第十六章-細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老課件

本章主要內(nèi)容

●細(xì)胞凋亡(Apoptosis)●細(xì)胞衰老(cellularaging）就單細(xì)胞生物而言，細(xì)胞死亡即個體的死亡。對于多細(xì)胞生物，細(xì)胞死亡是維持生物體的正常生長發(fā)育及生命活動的必要條件。細(xì)胞死亡方式包括：細(xì)胞凋亡、壞死、自噬性細(xì)胞死亡。它們具有不同形態(tài)和分子特征，發(fā)揮不同的功能，但均受到細(xì)胞內(nèi)在基因控制。第一節(jié)細(xì)胞死亡第一節(jié)細(xì)胞死亡程序性細(xì)胞死亡（programmeddeath,PCD）：細(xì)胞死亡受細(xì)胞內(nèi)由遺傳機(jī)制決定的“死亡程序”控制，要求特定的基因表達(dá)，是“主動”而非“被動”的過程。死亡方式主要包括3種：凋亡、壞死、由細(xì)胞自噬導(dǎo)致的自噬性細(xì)胞死亡。

一、細(xì)胞凋亡◆細(xì)胞凋亡概念◆細(xì)胞凋亡特征◆細(xì)胞凋亡檢測◆凋亡的生理學(xué)及醫(yī)學(xué)意義◆凋亡的分子機(jī)制●細(xì)胞凋亡(apoptosis)：一種有序的或程序性的細(xì)胞死亡方式，是細(xì)胞接受某些特定信號刺激后進(jìn)行的正常生理應(yīng)答反應(yīng)。該過程具有典型的形態(tài)學(xué)和生化特征，凋亡細(xì)胞最后以凋亡小體被吞噬消化。

●Apoptosis的概念源自于希臘語，原意是指樹葉或花的自然凋落。

細(xì)胞發(fā)生程序性死亡時，就像樹葉或花的自然凋落一樣，凋亡的細(xì)胞散在于正常組織細(xì)胞中，被巨噬細(xì)胞吞噬，無炎癥反應(yīng)，不遺留疤痕。細(xì)胞凋亡的概念（一）細(xì)胞凋亡的特征◆凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，核糖體逐漸與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，沿著核膜分布。

◆凋亡小體的形成：染色質(zhì)斷裂，與某些細(xì)胞器等聚集在一起，被反折細(xì)胞質(zhì)膜包裹，形成球形的結(jié)構(gòu)，稱為凋亡小體?！舻蛲鲂◇w為鄰近細(xì)胞或吞噬細(xì)胞所吞噬，在溶酶體內(nèi)被消化分解。細(xì)胞凋亡的過程及特征（一）細(xì)胞凋亡的特征（二）細(xì)胞凋亡的檢測方法◆形態(tài)學(xué)觀察：化學(xué)染色法（臺盼藍(lán)）和熒光染色（DAPI染細(xì)胞核）、吉姆薩染色法（染色質(zhì)著色）◆DNA電泳：呈現(xiàn)出梯狀條帶（DNAladders）◆DNA斷裂的原位末斷標(biāo)記：凋亡細(xì)胞的核DNA斷裂后產(chǎn)生3’-OH末端，用熒光素對凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色。

a正常T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞b凋亡細(xì)胞(掃描電鏡)c凋亡細(xì)胞(透射電鏡)

（二）細(xì)胞凋亡的檢測方法◆DNA在核小體間斷裂形成180——200bp的片段，瓊脂電泳出現(xiàn)梯狀條帶。細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對照7．Marker凋亡細(xì)胞的DNA電泳◆彗星電泳法：凋亡細(xì)胞中DNA降解片段泳動速度較快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)彗星式圖案?！袅魇郊?xì)胞分析：凋亡的亞二倍體細(xì)胞?！魴z測細(xì)胞膜成分變化：磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜外側(cè)。（二）細(xì)胞凋亡的檢測方法●生物發(fā)育過程中的需要●參與免疫耐受的形成：對識別自身抗原的T細(xì)胞克隆進(jìn)行選擇性地消除?！裆硇员Ｗo(hù)機(jī)制，清除體內(nèi)多余、受損或危險(xiǎn)的細(xì)胞而不對周圍的細(xì)胞或組織產(chǎn)生傷害?！窬S持機(jī)體細(xì)胞總數(shù)的平衡和機(jī)體的生命活力?！袢梭w細(xì)胞凋亡的失調(diào)，引發(fā)多種疾病。凋亡不足引發(fā)腫瘤和自身免疫病；過度凋亡導(dǎo)致免疫功能的喪失或引發(fā)炎癥。（三）細(xì)胞凋亡的生理學(xué)及醫(yī)學(xué)意義

