03物理圖譜與測序2公開課一等獎省優(yōu)質課大賽獲獎課件

第三章

DNA物理圖譜構建及序列測定物理圖譜（physicalmap）物理圖/限制性圖譜（restrictionmap）是各種限制性內切酶切點在某一DNA分子或DNA片段上排列，因為各酶切點之間距離是以堿基對（kbp→mbp）表示，所以可計算出二切點間絕對距離，所以限制圖也稱物理圖。物理圖譜構建是基因組研究主要組成部分。質粒pBR322限制圖一、限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease）

細菌核酸內切酶識別、剪切特殊雙鏈DNA序列用途：DNA物理圖譜構建、DNA序列分析、基因分離、基因定位、DNA重組1.細菌修飾作用和限制性核酸內切酶發(fā)覺20世紀50年代，Luria&Human、Bertani&Weigle：噬菌體→細菌菌株1，正常生長?！毦?，生長受到強烈抑制；少數存活，再次感染菌株2，正常生長——受到宿主特意修飾。機制？E.coli菌株λ噬菌體感染率KBCE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111111962，Arber：宿主修飾在噬菌體DNA上進行1965，Arber：宿主對入侵噬菌體修飾與噬菌體DNA降解親密相關；預言細菌中存在位點特異性限制酶；修飾是宿主甲基化酶作用結果：建立細菌限制-修飾（R-M）系統概念。Arber假說細菌中存在含有相同位點特異性2種酶：限制性內切核酸酶；甲基化酶細菌限制-修飾系統是抵抗外來侵襲一個主要辦法1978年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎

限制性核酸內切酶發(fā)覺1968年，Linn&Arber于大腸桿菌B中發(fā)覺第一個限制性內切核酸酶（I型：識別特異剪切隨機）。1968年，Meselson&Yuan從大腸桿菌K中取得高純度限制性內切核酸酶（I型）。1970年，Smith從流感嗜血桿菌Rd中分離出第一個II型限制性內切核酸酶——HindII。流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）能快速降解外源噬菌體DNA，其細胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解本身DNA，→HindⅡ限制性內切酶。HindⅡ限制性內切酶位點和切割位點以下：

5'…GTPy↓PuAC…3'

3'…CAPu↑PyTG…5'

上世紀80年代，限制性內切酶開始克隆表示限制-修飾系統Smith等工作流感嗜血桿菌Rd與其它細菌相同DNA堿基化程度低：m5C，N6-mA；但存在甲基化酶細胞粗提物→磷酸纖維素層析→蛋白；*

S-腺苷甲硫氨酸轉移甲基→魚精DNA/T7DNA。——檢測出4種腺嘌呤甲基化酶其中一個處理T7DNA→免受HindII裂解；先用HindII處理魚精DNA→對應甲基化位點破壞。——限制性內切酶-修飾性甲基化酶共識別位點限制性內切酶識別位點處甲基基團伸入到雙螺旋大溝中去，妨礙了限制性內切酶作用。磷酸纖維素層析——陽離子交換層析氨基酸等點點（isoelectricpoint，pI）

在一定pH條件下，氨基酸分子中所帶正電荷和負電荷數相等，即凈電荷為零，此時溶液pH稱為該氨基酸等電點(isoelectricpoint,pI)

。氨基酸在等電點時溶解度最小。正離子pH<pI兩性離子pH=pI負離子pH>pI離子交換層析分離蛋白質甲基轉移酶催化甲基化（methylation）甲基供體：S-腺苷甲硫氨酸甲基受體：被修飾堿基（A、C多于G、T）堿基甲基化修飾不是隨機，而是限于一定次序或DNA某一區(qū)域，在甲基化酶作用下進行，甲基化是可逆。甲基化意義：幫助細胞識別和區(qū)分本身DNA和外來DNA；調整基因表示；幫助DNA修復等。腺苷轉移酶PPi+Pi+甲硫氨酸ATPS-腺苷甲硫氨酸(S-腺苷Met，SAM)S-腺苷甲硫氨酸甲基轉移酶RHR—CH3腺苷SAMS—腺苷同型半胱氨酸同型半胱氨酸SAM為體內甲基直接供體

