抗生素類藥物的分析

第十一章抗生素類藥物的分析張蕾1第一節(jié)概述1、抗生素的定義

抗生素是指在低微濃度下即可對某些生物的生命活動有特異抑制作用的化學物質(zhì)的總稱。一、抗生素藥物的特點2、抗生素的來源:＊生物合成(發(fā)酵)＊化學合成或者半合成23、抗生素的特點（1）化學純度低：（2）穩(wěn)定性差：活性組分易發(fā)生變化同系物多，異構(gòu)體多，降解產(chǎn)物多抗生素質(zhì)量的復(fù)雜性

3二、抗生素藥物的質(zhì)量分析（一）鑒別試驗（二）抗生素類藥物常規(guī)檢查項目：用化學法、物理化學法以及生物學法來確認是哪種抗生素1、穩(wěn)定性指標：結(jié)晶性、酸堿度、水分或干燥失重等3、安全性指標：異常毒性、熱原或細菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)、無菌試驗2、控制有機和無機雜質(zhì)的指標：溶液的澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、熾灼殘渣、重金屬等。4（三）效價測定：有效成分的含量測定理化方法生物學法1、生物學測定法：以抗生素抑制細菌生長能力或殺菌能力作為衡量效價標準。稀釋法比濁法管碟瓊脂擴散法國際通用法CHP5③

既適用較純精制品,也適用于純度較差產(chǎn)品④

已知或新發(fā)現(xiàn)抗生素都能應(yīng)用⑤同一類型的抗生素,不需分離,可一次測定它們的總效價。①原理恰好與臨床要求一致，更能夠確定抗生素效價。②靈敏度高，需要樣品量較小優(yōu)點：缺點：①

操作步驟多，測定時間較長②

誤差較大62、物理化學測定法：根據(jù)抗生素化學結(jié)構(gòu)利用其理化性質(zhì)測定主藥的含量。優(yōu)點：①

操作簡單、省時、方法準確②

具有較高的專屬性

①不一定代表生物效價缺點：7β–內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類、多肽類、抗腫瘤類林可霉素類、其他抗生素類三、分類（按結(jié)構(gòu)與性質(zhì)）：8第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類抗生素

青霉素類（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)（一）結(jié)構(gòu)和性質(zhì)：9頭孢菌素類7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA10（青霉素G、芐青霉素）（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)代表藥物：11氨芐西林（氨芐青霉素）（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)代表藥物：12阿莫西林（羥氨芐青霉素）（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)代表藥物：137-AminocephalospoanicAcid,7-ACA頭孢氨芐147-AminocephalospoanicAcid,7-ACA頭孢拉定15頭孢羥氨芐7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA16頭孢噻吩鈉7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA17酸性性質(zhì):與堿金屬(Na+、K+)成鹽1、羧基:

7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)與有機堿(普魯卡因)成鹽普魯卡因青霉素18

7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)性質(zhì):2、手性C:﹡﹡﹡﹡﹡頭孢菌素類:*C6*

C7青霉素類：*C3*

C5*

C6

19

7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)性質(zhì):﹡﹡﹡﹡﹡頭孢菌素類：青霉素類：3、共軛體系

母核無明顯UV多數(shù)有苯環(huán)取代基母核有共軛體系20

7-AminocephalospoanicAcid,7-ACA（6-AminopenicillanicAcid,6-APA)不穩(wěn)定四元環(huán)張力大

酰胺鍵易水解性質(zhì):4、β–內(nèi)酰胺環(huán)21ⅰⅱ

22ⅲ

ⅳ

23（一）K+、Na+反應(yīng)二、鑒別試驗焰色→鮮黃色+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+焰色→紫色+0.1%四苯硼鈉+Ac→↓白