蝌蚪在向成體變態(tài)發(fā)育過程中尾的消失

脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育

細(xì)胞凋亡使神經(jīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的數(shù)量相匹配發(fā)育過程中手和足的成形過程（四）細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制●

caspase家族●

caspase切割底物●外界信號與凋亡●線粒體與凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子◆物理性因子:

包括射線（紫外線，射線等）；

較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等?！艋瘜W(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子（超氧自由基，Ｈ２Ｏ２）；DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑；正常生理因子（激素，細(xì)胞生長因子等）失調(diào)；凋亡因子如腫瘤壞死因子（TNF）處理等。1、caspase家族線蟲Caenorhabditiselegans是研究個體發(fā)育和細(xì)胞程序性死亡的理想材料（生命周期短，細(xì)胞數(shù)量少）。線蟲神經(jīng)系統(tǒng)由302個細(xì)胞組成。這些細(xì)胞來自于407個前體細(xì)胞。也就是說105個細(xì)胞發(fā)生了程序性死亡。◆caspase的發(fā)現(xiàn)◆caspase的發(fā)現(xiàn)控制線蟲細(xì)胞凋亡的基因主要有3個：Ced-3、Ced-4和Ced-9Ced-3和

Ced-4的作用是誘發(fā)凋亡；Ced-9阻止Ced-3、Ced-4激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是白介素－１轉(zhuǎn)換酶

(Interleukin-1-convertingenzyme，ICE)，即caspase1。caspase家族◆哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)15種caspase蛋白。根據(jù)在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮的功能不同，可分為兩類：◆凋亡起始者（起始caspases）：2、8、9、10、11參與凋亡啟動，負(fù)責(zé)對效應(yīng)者的前體切割，產(chǎn)生有活性的效應(yīng)者。◆凋亡執(zhí)行者（效應(yīng)caspases）：

3、6、7執(zhí)行細(xì)胞凋亡，負(fù)責(zé)切割細(xì)胞核內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)中結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白，使其失活或活化，保證凋亡程序的正常進(jìn)行。caspase是天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶的簡稱。caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸，

切割位點(diǎn)是靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵。caspase家族

2、caspases依賴性細(xì)胞凋亡途徑●由死亡受體起始的外源途徑●由線粒體起始的內(nèi)源途徑（1）死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

◆

當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號分子(FasＬ,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白結(jié)合。◆銜接蛋白募集caspases2、8和10聚集在受體部位?！?/p>

caspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡過程中caspases級聯(lián)效應(yīng)胞外信號誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡2、8和10凋亡起始

◆

下游caspases活化后，作用于底物。裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder；裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂重排，便于吞噬細(xì)胞識別并吞噬。（1）死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡fas

fas又稱作APO-1，屬TNF受體和NGF受體家族。1993年人白細(xì)胞分型國際會議統(tǒng)一命名為CD95。fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Fas與配體（如TNF）結(jié)合發(fā)生三聚化，使胞內(nèi)的DD區(qū)（Deathdomain）與接頭蛋白FADD的DD區(qū)結(jié)合。FADDN端通過DED區(qū)（deatheffectordomain）與Caspase-8前體蛋白和CAP3結(jié)合，激活caspase-8

。caspase-8酶原自剪切活化，切割效應(yīng)caspase（

caspase

-3酶原），產(chǎn)生有活性的caspase

-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。caspase可降解結(jié)構(gòu)蛋白、信號蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白、周期蛋白等等?；罨腸aspase-8還通過切割信號分子Bid，將凋亡信號傳遞到線粒體，引發(fā)凋亡的內(nèi)源途徑，使凋亡信號進(jìn)一步擴(kuò)大。

（2）細(xì)胞凋亡的內(nèi)源途徑

◆當(dāng)caspase8活化后，其中一個途徑被運(yùn)送到線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。

◆CytC與胞質(zhì)中Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子)結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

Apaf-1：線蟲Ced4在哺乳動物細(xì)胞中的同源蛋白，通過N端CARD結(jié)構(gòu)域（caspases募集結(jié)構(gòu)域）招募細(xì)胞質(zhì)中的caspase9酶原。

◆caspase9酶原在凋亡復(fù)合體中發(fā)生自身切割而活化。

◆活化的caspase9切割并激活caspase3、7，引發(fā)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡信號途徑線粒體向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)釋放多個凋亡相關(guān)因子，誘發(fā)caspases非依賴性的細(xì)胞凋亡。凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）：從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核，引起核內(nèi)DNA凝集并斷裂。限制性內(nèi)切核酸酶G（endonucleaseG）:負(fù)責(zé)線粒體DNA的修復(fù)和復(fù)制。受到凋亡信號的刺激，endoG從線粒體釋放，進(jìn)入細(xì)胞核，對核DNA進(jìn)行切割。