H2O腺苷或胞嘧啶甲基化是各種細菌限制修飾系統一部份

真核生物中也存在廣泛DNA甲基化修飾現象

哺乳動物DNA甲基化修飾和X染色體失活、胚胎發(fā)育、組織分化乃至癌癥親密相關。真核生物，修飾則影響基因表示。大多數情況下，甲基化修飾造成基因表示緘默。而且這種修飾在細胞有絲分裂時能夠代代傳遞新遺傳學分枝--表觀遺傳學2.限制性內切酶種類與特征限制性內切酶形式多樣大?。篜vuII（157個氨基酸）；CjeI（1250個氨基酸）。純化分類3000余種限制性內切酶，超出250種特異識別序列。研發(fā)工作仍在繼續(xù)：分析細胞提取物，計算機分析已知基因組數據。同裂酶（識別序列與已經有重復）；新識別位點傳統上將限制性內切酶按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等原因劃分為三大類。然而，蛋白測序結果表明，限制性內切酶改變各種多樣，若從分子水平上分類，則應該遠遠不止這三種。

I型限制性內切酶

兼有限制性內切酶和修飾酶活性多亞基蛋白復合體(3x105-4x105Da)，需Mg2+、ATP、SAM。在識別位點很遠地方任意切割DNA鏈：EcoB識別位點——TGA*（N）8TGCT；EcoK識別位點——AA°C（N）6GTGC（A為可能甲基化位點，N表示任意堿基）。切割位點在識別位點1000bp以外，且無特異性。不產生確定限制片段，不具備實用性。II型限制性內切酶種類多（2x104-10x104），需Mg2+激活絕大多數Ⅱ酶識別序列/切割位點由4～8個核苷酸多以同二聚體結合于DNA，識別對稱序列；極少作為單聚體結合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續(xù)序列（EcoRI：GAATTC）；另一些識別不連續(xù)序列（BglI：GCCNNNNNGGC）。切割后產生一個3‘羥基端和一個5’磷酸基團對應修飾酶需要S-甲硫氨酸腺苷存在IIS型限制性內切酶Ⅱ型含有相同輔因子要求，但識別位點是非對稱，也是非間斷，長度為4-7bp，切割位點可能在識別位點一側20bp范圍內（如FokI和AlwI）。III型限制性內切酶兼有限制-修飾兩種功效，需Mg2+、ATP；當ATP、SAM同在時，DNA分解與甲基化同時進行識別位點之外切開DNA鏈：EcoP1和EcoP15識別位點分別是AGACC和CAGCAG，切割位點則在下游24-26bp處。極少能產生完全切割片段，不具備實用價值。3.識別位點序列測定1970年，Smith建立：堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase）T4多聚核苷酸激酶（T4PolynucleotideKinase）胰腺脫氧核糖核酸酶（DNaseI）蛇毒磷酸二酯酶（snakevenomphosphodiesterase）電泳堿性磷酸酶T4多聚核苷酸激酶T4多核苷酸激酶是一個磷酸化酶，可將ATPg-磷酸基轉移至DNA或RNA5'末端。

牛胰脫氧核糖核酸酶（DNaseI）嘧啶嘌呤嘧啶嘌呤蛇毒磷酸二酯酶4.影響限制性內切酶活性原因*DNA純度DNA制備過程中污染：蛋白質、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、高濃度鹽離子等，都有可能抑制核酸內切限制酶活性。對策：①增加核酸內切限制酶用量，平均每微克底物DNA可高達10單位甚至更多。

②擴大酶催化反應體積，以使?jié)撛谝种圃虮粚叵♂尅?/p>

③延長酶催化反應保溫時間。內切酶活力單位1U定義為37℃、1h內完全分解1μgλ-DNA所需酶量。

理論用量：1μgλ-DNA只需1U酶作用1h；實際用量：2U，2h樣品含酶抑制劑，重新純化限量用酶——非特異性核酸酶活性Dnase污染（活性需Mg2+，DNA儲存緩沖液含EDTA）*DNA甲基化程度從大腸桿菌中分離質粒DNA通?；煊校篸am甲基化酶，G*ATC；dcm甲基化酶，C*CA/TGG基因克隆中使用失去了甲基化酶大腸桿菌菌株制備質粒DNA，防止被核酸內切限制酶局部消化，甚至完全不被消化。核酸內切限制酶不切割甲基化核苷酸序列應用：甲基化酶識別序列同一些限制酶識別序列相鄰，抑制在這些位點發(fā)生切割作用，改變核酸內切限制酶識別序列特異性；經過甲基化作用將內部限制酶識別位點保護起來。*酶切消化反應溫度

