噬菌體展示技術(shù)講稿課件

噬菌體展示技術(shù)課件噬菌體展示技術(shù)課件什么是噬菌體展示是一項(xiàng)篩選技術(shù)，將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。表型————基因型展示肽————編碼基因使大量多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶、細(xì)胞表面受體等）的多肽配體通過(guò)淘選得以快速鑒定簡(jiǎn)介什么是噬菌體展示是一項(xiàng)篩選技術(shù)，將外源多肽或蛋白與噬菌Landmarksofphagedisplay1985第一次發(fā)表噬菌體展示技術(shù)；展示多肽SmithGP.Science.1985;228:1315-71988噬菌質(zhì)粒系統(tǒng)1990抗體片段的展示1993展示cDNA文庫(kù)1994/1995研發(fā)了‘phagetwo-hybrid’技術(shù)1996首次體內(nèi)invivo淘選試驗(yàn)1998噬菌體展示載體作為基因?qū)胼d體1999Combinationofphagedisplaywithhigh-densityarrays2001AutomatedphagedisplayselectionKillingcancercellsbytargeteddrug-carryingphagenanomedicinesPublished:3April2008BMCBiotechnology2008,8:37doi:10.1186/1472-6750-8-37Landmarksofphagedisplay展示系統(tǒng)DisplaySystemCellBased1、PhageDisplay2、CellSurfaceDisplayCellFree

1、RibosomeDisplay2、mRNADisplay展示系統(tǒng)DisplaySystem噬菌體展示系統(tǒng)的分類根據(jù)噬菌體不同PhageM13,f1,fdT7,T4,lamda根據(jù)載體不同VectorTruePhagePhagemid根據(jù)文庫(kù)不同Library

隨機(jī)肽庫(kù)、cDNA文庫(kù)、抗體文庫(kù)、蛋白質(zhì)文庫(kù)噬菌體展示系統(tǒng)的分類根據(jù)噬菌體不同PhageM13,

M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)

絲狀噬菌體：M13、f1和fd。單鏈DNA病毒,6407bp?；蚪M編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關(guān)的有兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。DNA在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細(xì)菌不被裂解，但生長(zhǎng)速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒

M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)

絲狀噬菌體：M13、f1和fd。LifeCycleofM13pIII蛋白結(jié)合于E.Coli的F纖毛;病毒ssDNA進(jìn)入細(xì)菌的胞漿合成dsDNA；以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過(guò)滾環(huán)復(fù)制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37℃）。感染后1小時(shí)內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞分泌1000個(gè)噬菌體。LifeCycleofM13pIII蛋白結(jié)合于E.C次要衣殼蛋白pIII406aa組成，5個(gè)拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個(gè)功能區(qū)組成：N1穿膜區(qū)：作用于E.coli細(xì)胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關(guān)。N2受體結(jié)合區(qū)：負(fù)責(zé)結(jié)合F菌毛。CT疏水區(qū)：組裝前黏附在細(xì)菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關(guān)。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過(guò)程中，增加各個(gè)功能域之間的靈活性。次要衣殼蛋白pIII主要衣殼蛋白pVIII每個(gè)病毒子含約2700個(gè)拷貝，約10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表達(dá)的多肽是低價(jià)的，而以pVIII融合子方式表達(dá)的多肽則是高價(jià)的（每個(gè)病毒子~200個(gè)拷貝）。這種高價(jià)pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而低價(jià)pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。所有Ph.D.文庫(kù)都是pIII融合方式（每個(gè)病毒子展示5個(gè)拷貝的外源多肽）。主要衣殼蛋白pVIII每個(gè)病毒子含約2700個(gè)拷貝，約1pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?

pVIII展示的多肽比較小，如果太大會(huì)影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示300aa的多肽。噬菌質(zhì)粒能展示的蛋白已經(jīng)達(dá)到86kDa。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每個(gè)病毒子含５個(gè)拷貝的pIII蛋白，這五個(gè)蛋白都可以融合短肽而不影響噬菌體的感染力?？截悢?shù)不同。pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?pV噬菌體質(zhì)粒－方便克隆、增強(qiáng)遺傳穩(wěn)定性

