細(xì)胞化學(xué)技術(shù)課件

細(xì)胞化學(xué)技術(shù)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倪麟主管技師組織化學(xué)技術(shù):應(yīng)用化學(xué)、物理、生物化學(xué)、免疫學(xué)或分子生物學(xué)的原理和技術(shù)與組織學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的技術(shù)，能在組織切片定性、定位地顯示某種物質(zhì)的存在與否以及分布狀態(tài)。還可進(jìn)一步用顯微分光光度計(jì)或圖象分析儀測(cè)定光鏡切片中該物質(zhì)反應(yīng)的強(qiáng)度，獲得定量的信息。細(xì)胞化學(xué)技術(shù):應(yīng)用組織化學(xué)技術(shù)于游離細(xì)胞的樣品(如細(xì)胞涂片)，則稱細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。一組織細(xì)胞化學(xué)染色

組織細(xì)胞化學(xué)染色是將形態(tài)和功能相結(jié)合的細(xì)胞科學(xué)。它是在保持完整的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的前提下,運(yùn)用化學(xué)反應(yīng)將被檢細(xì)胞內(nèi)的各類化學(xué)成分和細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生理活性物質(zhì)原位地顯示。因而對(duì)于探索化學(xué)成分、生理功能、新陳代謝及細(xì)胞生理和病理改變有著重要的意義。

組織細(xì)胞染色的范圍一般可分為：蛋白質(zhì)類（氨基酸)、核酸類、多糖類、脂類、鹽類或金屬類，采用的方法通常為化學(xué)結(jié)合物理溶解顯示及酶-底物反應(yīng)。常用組織細(xì)胞化學(xué)染色過(guò)氧化物酶

peroxidase,(POX)1.原理血細(xì)胞中的POX能分解H2O2而釋放出新生態(tài)氧，后者可使聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)沉淀于細(xì)胞質(zhì)酶活力處。2.正常陽(yáng)性細(xì)胞:①.中性粒細(xì)胞呈均勻顆粒狀藍(lán)黑色陽(yáng)性。

②.嗜酸性粒細(xì)胞呈均勻粗大顆粒狀藍(lán)色陽(yáng)性。

③.單核細(xì)胞呈彌散細(xì)顆粒狀藍(lán)色陽(yáng)性。單核細(xì)胞呈彌散弱陽(yáng)性中性粒細(xì)胞呈粗顆粒強(qiáng)陽(yáng)性

過(guò)碘酸一雪夫反應(yīng)

periodicacidSchiffreaction,PAS此試驗(yàn)中能被過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)呈陽(yáng)性的多糖類物質(zhì)有糖原、粘多糖、糖蛋白、糖脂、還包括一些磷脂類物質(zhì)等，因此PAS陽(yáng)性不能簡(jiǎn)單地就表明有糖原的存在，只是在對(duì)血細(xì)胞的組織化學(xué)研究中通常習(xí)慣于將PAS陽(yáng)性認(rèn)同于糖原。PAS染色雖然不完全代表糖原，但在血液系統(tǒng)疾病特別在各類型急性白血病中卻有相當(dāng)大的應(yīng)用價(jià)值。PAS染色若結(jié)合其他化學(xué)染色和細(xì)胞免疫表型檢測(cè)可對(duì)部分疾病的診斷和鑒別診斷提供一定的價(jià)值。1.原理過(guò)碘酸氧化多糖類中的乙二醇使之成為雙醛基，后者與無(wú)色品紅結(jié)合形成紫紅色化合物。定位于含多糖類的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。多糖類物質(zhì)含量決定了色澤的深淺。2.參考范圍:（正常陽(yáng)性細(xì)胞）