大多數核酸內切限制酶標準反應溫度都是37℃，但也有許多例外情況，比如SmaⅠ是25℃、MaeⅠ是45℃。消化反應溫度低于或高于最適溫度，都會影響核酸內切限制酶活性，甚至最終造成完全失活。*DNA分子結構

DNA分子不一樣構型對核酸內切限制酶活性也有很大影響。一些核酸內切限制酶切割超螺旋質粒DNA或病毒DNA所需要酶量，要比消化線性DNA高出許多倍，最高可達20倍。

另外，還有一些核酸內切限制酶，切割它們自己處于不一樣部位限制位點，其效率亦有顯著差異?！稽c偏愛（Sitepreference）位點偏愛（Sitepreference）

EcoRⅠ酶切割噬菌體中5個位點時不是隨機，靠近右端位點比分子中間位點切割快10倍；EcoRⅠ和HindⅢ在噬菌體DNA中切割速率分別有10倍和14倍差異。噬菌體DNA有4個SacⅡ位點，三個在中央，一個在右臂，對中央三個位點酶切速度快50倍。

EcoRⅠ對腺病毒2DNA不一樣位置切點切割速率也不一樣。

*核酸內切限制酶緩沖液

核酸內切限制酶標準緩沖液組份包含氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、Tris-HCL、β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。Mg2+作用是提供二價陽離子。緩沖液Tris-HCL使反應混合物pH恒定在酶活性所要求最正確數值范圍之內。巰基試劑對于保持一些核酸內切限制酶穩(wěn)定性是有用，而且還可保護其免于失活。不一樣酶對離子強度要求差異很大，并依次將限制酶緩沖液按離子強度差異分為高、中、低三種類型，離子強度以NaCl來滿足，濃度分別為100mM、50mM和0mM。NEBuffer1（黃色）：

10mMBisTris丙烷-HCl,10mMMgCl2,1mMDTT（pH7.0@25℃）。NEBuffer2（藍色）：

10mMTris-HCl,10mMMgCl2,50mMNaCl,1mMDTT（pH7.9@25℃）。NEBuffer3（紅色）：

50mMTris-HCl,10mMMgCl2,100mMNaCl,1mMDTT（pH7.9@25℃）。NEBuffer4（綠色）：

20mMTris-Ac,10mMMg(Ac)2,50mMKAc,1mMDTT（pH7.9@25℃）。寶生物企業(yè)緩沖液特殊緩沖液：NEBufferEcoRI：

50mMNaCl,100mMTris-HCl,10mMMgCl2,0.025%TritonX-100（pH7.5@25℃）雙酶切緩沖液選擇5.星星活性（staractivity）