3、caspases非依賴性的細(xì)胞凋亡2002年10月7日英國人悉尼·布雷諾爾、美國人羅伯特·霍維茨和英國人約翰·蘇爾斯頓，因在細(xì)胞程序性死亡方面的研究獲諾貝爾諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎。SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.Sulston

二、細(xì)胞壞死細(xì)胞壞死是細(xì)胞受到急性強(qiáng)力傷害時立即出現(xiàn)的反應(yīng)。早期表現(xiàn)為細(xì)胞膜破壞，線粒體腫脹。繼而溶酶體破裂,細(xì)胞內(nèi)容物流出,引起炎癥。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死比較Kerr（

1972）最先提出，與細(xì)胞壞死的區(qū)別是：①細(xì)胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體；②凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器；③不引起炎癥；④線粒體無變化，溶酶體活性不增加；⑤內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖譜呈梯狀；⑥凋亡通常是生理性變化，而細(xì)胞壞死是病理性變化。壞死細(xì)胞凋亡細(xì)胞細(xì)胞壞死細(xì)胞壞死時，細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生滲漏。細(xì)胞內(nèi)容物，包括膨大和破碎的細(xì)胞器以及染色質(zhì)片段，釋放到胞外，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。染色質(zhì)不發(fā)生凝集，也不產(chǎn)生有規(guī)律的200bp的DNA降解片段，而是被隨機(jī)降解，電泳時產(chǎn)生“拖尾”現(xiàn)象。細(xì)胞壞死的作用細(xì)胞壞死可能在細(xì)胞的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞感染病原體后，可能通過“自殺”方式消滅病原體，可以作為凋亡的“替補(bǔ)”。被感染的細(xì)胞壞死后，胞內(nèi)的病原體信號分子如病毒核酸等被釋放，能夠被免疫細(xì)胞識別，促發(fā)固有免疫反應(yīng)。三、自噬性細(xì)胞死亡細(xì)胞自噬：細(xì)胞通過溶酶體與雙層膜包裹的細(xì)胞自身物質(zhì)融合，從而降解細(xì)胞自身物質(zhì)的過程。壽命較短的蛋白質(zhì)通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解；壽命較長的蛋白質(zhì)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)通過細(xì)胞自噬途徑，由溶酶體進(jìn)行降解。細(xì)胞自噬過程膜泡的形成、擴(kuò)展自噬體的形成自噬體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體內(nèi)含物被溶酶體中的水解酶消化三、自噬性細(xì)胞死亡細(xì)胞自噬的特征及過程第二節(jié)細(xì)胞衰老◆衰老的概念◆Hayflick界限◆衰老特征◆衰老的分子理論（一）衰老的概念●細(xì)胞衰老(cellaging，cellsenescence)：一般指復(fù)制衰老，即體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂后，停止生長，細(xì)胞形態(tài)和生理代謝活動發(fā)生顯著改變的現(xiàn)象?！衽囵B(yǎng)細(xì)胞的衰老，機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的衰老

（二）Hayflick界限●1961年，Hayflick首次報(bào)道了體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞具有增殖分裂的極限?！馠ayflick界限：細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的細(xì)胞，不是不死，是有一定壽命的；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，平均傳代40——60次，此后細(xì)胞逐漸解體死亡。（二）Hayflick界限◆癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞◆細(xì)胞的增殖能力與供體年齡有關(guān)◆物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著一定的關(guān)系細(xì)胞來源人胚肺成纖維細(xì)胞中年人成纖維細(xì)胞老年人成纖維細(xì)胞可增殖代數(shù)

40-60

20

2-4不同年齡來源的人成纖維細(xì)胞的增殖代數(shù)物種的壽命與體外培養(yǎng)時細(xì)胞傳代次數(shù)的關(guān)系三、衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●細(xì)胞核的變化●內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化:衰老動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)彌散性分散于核周胞質(zhì)中，腫脹，糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)總量似乎是減少了，蛋白質(zhì)合成量減少?！窬€粒體的變化:通常，細(xì)胞中線粒體的數(shù)量隨齡減少，而其體積則隨齡增大?！裰旅荏w的生成：由溶酶體或線粒體轉(zhuǎn)化而來?！衲は到y(tǒng)的變化

細(xì)胞核的變化◆體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，細(xì)胞核隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加不斷增大。◆細(xì)胞核的核膜內(nèi)折，染色質(zhì)固縮化。膜系統(tǒng)的變化◆衰老的細(xì)胞，其膜流動性降低、韌性減小?！羲ダ霞?xì)胞間，間隙