K+24（二）呈色反應(yīng)1.羥肟酸鐵反應(yīng)β-內(nèi)酰胺類紅色絡(luò)合物25H+Fe3+/3（紅、棕、褐）262、硫酸及硫酸-甲醛反應(yīng)硫酸-變色酸反應(yīng)硫酸-硝酸反應(yīng)（二）呈色反應(yīng)1.羥肟酸鐵反應(yīng)β-內(nèi)酰胺類紅色絡(luò)合物273.茚三酮反應(yīng)△α-氨基藍紫色28α-氨基、伯胺某些羥基胺類酮式烯醇式茚三酮茚三酮縮合藍紫色294.雙縮脲反應(yīng)β-內(nèi)酰胺類（開環(huán)分解）似肽鍵30藍紫色315.與變色酸-硫酸反應(yīng)活潑“-CH2-”青霉素阿莫西林氨芐西林150℃（縮合）32（縮合）336.與重氮苯磺酸反應(yīng)（偶合）酚羥基頭孢哌酮34（三）沉淀反應(yīng)1.遇酸→↓在過量HCl或有機溶劑中溶解352.有機胺鹽反應(yīng)重氮化-偶合反應(yīng)重氮化-偶合反應(yīng)芳伯氨基36光譜法（四）1、UV法樣品、分解產(chǎn)物Cu2+頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉A280nm/A264nm=1.30～1.5037氯唑青霉素3410.682雙氯青霉素3420.653苯唑青霉素3391.328(nm)382、IR法β-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺39色譜法（五）1、TLC法對照品對照法2、HPLC法40三、含量測定（水解）（一）碘量法1.原理水解產(chǎn)物定量過量剩余β-內(nèi)酰胺類ChP41第一步第二步理論上:1mol青霉素≈8molI原子;實際上:1mol青霉素≈8~9molI原子※溫度，放置時間，pH，濃度，碘過量程度，雜質(zhì)多少等影響因素。42（1）主試驗：2.方法（2）空白試驗：I2液（定過量）I2液（定過量）43例注射用普魯卡因青霉素含量測定取裝量差異項下的內(nèi)容物，精密稱取約0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氫氧化鈉溶液1ml放置20分鐘，再加1mol/L鹽酸溶液1ml與醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，搖勻，在20～25℃暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定至近終點時加淀粉指示液，繼續(xù)滴定并強力振搖，至藍色消失；44另精密量取供試品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，搖勻，在暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定，作為空白。同時用青霉素鈉對照品同法測定作對照，算出供試品的含量。45V樣空V樣對照液+緩沖液+碘液+回滴+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴V對空V對供試液+緩沖液+碘液+回滴+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴46空白試驗A、消除樣品已降解產(chǎn)物的干擾B、消除樣品中其他消耗碘的雜質(zhì)的干擾C、消除碘揮發(fā)造成的誤差以未經(jīng)水解的樣品作空白測定47采用標準品平行對照測定A、可消除溫度、pH、操作、環(huán)境等條件的影響B(tài)、使本法測定結(jié)果與微生物檢定法一致483.條件（1）弱酸性：pH4.5（2）溫度：24～26℃溫度＞38℃未水解的供試品亦消耗碘（3）水解時間：以水解20分鐘后的耗碘量最大。494.特點（1）靈敏度高樣品:碘=1:8（2）反應(yīng)條件、實驗操作要求高V對、V對空V樣、V樣空1份含量加試劑次序、反應(yīng)時間、滴定速度相同10~100μg/ml505、計算51（二）汞量法1.原理（水解）青霉素族ChP522.方法樣品以未經(jīng)水解的樣品作空白測定53例青霉素鈉含量測定取本品約50mg，精密稱定，加水5ml溶解后，加1mol/L氫氧化鈉溶液5ml，搖勻，放置15分鐘，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸鹽緩沖液(pH4.6)20ml及水20ml，搖勻，照電位滴定法(附錄ⅦA),用鉑電極為指示電極，汞-硫酸亞汞電極為參比電極，在35～40℃，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)緩慢滴定，（控制滴定過程約為15分鐘），不計第一個等當點，計算第二個等當點時消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相當于7.128mg的總青霉素(按C16H17N2NaO4S計算)。

54另取本品約0.5g，精密稱定，加水與上述醋酸鹽緩沖液各25ml，振搖使完全溶解，在室溫下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，終點判斷方法同上.每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當于7.128mg的降解物（按C16H17N2NaO4S計算）。

總青霉素的百分含量與降解物的百分含量之差值即為青霉素的含量。553.討論（1）以第二次滴定突躍為終點電位法指示終點（2）反應(yīng)摩爾比

1:1（3）空白試驗消除已降解產(chǎn)物干擾（4）優(yōu)點

不需標準品564.計算57精密稱取含水量為0.5%的青霉素鈉0.0502g，按藥典方法測定總青霉素含量時，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)6.97ml。另精密稱取上述樣品0.5013g，按藥典方法測定降解物含量時，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)1.33ml。以干燥品計算，求樣品中青霉素的含量。例青霉素鈉含量測定(0.02moL/L)58MissZhang，Pleasehelpme!591.硫醇汞鹽法（1）原理（咪唑）青霉素族ChP（三）可見-紫外分光光度法60咪唑61（2）方法對照品法（3）計算pH962例氨芐西林鈉含量測定取本品約60mg置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置另一100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5ml，置25ml量瓶中，加硼酸緩沖液2.5ml與醋酐的乙腈溶液（1→50）0.25ml，放置5min后，加咪唑溶液至刻度，搖勻，置60℃水浴中，加熱30min，取出冷卻，照分光光度法（附錄ⅣA），在325nm的波長處測定吸收度；另取氨芐西林三水合物標準品，按同法測定，計算，即得。