在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相同序列，這個改變特殊性稱星星活性。引發(fā)星星活性原因：甘油濃度高（>5%）；酶過量（>100U/l）；離子強度低（<25mM）；pH值過高（>8.0）；加入了有機溶劑如二甲基亞砜、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；用其它二價陽離子如Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+代替了Mg2+。不一樣酶對上述條件敏感性不一樣，如PstⅠ比EcoRⅠ對高pH更敏感，但后者對甘油濃度更敏感。二、構建物理圖譜克隆載體構建物理圖譜基本策略：將基因組DNA片段與載體整合進行克隆，取得重合克隆群。載體基本條件：自主復制原點，在宿主高效表示、穩(wěn)定遺傳；單克隆位點；篩選標識①質粒載體②柯斯質粒黏粒（cosmid）——人工構建含有λ噬菌體DNAcos序列和質粒復制子載體。cos序列是噬菌體DNA中將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需DNA序列。1978年Collins&Hohn等為克隆真核DNA大片段構建（質粒外源基因容量-10Kb）組成包含質粒復制起點（ColE1）、氨卡青霉素抗性標識、cos位點。黏粒特點含有λ噬菌體特征。黏粒在克隆了外源DNA在體外包裝成噬菌體顆粒后，能夠感染宿主菌并在細菌內按照λ噬菌體DNA方式環(huán)化起來。但黏粒載體不含有λ噬菌體全部必要基因，所以不會使宿主菌裂解，無法形成子代噬菌體顆粒。含有質粒特征。黏粒含有質粒復制子，可在宿主菌內像質粒DNA一樣進行復制?？寺⊥庠碊NA容量大。黏粒本身相對較小，普通只有5～7kb，而最大克隆片段可達45kb左右。能與有同源序列質粒進行重組。黏?？寺≈饕眍愃剖删w載體。與外源片段連接時，粘粒載體相當于噬菌體載體左右臂，cos位點經粘端退火，與外源片段相間連接成多聯體。多聯體與噬菌體包裝蛋白混合時，噬菌體A基因蛋白末端酶功效將切割兩個cos位點，并將兩個同方向cos位點之間片段包裝到噬菌體顆粒。這些噬菌體顆粒感染大腸桿菌時，線狀重組DNA如噬菌體DNA被注入細胞并經過cos位點環(huán)化，形成完整粘粒載體，可象質粒一樣復制并使宿主取得抗藥性。與噬菌體載體不一樣，外源片段克隆在粘粒載體中以菌落形式表現出來，非噬菌斑。這種菌落總和組成基因文庫。上述帶有外源片段重組粘粒，可經過輔助噬菌體感染或誘導潛伏原噬菌體生長，重組粘粒cos位點可作為包裝底物，造成重組粘粒DNA被包裝到噬菌體顆粒中去。這些轉導性顆粒從細胞中釋放出來，既可無限期貯存，也可直接感染其它菌株。

③酵母人工染色體

（Yeastartificialchromosomes

YAC）利用釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）染色體復制元件構建載體。釀酒酵母形態(tài)為扁圓形和卵形，生長代時為90分鐘；含16條染色體，其大小為225-1900kb，總計有14×106bp；具真核mRNA加工活性。

人工染色體必備結構元件自主復制序列（autonomouslyreplicationsequences，ARS）：含有酵母菌中DNA進行雙向復制所必須信號；著絲粒（centromere，CEN）：負責染色體向子細胞傳遞；端粒（telomere，TEL）：對染色體DNA末端起保護作用。YAC載體——pYAC4

YAC載體工作原理YAC載體主要是用來構建大片段DNA文庫（高等真核生物基因組文庫），不用作常規(guī)基因克隆。BamHⅠ切割pYAC4形成微型酵母染色體，含染色體復制必要順式元件，可攜帶酵母染色體大小DNA片段。BamHⅠ切割后形成微型酵母染色體，用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因sup4內部位點形成染色體兩條臂，與外源大片段DNA相連形成大型人工酵母染色體，轉化進入酵母菌后可象染色體一樣復制，并隨細胞分裂分配到子細胞中去，到達克隆大片段DNA目標。裝載外源DNA片段重組子造成抑制基因sup4插入失活，形成紅色菌落；載體自連形成白色菌落。裝載不一樣外源DNA片段紅色重組酵母菌菌落群體就組成YAC文庫。YAC文庫裝載DNA片段大小普通可達200-500kb，有可達1Mb以上，甚至到達2Mb。

YAC載體缺點存在嵌合現象，即一個YAC克隆中插入子可能來自兩個或多個不一樣片段（嵌合克隆約占總克隆5%～50%）。YAC克隆穩(wěn)定性差，插入片段會出現缺失（deletion）和基因重（rearrangement）現象。YAC染色體與宿主細胞染色體大小相近，插入片段分離、純化較困難，轉化效率亦較低。缺失和插入重排（rearrangement）DNA分子內較大片段交換，稱為重組或重排。

④細菌人工染色體（BAC）基于大腸桿菌F質粒構建，高通量低拷貝質粒載體。每個環(huán)狀DNA分子中攜帶一個抗生素抗性標識，一個起源于大腸桿菌F因子（致育因子）嚴謹型控制復制子oriS（Shizuyaetal.1992），一個易于DNA復制由ATP驅動解旋酶（（RepE）以及三個確保低拷貝質粒準確分配至子代細胞基因座（parA,parB,和parC）。BAC載體容量100-350Kb

