固相多肽合成樹脂的特征和進展

固相多肽合成樹脂的特征和進展摘要：討論了固相多肽合成〔spps〕的根本原理，以及固相多肽合成樹脂的特征和進展；著重討論了聚苯乙烯-苯二乙烯樹脂的性質(zhì)。關(guān)鍵詞固相多肽合成〔spps〕樹脂前言自從1963年errifield開展成功了固相多肽合成〔spps〕方法以來，經(jīng)過不斷的改進和完善，到今天這個方法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無法比擬的優(yōu)點。固相合成的主要設計思想是[1]：先將所要合成肽鏈的羥未端氨基酸的羥基以共價鍵的構(gòu)造同一個不溶性的高分子樹脂*相連，然后以此結(jié)合在固相載體*上氨基酸作為氨基組分經(jīng)過脫去氨基保護基，并同過量的活化羥基組分反響接長肽鏈。重復〔縮合—洗滌—去保護—中和和洗滌—下一輪縮合〕操作，到達所要合成的肽鏈長度；最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。將固相合成與其它技術(shù)分開來的唯一特征是固相載體。errifield和erikn提出了一種有用的載體必須滿足的普遍要求[2]：它必須包含反響位點，以使肽鏈能連在這些位點上，并在以后除去；它還必須對合成過程中的物理和化學條件穩(wěn)定；載體必須允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；另外，載體必須允許提供足夠的連接點以使每單位體積的載體給出有用產(chǎn)量的肽，并且必須盡量減少被〔載體〕束縛的肽鏈之間的互相作用。雖然這些要求的限度還不是很清楚。并不是所有的要求都很容易到達；而且這里還有一些矛盾。在一個被液體介質(zhì)自由浸透的輕度交聯(lián)的膠狀系統(tǒng)中，被縛肽鏈和溶解的試劑之間的不受阻礙的接觸似乎可以很容易到達。傳統(tǒng)的聚苯乙烯〔ps〕樹脂就是這種類型；另一方面，被縛肽鏈之間的互相作用可以在一個固體外表功能化的、剛性更強的系統(tǒng)中到達。曾研究過外表功能化的硅，但它的容易可能很低。在這些極端之間有許多實用的或潛在的固相系統(tǒng)，對它們有各種描繪：爆米花、巨孔、巨網(wǎng)和接枝共聚物。實際中發(fā)現(xiàn)簡單的凝膠狀樹脂具有最好的綜合性能[2]。用于多肽合成的高分子載體主要有三類[3]：交聯(lián)聚苯乙烯；聚酰胺；聚乙烯-乙二醇類樹脂。1、聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂1.1樹脂的選擇和性質(zhì)聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂是多肽合成中最早、最常用的固相載體，其構(gòu)造如圖1.1*樹脂是一種有機聚合物，作者認為在反響基團〔接頭〕導入前的叫樹脂比擬合適，如聚乙烯-苯二乙烯。聚丙烯酰胺；樹脂導入接頭后那么叫載體，但通常不用嚴格區(qū)分，可籠統(tǒng)使用。圖1.1它由小珠體構(gòu)成，直徑20-150μ。為了使載體具有較大的網(wǎng)格空間足以包容不斷增長的較長肽鏈而且便于反響物進入載體內(nèi)部，一般均采用1-2％交聯(lián)度的ps樹脂。但交聯(lián)度過低，那么溶脹性過大，不易過濾，而且機械性能不好，易于破碎。有人采用了另外一類方法。例如，①采用高達20％交聯(lián)度的ps樹脂。這種樹脂的內(nèi)部網(wǎng)格很小，類似于實心球。因此，肽鏈的接長反響只能在樹脂外表上進展。②以玻璃珠或聚乙烯醇〔pva〕為內(nèi)核，聚合上一層低交聯(lián)或無交聯(lián)的ps。③用20％交聯(lián)的ps珠體為核心，再在外表聚合上一層低交聯(lián)的ps制成表層樹脂或者在kel-f上進展幅照接技。但①和②的應用較果并不理想。