噬菌體質(zhì)粒特征：攜帶有欲在噬菌體上融合展示的蛋白基因，沒(méi)有其他噬菌體基因。有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(322ori)和噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1ori－用于合成ssDNA)。有包裝序列信號(hào)（packingsignal）。有供篩選的抗生素標(biāo)記基因。Helperphage：提供噬菌體質(zhì)粒復(fù)制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶（f1oridefect)。噬菌體質(zhì)粒－方便克隆、增強(qiáng)遺傳穩(wěn)定性

噬菌體質(zhì)粒特征：噬菌體展示技術(shù)流程淘選的方法－親和淘選

直接包被法淘選法：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單直接。缺點(diǎn)：偶爾會(huì)導(dǎo)致配體結(jié)合位點(diǎn)難以進(jìn)入

可能是由于分子的立體封阻

或者是靶分子表面的部分變性而引起液相法：先將噬菌體庫(kù)在液相中與靶分子進(jìn)行預(yù)結(jié)合，然后將噬菌體-靶分子復(fù)合物親和捕獲于親和介質(zhì)上，如：鏈霉親和素包被的表面。建庫(kù)：[例子]含編碼12肽DNA序列為5’CATTCTCACTCGGCCGACGGGGCT(NNK)12GGGGCCGCTGGGGCCCAAACTGTTGAA3’，其中N代表A、T、C、G四種堿基，K代表G、T兩種堿基，(NNK)12為編碼隨機(jī)12肽部分，劃線部分含有BglⅡ識(shí)別序列。擴(kuò)增---嵌合---噬菌體擴(kuò)增噬菌體展示技術(shù)流程淘選的方法－親和淘選建庫(kù)：[例子]親和淘選噬菌體肽庫(kù)與靶分子相互作用洗滌去未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的噬菌體將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)三輪淘選后，克隆測(cè)序親和淘選噬菌體肽庫(kù)與靶分子相互作用噬菌體展示的應(yīng)用抗原表位分析?制備特異性抗體?制備疫苗、多價(jià)疫苗?構(gòu)建新型的生物催化劑如Renetal(1997)將T4DNA連接酶展示于T4噬菌體，所表達(dá)的融合蛋白能夠高效連接黏性或者平末端。有可能把催化某一代謝途徑的多種酶展示到噬菌體上，制造人工的多酶復(fù)合體?；蛘甙殉砂偕锨€(gè)酶分子的活性位點(diǎn)展示到同一個(gè)噬菌體顆粒上，制造superenzyme。篩選酶抑制劑是尋找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis從肽庫(kù)中篩選到非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制FVIIa活性的肽段。噬菌體展示的應(yīng)用噬菌體展示的應(yīng)用蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用噬菌體cDNA文庫(kù)與芯片相結(jié)合(a)合成噬菌體cDNA文庫(kù)。(b)生物淘選。(c)鋪板，挑克隆入微孔板，為制備芯片做準(zhǔn)備。噬菌體展示的應(yīng)用蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用噬菌體展示的應(yīng)用應(yīng)用舉例用病人IgE血清對(duì)6種不同的cDNA文庫(kù)淘選，5輪后，挑出38,000個(gè)克隆，鑒別了233種蛋白，其中47種為已知，186種是新的過(guò)敏源。煙曲霉(Aspergillusfumigatus)已成為臨床上僅次于白色念珠菌的一種重要的條件致病真菌。草本枝孢(小麥黑霉病菌)Cladosporiumherbarum雞腿蘑（Coprinuscomatus）皮屑牙胞菌(Malasseziafurfur)花生和人肺組織Crameri,R.etal.(2001)Tappingallergenrepertoiresbyadvanced

cloningtechnologies.Int.Arch.AllergyImmunol.124,43–47噬菌體展示的應(yīng)用應(yīng)用舉例用病人IgE血清對(duì)6種不同的cDNA噬菌體表面展示肽庫(kù)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：M13無(wú)需體外包裝電轉(zhuǎn)化效率高,庫(kù)容量大2.8×109