F質粒

大腸桿菌F因子是一個約100kb質粒。編碼60各種參加復制、分配和接合過程蛋白質（WillettsandSkurray，1987）。即使F因子通常以雙鏈閉環(huán)DNA（1-2個拷貝/細胞）形式存在，但它能夠在大腸桿菌染色體中最少30個位點處進行隨機整合（Low，1987）。攜帶F因子細胞，或以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)表示三根發(fā)樣狀F菌毛。F菌毛為供體與受體細胞之間產生性接觸所必需。第一代BAC載體（Shizuyaetal.1992）不含能用于區(qū)分攜帶重組子抗生素抗性細菌菌落與攜帶空載體細菌菌落標識物。新型BAC載體能夠經過α互補原理篩選含有插入片段重組子，并設計了用于回收克隆DNANotⅠ酶切位點和用于克隆DNA測序Sp6開啟子、T7開啟子（Kimetal.1996;Asakawaetal.1997）。NotⅠ識別序列，位點十分稀少。重組子經過NotⅠ消化后，能夠得到完整插入片段。Sp6、T7是起源于噬菌體開啟子，用于插入片段末端測序。BAC載體空載時大小約7.5kb，在大腸桿菌中以質粒形式復制，含有一個氯霉素抗性基因。外源基因組DNA片段能夠經過酶切、連接克隆到BAC載體多克隆位點上，經過電穿孔方法將連接產物導入大腸桿菌重組缺點型菌株。裝載外源DNA后重組質粒經過氯霉素抗性和LacZ基因α–互補篩選。BAC載體優(yōu)點以大腸桿菌為宿主，電轉化，效率高BAC載體以超螺旋形式存在于大腸桿菌，提取方便；復制子源自F質粒，遺傳穩(wěn)定，嵌合、重組少；DNA單拷貝存在，適于傳統菌落培養(yǎng)，可采取菌落原位雜交篩選目地基因；克隆位點兩側有T7和SP6開啟子，可制備RNA探針或對插入片段測序。菌落原位雜交篩選目地基因E.coliRNA聚合酶結構

E.coli只有一個RNA聚合酶

全酶（holoenzyme）:

α2ββ′ωσ

(450kD)關鍵酶（coreenzyme）：α2ββ′ω

大腸桿菌RNA聚合酶全酶識別并結合于開啟子三、基因組研究相關圖譜遺傳圖譜物理圖譜基因圖譜序列圖譜1.遺傳圖譜（geneticmap）/遺傳連鎖圖/連鎖圖譜（linkagemap）以含有遺傳多態(tài)性（在一個遺傳位點上具一個以上等位基因，在群體中出現頻率皆高于1%）遺傳標識為“路標”，以遺傳學距離（在減數分裂事件中兩個位點之間進行交換、重組百分率，1%重組率稱為1cM）為圖距基因組圖。6000多個遺傳標識將人基因組分成6000多個區(qū)域，使連鎖分析法能夠找到某一致病或表現型基因與某一標識鄰近（緊密連鎖）而定位。是定位疾病基因和分析基因是個關鍵。

遺傳圖——基因定位遺傳圖譜DNA標識

第1代標識：經典遺傳標識，以蛋白質或免疫學多態(tài)性位點為標識?！獦俗R位點與所研究性狀間連鎖關系。ABO血型位點標識，HLA（人類白細胞抗原）位點標識?！阎鄳B(tài)性蛋白位點少，技術復雜、準確性差。70年代，限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）：群體中不一樣個體DNA序列僅有約1%差異——DNA多態(tài)性位點，酶切位點變異——（RFLP）。限制性片段長度多態(tài)性第2代標識

80年代，微衛(wèi)星中心（minisatellitecore）、可變串聯重復VNTR（variablenumberoftandemrepeats）提供不一樣長度重復片段（6~12個核苷酸——1989年微衛(wèi)星標識（microsatellitemarker）系統發(fā)覺和建立，結合PCR技術——簡單序列長度多態(tài)性（simplesequencelengthpolymorphism，SSLP），擴增片段長度多態(tài)性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）等。微衛(wèi)星（microsatellite）標識微衛(wèi)星又稱為簡單重復序列（simplesequencerepeat，SSR）。這種重復序列重復單位很短，經常只有2個、3個或4個核苷酸如一條染色體TCTGAGAGAGACGC另一染色TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就組成了多態(tài)性。第3代標識90年代，單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)：指染色體基因組水平上由單個核苷酸變異引發(fā)DNA序列多態(tài)性，含有分布廣、密度高（人類基因組中每1000個核苷酸就有一個SNP）、多態(tài)性豐富等特點。