①粒細(xì)胞系—原粒細(xì)胞多呈陰性,通常隨細(xì)胞不斷成

熟陽(yáng)性反應(yīng)由弱漸強(qiáng),至細(xì)胞完全成熟后達(dá)到最大

強(qiáng)度。其中中性粒細(xì)胞呈胞漿內(nèi)彌散狀紅色陽(yáng)性,

嗜酸粒細(xì)胞S顆粒之間的胞漿呈紅色陽(yáng)性,嗜堿粒

細(xì)胞呈大小不一的顆粒狀紫紅色陽(yáng)性。

中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶

neutrophilalkalinephosphatase,(NAP)1.原理細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶在堿性環(huán)境下水解磷酸萘酚，使之釋放出萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)形成有色沉淀物。定位于酶活性所在處。2.參考范圍：

中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶活力正常范圍2%～56%,

積分4～80分/100個(gè)中性粒細(xì)胞二組織細(xì)胞免疫化學(xué)標(biāo)記技術(shù)組織細(xì)胞免疫化學(xué)是細(xì)胞化學(xué)吸收了免疫學(xué)的理論和技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一門(mén)重要方法學(xué).在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用.尤其在組織細(xì)胞學(xué)中該技術(shù)的應(yīng)用是微觀世界形態(tài)學(xué)研究從單一的形態(tài)學(xué)描述上升到結(jié)構(gòu)、功能和代謝為一體的動(dòng)態(tài)觀察。并可對(duì)細(xì)胞的屬性、分化階段和變異進(jìn)行鑒別，有助于臨床疾病的診斷。目前實(shí)驗(yàn)室常用的方法有免疫熒光法，PAP法，ABC法、IGSS法等10大類。但由于各種方法均有其特性和檢測(cè)適應(yīng)范圍，即某一種方法無(wú)法在所有的檢測(cè)標(biāo)本中被應(yīng)用，我們應(yīng)充分發(fā)揮各種方法上的特點(diǎn)。有選擇性的將不同來(lái)源的組織和細(xì)胞標(biāo)本并選用不同的方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。使我們的檢測(cè)結(jié)果更精確。一．免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微顯示的精確性相結(jié)合。用已知的抗體在不影響其免疫學(xué)特性的前提下與熒光素相結(jié)合。然后將結(jié)合了熒光素標(biāo)記的抗體作為一種標(biāo)準(zhǔn)試劑。對(duì)被檢細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。并在熒光顯微鏡下采用一定波長(zhǎng)的熒光，可以直接觀察被檢測(cè)中有否特異熒光的表達(dá)。目前用于標(biāo)記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光黃（FITC）、四乙基羅丹明（RB200）、四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）及藻紅蛋白（PE）在流式細(xì)胞術(shù)（FCM）中較常用。較為經(jīng)典的方法有下列幾種：（一）直接法是以熒光標(biāo)記抗體直接與被檢標(biāo)本內(nèi)的抗原反應(yīng)。依據(jù)熒光出現(xiàn)的位置及強(qiáng)弱對(duì)被檢細(xì)胞做出判別。該法的優(yōu)點(diǎn)為簡(jiǎn)單特異。但其缺點(diǎn)也很明顯即敏感性較低另需制備大量特異性的熒光抗體。（二）間接法間接法采用抗球蛋白試驗(yàn)原理，先制成熒光素標(biāo)記抗抗體。檢測(cè)中先將特異性抗體與被檢標(biāo)本作用一定的時(shí)間后，充分洗去未結(jié)合的游離特異性抗體，然后添加熒光素標(biāo)記抗抗體使之形成被檢抗原－抗體－熒光素標(biāo)記抗抗體復(fù)合物，由此顯示特異熒光并因復(fù)合物上帶有較多熒光標(biāo)志物，所以其敏感性比直接法要高。組織切片組織切片直接法間接法Ab1-熒光Ab1Ab2-熒光免疫熒光法原理圖（三）補(bǔ)體法這是一種間接法的改良。既在抗原抗體反應(yīng)時(shí)加入補(bǔ)體，然后再與熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體結(jié)合形成抗原－抗體－抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物。此法敏感性較高。但其較易出現(xiàn)非特異性染色，而且操作過(guò)程相對(duì)較復(fù)雜。（四）雙標(biāo)記法運(yùn)用兩種熒光素在不同的激發(fā)光下顯示不同顏色的特點(diǎn)，將不同熒光素分別標(biāo)記所需的特異性抗體?？稍谕粯?biāo)本上測(cè)定不同的抗原。此法即可采用直接法也可用間接法進(jìn)行。若分別采用兔源性和鼠源性等不同種屬的抗體，甚至可進(jìn)行三重或多重標(biāo)記法。雙色熒光染色MAL螢光標(biāo)記：黃（CD19）紅（CD13）二、免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是將抗原－抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效，快速催化作用彼此結(jié)合，由此形成一種既具有免疫熒光、放射免疫的優(yōu)點(diǎn)，又避免了他們的缺點(diǎn)。這項(xiàng)技術(shù)的原理和操作與熒光法有許多相似之處，所不同的是用酶來(lái)替代熒光素作為標(biāo)志物，并采用底物被酶分解后的顯色反應(yīng)來(lái)顯示抗原抗體的結(jié)合與否。選用的標(biāo)記酶有辣根過(guò)氧化物酶HRP、堿性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD）、β－D半乳糖苷酶（β－D－Gal）等。以上這些酶因其純度和活性及產(chǎn)品性質(zhì)相對(duì)較穩(wěn)定且部分已制成試劑盒出售。目前已廣泛地被臨床和實(shí)驗(yàn)室所應(yīng)用