1.2反響基團的導入上面的聚合物是起支撐和載帶作用，并不能直接連上〔第一個〕氨基酸，必需要在苯環(huán)上導入反響基團〔接頭〕。最簡單而最常用的基團是氯甲基。它可以通過一個傅氏反響導入〔式1.1〕：〔1.1〕它能同n-保護氨基酸的羥基反響形成芐酯的構(gòu)造而把起始氨基酸掛到樹脂上。反響如式1.2。〔1.2〕由于氯甲基樹脂同n-保護氨基酸的羥基反響的條件較為劇烈，有的氨基酸，如his和et等，還可能發(fā)生烷基化等副反響。因此，除一方面開展了反響活性較高的溴甲基樹脂外，又開展了羥甲基樹脂〔1-2〕。它可以由〔1-1〕通過式1.3反響來制備?！?.3〕但是，由于用于氯甲基化的氯甲基乙醚有致癌作用；并且ps的氯甲基化被認為是一個潛在的費事反響，因此它增加附著在聚合物上其它官能團被污染的時機；同時，人們主要從兩個方面對數(shù)值作了改進。①在苯環(huán)上導入-l、-n2、-nhr等吸電子基團；②將芐酯形式改為更易酸解的二苯甲酯或烷氧芐酯。在b化學中，通常認為①可能增強對酸的穩(wěn)定性，不過裂解產(chǎn)率可能稍低一些，但總的還是認為有利的。athern和sheppard那么認為改進后的樹脂可通過不包含氯甲基化和其它的傅氏反響來獲得最大的優(yōu)點[1]。他們主要是討論f方法的。如將對-羥甲基苯乙酸與氨甲基聚苯乙烯結(jié)合，得到所謂的pa樹脂〔1-3〕。在b和f化學中都有很廣的應用。王〔ang〕的對-烷氧基苯甲醇樹脂〔1-4〕在f化學中也是很值得注意的。另外為了制備-端為酰胺基的多肽，還可采用氨甲基樹脂〔1-5〕。這樣得到的樹脂替代值一般在0.3—1.2l/g之間；常規(guī)應用中0.5l/g較為理想[3][4]。ingert等報道[5]，用n-〔叔丁氧羰基〕-2-氨基乙硫醚處理的氯甲基樹脂〔errilield樹脂〕的衍生物，可用固相合成方法來產(chǎn)生硫醇端多肽。此種多肽很合適隨后的化學綴合反響等。henningds等[6]那么發(fā)現(xiàn)arg或lys側(cè)基的errifield樹脂能從溶液〔ph=7.8〕中吸著膽紅素。但其它氨基酸側(cè)基無此吸附現(xiàn)象。1．3其它應用和進展1．3．1固相片段縮合[1]用errifield創(chuàng)始的逐個接長肽鏈的固相合成具有簡單快速的優(yōu)點。但這個方法存在一個問題，即由于各種內(nèi)缺失肽和其它副產(chǎn)物的存在，使得合成的最后產(chǎn)物很難純化，特別是在合成大肽或蛋白質(zhì)的時候。此外，合成的肽越長，經(jīng)過的縮合循環(huán)也越多，最后產(chǎn)物的產(chǎn)率也越低。而用固相片段縮合，不是每次接長一個氨基酸，而是接長一個肽段。這樣可以在很大程度上解決上述問題：①減少了縮合循環(huán)的次數(shù)，可以進步最后產(chǎn)物的產(chǎn)率；②由于每一個反響的片段無論是用液相的或固相合成獲得的都可以先經(jīng)過純化得到純品，這樣，最后的副產(chǎn)物也就相應地減少很多，而且所產(chǎn)生的各種內(nèi)缺失肽的理化性質(zhì)也和所需產(chǎn)物的性質(zhì)有較大的差異，因此最后易于別離純化。如我國科學工作者于1957年完成了胰高血糖素的全合成，產(chǎn)物經(jīng)過別離純化后，可以得到具有全部活力的胰高血糠素的結(jié)晶。以后人們又開展了很多適用于固相片段縮合的樹脂[7],如hba-a樹脂〔1-6〕，nvasyn?kb樹脂〔1-7〕。前者具有極好的物理和溶脹性能，并合適在間歇系統(tǒng)中應用；后者那么應用于連續(xù)流動系統(tǒng)。另外還有肟樹脂〔1-8〕、溴化ang樹脂〔1-9〕、溴化ppa樹脂〔1-10〕。其中〔1-9〕ps的交聯(lián)度為1％，〔1-10〕那么有2％。1．3．2側(cè)鏈掛樹脂的方法[1]可能通過氨基酸的側(cè)鏈功能團固定為樹脂上。它的優(yōu)點有二：①由于是側(cè)鏈固定在樹脂上，因此，既可以由n伸長肽鏈，也可由n伸長肽鏈；②由于側(cè)鏈基團的多樣化，因此樹脂的固定基團也可以多樣化，裂解時可選擇一些更為溫和的專一性的切落反響。