63（3）討論a.咪唑催化的水解產(chǎn)率高，硫醇汞鹽穩(wěn)定（≥3h）b.側(cè)鏈有-NH2時，需加醋酐先將其乙酰化后才能發(fā)生上述反應(yīng)64pH965（4）特點A、簡便快速B、用標準品對照，重現(xiàn)性良好，RSD≤1%66（水解）2.酸水解-銅鹽法（1）原理穩(wěn)定劑JP青霉素族673.羥肟酸比色法USPJPβ-內(nèi)酰胺類NaOHFe3+/3H+紅色68第三節(jié)氨基糖苷類抗生素鏈霉素雙氫鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素69鏈霉素+N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元糖鏈霉雙糖胺一、化學結(jié)構(gòu)及性質(zhì)鏈霉胍+鏈霉糖70絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺

糖苷元

糖慶大霉素71慶大霉素C復(fù)合物慶大霉素C1R=HR1、R2=CH3慶大霉素C2R=R2=H

R1=CH3慶大霉素C1aR、R1、R2=H慶大霉素C2aR=CH3R1=R2=H

慶大霉素C2bR=R1=HR2=CH372一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)多與硫酸成鹽鏈霉素3個慶大霉素5個堿性中心堿性（一）（二）溶解性水溶性73鏈霉素pH5～7.5慶大霉素pH2～12穩(wěn)定（四）穩(wěn)定性（五）鏈霉素水解產(chǎn)物反應(yīng)74二、鑒別試驗（一）共同反應(yīng)羥基胺結(jié)構(gòu)1、茚三酮反應(yīng)△氨基糖苷結(jié)構(gòu)，具羥基胺類和α-氨基酸的性質(zhì)。75N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)2、乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+紅色水解產(chǎn)物N-甲基葡萄糖胺特有反應(yīng)76(縮合)77紅色對二甲氨基苯甲醛H+781、麥芽酚反應(yīng)

鏈霉糖特有反應(yīng)H+分子重排（二）鏈霉素的特征反應(yīng)79鏈霉胍特有反應(yīng)8-羥基喹啉2、坂口反應(yīng)α-萘酚+OH-次溴酸鈉紅色紅色80坂口反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)81三、雜質(zhì)檢查（一）鏈霉素雜質(zhì)檢查鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）方法TLC中的對照品法（BP）1.來源反應(yīng)中間體82對微生物的活性無明顯差異毒副作用和耐藥性不同發(fā)酵菌種不同工藝差別C組分比例不一致規(guī)定控制各組分的相對百分含量ChPUSPBPJP慶大霉素C組分的測定（二）83λmax=330nm衍生化原理1.841-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物85RP－HPLC方法：規(guī)定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%計算：峰面積歸一化法（柱前衍生化）λmax=330nm86第四節(jié)四環(huán)素類抗生素ABCD8712345678910111288四環(huán)素（TC）tetracycline89金霉素(CTC)

chlortetracycline氯四環(huán)素90土霉素(OTC)

oxytetracycline氧四環(huán)素91多西環(huán)素(DOTC)doxycycline脫氧土霉素92美他環(huán)素（METC）metacycline9394一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)（一）兩性1.與酸、堿均能成鹽2.強酸或強堿中溶解度↑

酚羥基、烯醇型羥基弱酸性二甲胺基弱堿性pH4.5~7.2難溶于水,pH低于4或高于8時,可以得到高濃度的水溶液.95吸濕性（二）多含結(jié)晶水與金屬離子生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+

UV（三）與金屬離子絡(luò)合（四）pH3~7.5熒光

9697不穩(wěn)定性（五）1.差向異構(gòu)化淡黃→黑藍色熒光98差向四環(huán)素99（土霉素、多西環(huán)素不易差向異構(gòu)化）1002.降解反應(yīng)（1）酸性下降解λmax=445nmλmax=435nm橙黃色101脫水四環(huán)素102～～TCETCATCEATC＜＜103（2）堿性下降解（熒光）104對各種氧化劑都不穩(wěn)定，且堿性水溶液特別易氧化，顏色很快變深形成色素，干燥品較穩(wěn)定，但貯存時遇光可使顏色變深（因空