M13噬菌體純化步驟簡(jiǎn)單，可加速淘選進(jìn)程可避免細(xì)胞蛋白的污染Anyligand(naturalorsynthetic)隨機(jī)肽庫(kù)體內(nèi)篩選器官特異性多肽缺點(diǎn)：僅適合展示小的多肽(=<20氨基酸)載體容量<1kb；且有序列依賴性不能篩選Naturalligand(T7cDNA文庫(kù))不能篩選DNA-,RNA-結(jié)合肽(用T7載體文庫(kù)可以)噬菌體表面展示肽庫(kù)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：THANS！THANS！噬菌體展示技術(shù)課件噬菌體展示技術(shù)課件什么是噬菌體展示是一項(xiàng)篩選技術(shù)，將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。表型————基因型展示肽————編碼基因使大量多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶、細(xì)胞表面受體等）的多肽配體通過(guò)淘選得以快速鑒定簡(jiǎn)介什么是噬菌體展示是一項(xiàng)篩選技術(shù)，將外源多肽或蛋白與噬菌Landmarksofphagedisplay1985第一次發(fā)表噬菌體展示技術(shù)；展示多肽SmithGP.Science.1985;228:1315-71988噬菌質(zhì)粒系統(tǒng)1990抗體片段的展示1993展示cDNA文庫(kù)1994/1995研發(fā)了‘phagetwo-hybrid’技術(shù)1996首次體內(nèi)invivo淘選試驗(yàn)1998噬菌體展示載體作為基因?qū)胼d體1999Combinationofphagedisplaywithhigh-densityarrays2001AutomatedphagedisplayselectionKillingcancercellsbytargeteddrug-carryingphagenanomedicinesPublished:3April2008BMCBiotechnology2008,8:37doi:10.1186/1472-6750-8-37Landmarksofphagedisplay展示系統(tǒng)DisplaySystemCellBased1、PhageDisplay2、CellSurfaceDisplayCellFree

1、RibosomeDisplay2、mRNADisplay展示系統(tǒng)DisplaySystem噬菌體展示系統(tǒng)的分類根據(jù)噬菌體不同PhageM13,f1,fdT7,T4,lamda根據(jù)載體不同VectorTruePhagePhagemid根據(jù)文庫(kù)不同Library

隨機(jī)肽庫(kù)、cDNA文庫(kù)、抗體文庫(kù)、蛋白質(zhì)文庫(kù)噬菌體展示系統(tǒng)的分類根據(jù)噬菌體不同PhageM13,

M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)

絲狀噬菌體：M13、f1和fd。單鏈DNA病毒,6407bp。基因組編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關(guān)的有兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。DNA在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細(xì)菌不被裂解，但生長(zhǎng)速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒

M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)

絲狀噬菌體：M13、f1和fd。LifeCycleofM13pIII蛋白結(jié)合于E.Coli的F纖毛;病毒ssDNA進(jìn)入細(xì)菌的胞漿合成dsDNA；以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過(guò)滾環(huán)復(fù)制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37℃）。感染后1小時(shí)內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞分泌1000個(gè)噬菌體。LifeCycleofM13pIII蛋白結(jié)合于E.C次要衣殼蛋白pIII406aa組成，5個(gè)拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個(gè)功能區(qū)組成：N1穿膜區(qū)：作用于E.coli細(xì)胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關(guān)。N2受體結(jié)合區(qū)：負(fù)責(zé)結(jié)合F菌毛。CT疏水區(qū)：組裝前黏附在細(xì)菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關(guān)。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過(guò)程中，增加各個(gè)功能域之間的靈活性。次要衣殼蛋白pIII主要衣殼蛋白pVIII每個(gè)病毒子含約2700個(gè)拷貝，約10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表達(dá)的多肽是低價(jià)的，而以pVIII融合子方式表達(dá)的多肽則是高價(jià)的（每個(gè)病毒子~200個(gè)拷貝）。這種高價(jià)pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而低價(jià)pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。所有Ph.D.文庫(kù)都是pIII融合方式（每個(gè)病毒子展示5個(gè)拷貝的外源多肽）。主要衣殼蛋白pVIII每個(gè)病毒子含約2700個(gè)拷貝，約1pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?

