真核細胞提取與酶切鑒定

關于真核細胞提取與酶切鑒定第1頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五實驗本身:實驗室規(guī)則:時間、穿著、

儀器不能亂動、

賠償制度、

整潔、衛(wèi)生。實驗報告（如實記錄）

規(guī)范操作（辨認標簽…）、

污染物、毒物、廢棄物

（酸堿燒傷大量自來水沖洗）規(guī)則實驗

第2頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五實驗報告要求題目，組號實驗目的實驗原理實驗操作：如實記錄實驗結果及結果分析：實事求是討論或小結：認真分析，仔細思考第3頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五4真核細胞基因組DNA的分離提取及酶切電泳第4頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

實驗目的1.掌握人外周血基因組DNA的提取原理、提取方法和注意事項。2.學習瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定DNA的原理和技術。第5頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五基因組DNA提取的操作流程

〖實驗步驟〗第6頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五１、取0.3ml抗凝全血，加入到1.5ml

Eppendorf離心管中。

抗凝劑

EDTA-Na2、枸櫞酸鈉或肝素作為抗凝劑

第7頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五２、加入1mlSTMT，充分混勻

使其溶血。STMT（破壞細胞膜)sugar：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受機械作用而降解。Tris·HCl:不含金屬離子,與EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。MgCl2:提供Mg2+，穩(wěn)定DNA。TritonX-100:非離子去污劑（表面活性劑），直接破裂血中紅細胞和白細胞膜，釋出血紅蛋白及細胞核。第8頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五３、10000g離心2min，棄上清。注意離心機的使用⑴配平⑵上清丟棄到廢液缸，盡量空凈。第9頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五4、用0.4ml生理鹽水洗沉淀，10000g

離心2min，棄上清。注意離心機的使用⑴配平⑵上清丟棄到廢液缸，盡量空凈。第10頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五５、加450μlNE溶液將沉淀重新懸浮。NENaCL:50mmol/LEDTA:1.二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；

2.降低細胞膜的穩(wěn)定性第11頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五６、加50μl10%SDS，迅速混勻;再加50μl蛋

白酶K，輕輕搖勻后置50℃水浴1h。SDS

1.溶解膜蛋白和脂肪，從而是細胞膜破裂2.溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來3.對RNA、DNA酶有抑制作用4.與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3….R蛋白質(zhì)復合物，使蛋白質(zhì)變性蛋白酶K(或鏈霉蛋白酶)

廣譜蛋白酶，水解蛋白質(zhì)。能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性。第12頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五７、加入TE飽合酚500μl，輕搖2min，10000g離心

1min，將上層水相移至另一新Eppendorf管內(nèi)。酚能有效地使蛋白質(zhì)變性；酚不能抑制RNAase的活性；酚能溶解入10％一15％的水分。第13頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五８、加入酚－氯仿－異戊醇混合液500μl，輕搖

1min，10000g離心1min，將上層水相移至另

一Eppendorf管內(nèi)。氯仿也是一種蛋白變性劑，但氯仿的變性作用不如酚。氯仿有助于加速有機相和水相的分離；使用兩種不同的有機溶劑去除蛋白質(zhì)比用單一一種有機溶劑效果好。酚和氯仿兩者交替反復抽提，還可克服酚的缺點。第14頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五９、加入氯仿－異戊醇混合液500μl，輕搖

1min，10000g離心1min，將上層水相移至另

一新Eppendorf管內(nèi)。（定體積）移上清時要定量，寧少勿多氯仿：①將殘留在水相中的酚帶走②也可以再次使蛋白變性異戊醇：①降低分子表面張力，減少氣泡產(chǎn)生②有助于分層上層為水相中間為變性的蛋白下層為有機相第15頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五10、向上清中加入1/10體積的NaAc，并混勻。

再加入2倍體積的冰凍無水乙醇，充分混勻，

于－80℃放置10min。核酸是多聚陰離子的水溶性化合物，能與鈉、鉀、鎂等很多1價、2價陽離子形成鹽類而沉淀，在許多種有機溶劑中不溶解，也不會被變性。最常用的沉淀劑為1價鈉、鉀、銨和鋰等離子鹽類，如醋酸鈉、氯化鈉等。常用有機沉淀劑有：乙醇、異丙醇、聚乙二醇等。第16頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五11、10,000g離心5min，棄上清,將小管倒置于濾紙上。室溫干燥10min。第17頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五12、加入20μl雙蒸水溶解基因組DNA?；蚪MDNA8μl10XH緩沖液1μlEcoRⅠ1μl離心甩一下，37℃溫浴1h。另外剩余的10μl留做電泳分析用。酶切體系第18頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

酶切注意事項按順序加樣，每加一個樣品更換一次tip頭一定要將酶加進去加酶的時候一定保證低溫，在冰上操作加完后要充分混勻，用離心機“甩”一下再水?。ㄅ淦胶?，隨意調(diào)時間，將轉速調(diào)到接近最大值，即刻再調(diào)回零）第19頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五13、1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(上樣量10μl)10μL酶切后基因組DNA2μL6×Loadingbuffer10μ基因組DNA2μL6×Loadingbuffer10μLMarker1×TBE恒壓100V電泳0.5-1h第20頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

實驗原理核酸：包括DNA、RNA兩種分子。

DNARNA多呈單鏈線性分子雙鏈線性分子雙鏈環(huán)狀分子第21頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

真核生物DNA95%存在于細胞核5%存在于細胞器真核生物RNA10%存在于細胞核15%存在于細胞器75%存在于細胞質(zhì)第22頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

分離純化核酸總的原則應保證核酸一級結構的完整性排除其它分子的污染第23頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

完整性的保證盡量簡化操作步驟，縮短提取過程減少化學因素對核酸的降解減少物理因素對核酸的降解如機械剪切力、高溫防止核酸的生物降解

DNA酶、RNA酶第24頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

純度的保證核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度排除其它核酸分子的污染第25頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

從全血中制備基因組DNA

首先用去污劑TritonX-100直接破裂紅細胞和白細胞膜，使之釋放出血紅蛋白及細胞核，通過離心分離即可獲得白細胞核；用SDS破壞核膜；用EDTA抑制DNase的活性；蛋白酶K將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，從而使DNA釋放入水相中。用酚／氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，再用氯仿除去DNA溶液中殘存的蛋白質(zhì)及酚；用無水乙醇沉淀水相中的DNA，即可獲得基因組DNA。破裂細胞→消化蛋白質(zhì)→有機抽提除去蛋白質(zhì)→沉淀水相中的DNA第26頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五DNA抽提示意圖第27頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠMolecularscissor第28頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

均來自微生物，并據(jù)此而進行命名；識別序列長度常為4－8核苷酸序列;大部分酶識別序列呈二元旋轉對稱結構即回文結構;

其切割后的DNA可產(chǎn)生不同的末端。限制酶的特點（Ⅱ類酶）第29頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

DNA的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海洋植物瓊脂中提取來的，為一種聚合鏈線性分子。線性DNA分子在電場中的遷移率與其分子量的對數(shù)成反比DNA的空間構型不同，即使分子量相同其遷移率也不相同

第30頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

核酸電泳的染色劑

最常用的是溴乙錠染色法。(ethidiumbromide，EB)對1ngRNA，DNA均可顯色。EB染料是一種強烈的誘變劑，操作時應注意防護，應戴上聚乙烯手套。在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光(590nm）。

第31頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35分，星期五

實驗結果酶切后的基因組DNA第32頁，共35頁，2022年，5月20日，13點35