果蠅連鎖圖14號染色體遺傳圖譜上家系定位示意圖

7號染色體上已定位遺傳病

疾病基因確定2.物理圖譜基因組DNA限制性酶切片段排列次序圖酶切片段在DNA鏈上定位基因組中基因間次序顯性化比遺傳圖譜分辨率更高是從遺傳圖到序列圖中間圖譜核苷酸序列不一樣DNA，經酶切后產生不一樣長度DNA片段，由此組成獨特酶切圖譜。

3.序列圖譜

包含制備DNA片段化及堿基分析、DNA信息翻譯多階段過程。經過測序得到基因組序列圖譜。大規(guī)模測序基本策略:

逐一克隆法：對連續(xù)克隆系中排定BAC克隆逐一進行亞克隆測序并進行組裝（公共領域測序計劃）。

全基因組鳥槍法：在一定作圖信息基礎上，不經大片段連續(xù)克隆系構建，直接將基因組分解成小片段隨機測序，利用超級計算機進行組裝（美國Celera企業(yè)）。

逐一克隆法鳥槍法4.基因圖譜

在識別基因組所包含蛋白質編碼序列基礎上繪制結合相關基因序列、位置及表示模式等信息圖譜。判別出全部基因位置、結構與功效，最主要方法是經過基因表示產物mRNA反追到染色體位置。能有效地反應在正?；蚴芸貤l件中表示全基因組時空圖。能夠了解某一基因在不一樣時間不一樣組織、不一樣水平表示；也能夠了解一個組織中不一樣時間、不一樣基因中不一樣水平表示，還能夠了解某一特定時間、不一樣組織中不一樣基因不一樣水平表示。

對基因轉錄表示產物mRNA互補cDNA（其片段稱為表示序列標簽，EST）進行大規(guī)模測序是序列標簽位點主要起源，并以此構建人類基因組轉錄圖（基因圖）。AportionoftheE.colichromosomeshowinggenesandoperons.

Adotindicatesthepromoterforeachgeneoroperon.Arrowsandcolorindicatethedirectionoftranscribtion:darkbluegenesaretranscribedlefttoright,lightbluearetranscribedrighttoleft.Overlappinggeneareshowningreen.四、構建DNA物理圖譜方法完整物理圖譜包含：人類基因組不一樣載體DNA克隆片段重合群圖；大片段限制性內切酶切點圖；DNA片段或異DNA序列（sequencetagssite，STS）路標圖；基因組中廣泛存在特征型序列（如CpG序列、Alu序列，isochore）等標識圖?；驹硎前妖嫶鬅o從下手DNA先“敲碎”，再拼接。以Mb、kb、bp作為圖距，以DNA探針STS（sequencetagssite）序列為路標。主要方法限制性核酸內切酶降解法部分變性法DNA聚合酶法雜交電鏡法（環(huán)形成法）末端標識法1.限制性核酸內切酶降解法部分酶解法交叉酶解法部分酶解法2個基本步驟完全降解：限制性內切酶將放射性標識DNA完全降解，經凝膠電泳分離后進行自顯影，圖譜顯示組成該DNA鏈酶切片段數目和大小。部分降解：末端標識DNA一條鏈，以相同酶部分降解（控制反應條件使——酶量、溫度、時間DNA鏈上該酶切口隨機斷裂），電泳分離及自顯影。比較2個自顯影圖譜，依據片段大小及彼此間差異排出酶切片段在DNA鏈上位置——片那段重合。

一線性DNA片斷長18.1kb，EcoRI完全消化后電泳，得8個片段，部分消化產生15個片斷。完全消化片斷：A(4.6),B(4.0),C(3.3),D(2.5),E(2.0),F(1.0),G(0.5),H(0.2)部分消化片斷:

6.66.55.34.64.24.03.83.53.32.52.01.0

0.70.50.2部分消化大片斷是完全消化小片斷之和，可推測：6.6=2+4.6（E+A）；

6.5=2.5+4.0（D+B）；5.3=2+3.3（E+C）；3.8=0.5+3.3（G+C）；0.7=0.2+0.5（G+H）；4.2=0.2+4（B+H）或4.2=0.2+0.5+1.0+2.5（H+F+G+D）；3.5=1.0＋2.5（F+D）或3.5=0.2+3.3（H+C）