pVIII展示的多肽比較小，如果太大會(huì)影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示300aa的多肽。噬菌質(zhì)粒能展示的蛋白已經(jīng)達(dá)到86kDa。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每個(gè)病毒子含５個(gè)拷貝的pIII蛋白，這五個(gè)蛋白都可以融合短肽而不影響噬菌體的感染力?？截悢?shù)不同。pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?pV噬菌體質(zhì)粒－方便克隆、增強(qiáng)遺傳穩(wěn)定性

噬菌體質(zhì)粒特征：攜帶有欲在噬菌體上融合展示的蛋白基因，沒(méi)有其他噬菌體基因。有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(322ori)和噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1ori－用于合成ssDNA)。有包裝序列信號(hào)（packingsignal）。有供篩選的抗生素標(biāo)記基因。Helperphage：提供噬菌體質(zhì)粒復(fù)制、合成ssDNA和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶（f1oridefect)。噬菌體質(zhì)粒－方便克隆、增強(qiáng)遺傳穩(wěn)定性

噬菌體質(zhì)粒特征：噬菌體展示技術(shù)流程淘選的方法－親和淘選

直接包被法淘選法：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單直接。缺點(diǎn)：偶爾會(huì)導(dǎo)致配體結(jié)合位點(diǎn)難以進(jìn)入

可能是由于分子的立體封阻

或者是靶分子表面的部分變性而引起液相法：先將噬菌體庫(kù)在液相中與靶分子進(jìn)行預(yù)結(jié)合，然后將噬菌體-靶分子復(fù)合物親和捕獲于親和介質(zhì)上，如：鏈霉親和素包被的表面。建庫(kù)：[例子]含編碼12肽DNA序列為5’CATTCTCACTCGGCCGACGGGGCT(NNK)12GGGGCCGCTGGGGCCCAAACTGTTGAA3’，其中N代表A、T、C、G四種堿基，K代表G、T兩種堿基，(NNK)12為編碼隨機(jī)12肽部分，劃線部分含有BglⅡ識(shí)別序列。擴(kuò)增---嵌合---噬菌體擴(kuò)增噬菌體展示技術(shù)流程淘選的方法－親和淘選建庫(kù)：[例子]親和淘選噬菌體肽庫(kù)與靶分子相互作用洗滌去未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的噬菌體將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)三輪淘選后，克隆測(cè)序親和淘選噬菌體肽庫(kù)與靶分子相互作用噬菌體展示的應(yīng)用抗原表位分析?制備特異性抗體?制備疫苗、多價(jià)疫苗?構(gòu)建新型的生物催化劑如Renetal(1997)將T4DNA連接酶展示于T4噬菌體，所表達(dá)的融合蛋白能夠高效連接黏性或者平末端。有可能把催化某一代謝途徑的多種酶展示到噬菌體上，制造人工的多酶復(fù)合體?；蛘甙殉砂偕锨€(gè)酶分子的活性位點(diǎn)展示到同一個(gè)噬菌體顆粒上，制造superenzyme。篩選酶抑制劑是尋找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis從肽庫(kù)中篩選到非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制FVIIa活性的肽段。噬菌體展示的應(yīng)用噬菌體展示的應(yīng)用蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用噬菌體cDNA文庫(kù)與芯片相結(jié)合