細(xì)胞二步酶標(biāo)法三步酶標(biāo)法Ab1-酶基團(tuán)Ab1Ab2-酶基團(tuán)免疫酶標(biāo)法原理圖（二）免疫堿性磷酸酶標(biāo)記法堿性磷酸酶是一種磷酸酯的水解酶。從大腸桿菌中提取的此酶最適PH為8.0左右。其作用的底物有磷酸萘酚AS－MX和磷酸萘酚AS－BI，顯色的偶聯(lián)劑可采用固紅-GBC和固藍(lán)-BB等。免疫堿性磷酸酶染色方法很多，有直接法；間接法；APAAP法；ABC－AP法；但APAAP法和ABC－AP法二種，較為常用，且這二種方法其敏感性和特異性均較滿意。細(xì)胞Ab-1（Mo）Ab-2（Ho）Ab-3（Mo）免疫酶橋聯(lián)(APAAP)法染色原理Ab-1細(xì)胞生物素化二抗ABC復(fù)合物生物素化Biotion（HRP/AP）ABC法染色 原理圖卵白素（Avidin）細(xì)胞Ab-1酶基團(tuán)（HRP/AP）聚合物支架ELPS法染色原理(一步法)細(xì)胞Ab-1Ab-2酶基團(tuán)（HRP/AP）聚合物支架ELPS法染色原理(二步法)在被檢細(xì)胞周圍(或細(xì)胞內(nèi))見(jiàn)到紅色沉淀物，即為陽(yáng)性反應(yīng)CD13+組織細(xì)胞免疫化學(xué)操作方法要點(diǎn)1．固定：涂片固定應(yīng)根據(jù)各種標(biāo)本的不同而進(jìn)行。2．預(yù)處理：封閉非特異性位點(diǎn)和阻斷內(nèi)源性酶。3．加單抗：添加工作濃度一抗置室溫(25℃)通常30～60分鐘左右。4．加二抗：添加工作濃度二抗置室溫（25℃）通常30～60分鐘左右。5．顯色：添加相應(yīng)熒光劑或酶底顯色劑5～10min。6．觀察：①熒光法應(yīng)采用熒光顯微鏡選取相應(yīng)波長(zhǎng)進(jìn)行觀察.②酶標(biāo)法經(jīng)復(fù)染后用普通顯微鏡觀察即可.三、復(fù)合免疫組織細(xì)胞化學(xué)染色隨著免疫組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)廣泛地被采用的同時(shí)，在技術(shù)方法上的要求，也日趨提高。有時(shí)單一的免疫組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)已不能滿足臨床的要求，這時(shí)就可采用二種或二種以上的免疫組織細(xì)胞組織化學(xué)技術(shù)。如為能檢出細(xì)胞內(nèi)的微量抗原，可采用重復(fù)強(qiáng)化技術(shù)和橋聯(lián)-親和素技術(shù)，若需檢測(cè)同一組織或細(xì)胞上不同的抗原，可采用雙重或三重染色技術(shù)，以此來(lái)提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。為疾病的診斷提供更重要的依據(jù)。(一)PAP和ABC-HRP