或3.5=0.5+1.0+2.0（G+F+E）AECGHFDB4.62.03.32.54.00.50.21.0EcoRI在此DNA片段上酶切圖譜交叉酶解法AB2kb5kb3kbDNA片段總長3kbEcoRⅠ：1.7，0.9，0.4HpaⅡ：1.6，1.4EcoRⅠ+HpaⅡ：1.2,0.9,0.5,0.4HpaⅡ一個切點EcoRⅠ1.7kb片段不在末端-無0.2、0.1片段EcoRⅠ0.9和0.4kb都在末端→→2.部分變性法DNA分子各區(qū)域AT含量不一樣，部分變性后，富含AT區(qū)出現電鏡下可見環(huán)狀結構。比較限制酶切DNA部分變性及全分子部分變性結果，確定酶切位點次序。richAT

richAT

3.末端標識法待測DNA片段5’或3’端先用32P標識；用某限制性內切酶部分酶解；電泳和放射自顯影分析這一組酶解片段長度。各相鄰片段長度之差就是二個相鄰切點之間距離，也即它們之間片段大小。以足夠數量限制性內切酶分別進行分析，對DNA片段作出比較詳細物理圖譜。

GFEDCBA－

*

A-G

*

A-F

A-EA-D*

A-C

*

A-B

*

A

*

＋

末端標識

*電泳凝膠上DNA片斷判定人類部分染色體物理圖譜TheE.coligenome五、核酸序列分析DNA一級結構測定

（DNAsequencing）

DNA一級結構:

多聚脫氧核苷酸鏈中脫氧核苷酸排列次序——堿基序列DNA堿基次序測定主要方法

1975年，Sanger加減法1977年，Sanger雙脫氧終止法1977年，Maxam&Gilbert化學斷裂法1.雙脫氧法(dideoxymethod)或末端終止法(chaintermination)DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.Sanger,F.,Nicklen,S.&Coulson,A.R.(1977).

ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA,74,5463-7.asecondNobelPrizeinChemistryin1980DNA生物合成參加DNA復制主要物質底物:

dATP,dGTP,dCTP,dTTP（dNTP）聚合酶:

DNA聚合酶（DNApolymerase）模板（template）:

解開成單鏈DNA母鏈引物（primer）:

互補于模板鏈寡核苷酸片段，

提供3-OH末端使dNTP能夠依次聚合子鏈DNA延長方向:5’→3’DNA生物合成過程DNA聚合酶催化反應雙脫氧核苷酸雙脫氧核苷酸摻入終止DNA鏈合成測序體系*****(1-5%)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測*****+–變性聚丙烯酰胺凝膠電泳丙烯酰胺+雙丙烯酰胺→三維網狀孔結構變性劑:尿素電泳裝置放射自顯影利用放射性同位素所發(fā)射出來帶電粒子(α或β粒子)作用于感光材料鹵化銀晶體，從而產生潛影，這種潛影可用顯影液顯示，成為可見"像"。

2.自動測序HooddevelopedaprototypeautomatedDNAsequencerin1985Leroy

Hood(1938---)earnedanM.D.FromJohnsHopkinsUniversityin1964andaPh.D.inbiochemistryfromtheCaliforniaInstituteofTechnologyin1968.HewontheLemelson-MITPrizeforinventingfourinstruments:theDNAgenesequenceandsynthesizer,andtheproteinsynthesizerandsequencer

熒光物質作為標識物CCGAATGCTGACGTA熒光物質標識雙脫氧核苷酸t(yī)heSangerInstituteTeam55:SequencingFacility3.堿基序列測定新方法("Nextgeneration"methods)美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）設置“RevolutionaryGenomeSequencingTechnologies”基金，目標:20，測定一人全基因組序列只$10萬，年，費用將降為$1000。Waston5月31日獲贈裝有他本人完整基因組圖譜數據DVD光盤。（2個月，$200萬）基因組學先鋒J.CraigVenter、炎黃一號‘第一個中國人基因組圖譜先后完成2008，首張非