確結(jié)論，另外，這些變化的原因也值得進一步研究。參考文獻：［1］中國醫(yī)學科學院藥物研究所．中藥志，第3冊，第2版［］.北京：人民衛(wèi)生出版杜，1993：215.［2］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中國藥典，Ⅰ部［S］.廣州：廣東科技出版社，1995：46.［3］中國醫(yī)學科學院藥物所．中草藥有效成分的研究，第1分冊［］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1972：435.［4］陳日來，吳廷俊，戴躍進.四種木瓜主要化學成分的比擬［J］.華西藥學雜志，2000，15〔16〕：38.［5］肖崇厚.中藥化學［］.上海：上海科學技術(shù)出版社，1997：15.［6］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