PAP和ABC-HRP均屬免疫酶標(biāo)記技術(shù)，且都帶有辣根過(guò)氧化酶基因。將這兩種技術(shù)連續(xù)應(yīng)用于一張涂片上,可提高檢測(cè)的敏感性和微量抗原的檢出率。其基本原理先進(jìn)行PAP技術(shù)，再用生物素化二抗與其結(jié)合，最后連接ABC復(fù)合物。經(jīng)過(guò)這兩次技術(shù)可使微弱的原始信號(hào)得到比應(yīng)用一種技術(shù)更大的放大效果。(二)免疫熒光技術(shù)和免疫熒光技術(shù)

利用不同熒光素在激發(fā)光下呈現(xiàn)不同顏色這一特點(diǎn),如異硫氰酸呈黃綠色，異硫氰四甲基羅達(dá)明顯紅色。若將這二種熒光素采用不同的方法同時(shí)標(biāo)記在同一細(xì)胞上，用熒光顯微鏡換茬時(shí)，調(diào)節(jié)不同熒光素所需的特定波長(zhǎng)的光波，就可以檢測(cè)不同的抗原成分。（三）免疫熒光技術(shù)-免疫酶標(biāo)記技術(shù)

將這二種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，有其獨(dú)特的一個(gè)方面就是對(duì)雙重或三重染色結(jié)果觀察較為清晰。目前雙重染色有時(shí)采用免疫酶標(biāo)記和免疫酶標(biāo)記技術(shù)，雖然免疫酶標(biāo)記技術(shù)所攜帶的標(biāo)記酶類有許多種，酶反應(yīng)所需的底物基質(zhì)液和偶聯(lián)劑品種也很豐富。在雙重標(biāo)記技術(shù)中可選用一些顯示色差異較明顯的顯色系統(tǒng)。但往往由于顏色間相互重疊而產(chǎn)生觀察結(jié)果時(shí)的困難，再由于反復(fù)多次地進(jìn)行酶底物顯色，造成背景染色偏深且存有一些難以去除的雜質(zhì)，影響結(jié)果的觀察，而免疫熒光技術(shù)-免疫酶標(biāo)記技術(shù)若只作二重染色，那只有一次酶底顯示，其背景相對(duì)要清晰，更有意思的是觀察同一細(xì)胞上有否二種抗原同時(shí)存在，只需調(diào)節(jié)光源即可，打開(kāi)普通光觀察免疫酶標(biāo)結(jié)果，同樣打開(kāi)熒光光源可觀察免疫熒光的結(jié)果，無(wú)需使用移動(dòng)尺。

（四）免疫酶技術(shù)-免疫酶技術(shù)

由于用做標(biāo)記物的酶有多種，他們又各自有許多不同的酶底物。即使同一酶底物也可以顯示多種不同的顏色。反應(yīng)的顯色沉淀物相對(duì)較穩(wěn)定。所以雙/多量免疫酶染色可挑選的余地相當(dāng)大。在雙/多重免疫酶標(biāo)記染色中選擇同一種酶體系的稱單酶雙/多重標(biāo)記染色。而選擇二種酶體系的稱雙酶雙/多重標(biāo)記染色。單酶和雙酶雙/多重免疫染色，這二種方法的選用，各自實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)其檢測(cè)的項(xiàng)目和試劑來(lái)源而加以選擇。四．影響免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的因素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中所應(yīng)用的方法較多，反應(yīng)原理和所選用試劑也不盡相同。從各種標(biāo)本的制備、抗體的稀釋、孵育的時(shí)間、結(jié)果的觀察等許多方面均有其特定的操作要求和順序。其中無(wú)論哪一環(huán)節(jié)處理不當(dāng)，就可使測(cè)定的結(jié)果發(fā)生誤差。（一）免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)1．準(zhǔn)備整個(gè)操作過(guò)程中所使用的器皿如載玻片、試管、蓋玻片等必須清潔光滑，不含自發(fā)熒光，且載玻片以薄為好，應(yīng)小于1.2mm，否則厚玻片能吸收較多光源，激發(fā)光可主動(dòng)在被檢標(biāo)本上聚集。2．觀察部位選擇若要在載玻片上標(biāo)出標(biāo)本所在區(qū)域，可用DaKo標(biāo)記筆圈出。如用熒光型效果更好，此法即可表明細(xì)胞所在位置，便于觀察，又可防止試劑外溢，節(jié)約成本。3．封片封片劑需選用無(wú)色透明，無(wú)自發(fā)熒光，且在pH8.5～9.5時(shí)有較強(qiáng)熒光亮度。4．細(xì)胞涂片細(xì)胞涂片最理想的是采用離心涂片機(jī)進(jìn)行涂片，并調(diào)整好細(xì)胞懸液濃度，可使細(xì)胞分布均勻。若采取手工涂片要控制好涂片厚薄，不宜太厚，以免細(xì)胞過(guò)分重疊，影響結(jié)果觀察。5．顯微鏡攝影用熒光顯微鏡浸油鏡觀察細(xì)胞時(shí)，所采用的油應(yīng)同樣無(wú)自發(fā)熒光。若需同時(shí)作顯微鏡攝影，最好選用顯微攝影專用油，以免圖像清晰程度受影響。6．熒光燈的使用熒光顯微鏡每次使用時(shí)間不宜太長(zhǎng)，以1小時(shí)以內(nèi)，超過(guò)90min，高壓氘燈的發(fā)光強(qiáng)度下降，熒光減弱，影響結(jié)果觀察。另標(biāo)本經(jīng)紫外線照射15min后，熒光亦明顯減弱。7．標(biāo)本的保存由于熒光素很易衰退，染色標(biāo)本應(yīng)及時(shí)觀察。若不能馬上觀察，可將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間并可防止封片干燥。8．對(duì)照的選擇免疫熒光染色每次均應(yīng)該設(shè)對(duì)照染色。如陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、染色抑制試驗(yàn)、自發(fā)熒光對(duì)照、直接法時(shí)尚需作與特異性抗體同種屬源性正常血清對(duì)照。9．非特異性熒光的區(qū)別觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)區(qū)別特異性熒光和非特異性熒光，因免疫熒光染色有時(shí)還出現(xiàn)一些與抗原反應(yīng)無(wú)關(guān)的熒光，造成非特異性熒光的原因很多，如抗體不純、熒光素質(zhì)量差、標(biāo)本洗滌時(shí)間不夠、未結(jié)合的游離抗體未清潔干凈等。屆時(shí)應(yīng)結(jié)合產(chǎn)生非特異性熒光的具體原因加以去除。（二）免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)1．標(biāo)本選擇的特點(diǎn)免疫酶標(biāo)法可選擇組織切片或骨髓涂片也可抽取一定量骨髓液用淋巴細(xì)胞分離液提取出單個(gè)核細(xì)胞。采用涂片機(jī)涂片。2．標(biāo)本的保管標(biāo)本采集后至結(jié)果觀察完畢以前，應(yīng)盡可能避免接觸與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的化學(xué)物品。特別是苯、二甲苯、醚、乙醇、雙氧水、醛等實(shí)驗(yàn)室常用試劑。使細(xì)胞表面的分化抗原減少，甚至失去，造成假陰性。3．試劑的準(zhǔn)備各種試劑購(gòu)進(jìn)后，特別是單克隆抗體，除參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，選定最佳稀釋速，即調(diào)整一抗、二抗、三抗等之間的濃度，以求獲得最佳染色效果，同時(shí)均需設(shè)置陽(yáng)性和陰性的對(duì)照。4非特異性結(jié)合的防止抗體和組織成分