當然，和將氨基酸的氨基固定在樹脂上來伸長肽鏈一樣，此方法也有很大的局限性，只在一些特殊情況下有應用。2．聚酰胺一般指聚丙酰胺凝膠。最先是由sheppard等人提出用于多肽合成的[1][2]。將二甲基丙烯酰胺〔2-1〕、n、n`-雙丙烯酰乙二胺〔2-2〕和不對稱的二酰胺的衍生單體，如n-丙烯酰-n`叔丁氧羰基-β-丙烯酰-六次甲基二胺〔2-3〕共聚可得到珠狀或無定形的丙烯酰胺載體〔2-5a〕。其中〔2-2〕為交聯(lián)劑，〔2-3〕那么是為了使載體帶有可反響的氨基，及一個六碳隔離物鏈將官能團與聚合物主體分開。采用聚丙烯酰胺作為多肽合成載體的原初設想是由于它具有與肽鏈相近的構(gòu)造類型，不會象用ps樹脂那樣，隨著合成肽鏈的增長而顯著地改變載體的理化性質(zhì)，因此可能更適用于大肽合成的情況。但最初的理論并不顯示它比ps樹脂具有更大的優(yōu)越性。另外，還難以獲得規(guī)那么的球體，一些時候會得到大量的無定形聚合物，給操作帶來困難。這可能和復雜的衍生物〔2-3〕有關(guān)。它與其它單體相比，具有非常不同的溶解性能和相分配性能，同時它也難以制備。用丙烯酰-n-甲基甘氨酸甲脂〔2-4〕代替〔2-3〕解決了這些問題。這種功能化試劑和根本的單體〔2-1〕關(guān)系很接近，并且聚合可以不費力地得到漂亮的球體聚合物。另外，與〔2-1〕及〔2-4〕相似的構(gòu)造似乎說明它們將以可比的速率聚合，這就進步了在整個樹脂母體中官能團統(tǒng)一分配的相近程度。第二種樹脂〔2-5b〕那么有必要用一個后-聚合化學步驟將它轉(zhuǎn)變成氨基聚合物〔2-5〕。聚酰胺樹脂在極性溶劑如df中溶脹至于體積的10倍，在水中更高；而在非極性的d中那么膨脹得低得多了。從這處意義上講，它們的特性與樹脂相反。sparrjt等在制備聚酰胺樹脂時用了一些功能單體：n-〔2-〔甲基磺?；骋阴ｔ驶?烯丙基胺〔s-烯丙胺〕、n-丙烯?；?1，6-二氨基己烷hl[8],或n-甲基丙烯?；?1，3-二氨丙烷hl[8][9]。樹脂載荷0.15-1.4l/g。該樹脂很適用于f化學合成。純品肽可占粗品的80-95％，包括那些用傳統(tǒng)ps樹脂合成失敗的氨基酸順序。hayniesl等準備了乙烯二氨修飾的聚酰胺樹脂〔pepsnk〕,在上面合成出兩親性的多肽，并報道了這種多肽具有滅菌活性[10]。3．聚乙烯-乙二醇類樹脂3．1聚乙烯-乙二醇-接技聚苯乙烯〔peg-ps〕它由不溶的ps母體構(gòu)成，聚乙烯-乙二醇〔peg〕鏈附著在上面。和以上討論的聚酰胺樹脂一樣，它試圖進步固相載體中肽鏈的溶劑化。研究過各種鏈長的peg，但應用最成功是分子量在2000-3000da之間的。近年來用機器合成多肽開展很快。機器合成包括半自動〔間歇式〕和自動〔連續(xù)流動〕兩種形式，它與手工合成相比，具有快速、完全、方便等優(yōu)點。而由于peg-ps樹脂一般都有較好的物理化學特性，如溶脹性，物理穩(wěn)定性，在流動系統(tǒng)中抗磨和抗機械壓力才能等，因此，它也隨之開展起來。如katesa，guinnersbf等最近報道該實驗室研究的“低載荷〞〔替代值0.15-0.25l/g〕和高載荷〔0.3-0.5l/g〕peg-ps樹脂的優(yōu)點[11]。3．2pega樹脂及peg類樹脂的新應用pega樹脂是由rtenelder開展起來的親水性樹脂，由peg與酰胺基團交聯(lián)而成[4]。一般用于間歇式和連續(xù)流動多肽合成。它們的性質(zhì)和peg-ps樹脂有很多相似之處，如nvasyn?tg樹脂〔3-1〕，其平均珠體大小為90μ，每克樹脂有2.86×106個小珠體。由于它特別合適應用于連續(xù)流動多肽合成。nvasyn?tga樹脂〔3-2〕，是在ps載體根底上連枝peg，能抵抗很高的流速，使它成為快速合成長鏈肽的理想選擇。其它如nvasyn?tga樹脂〔3-3〕，被一個極好的rink接頭功能化。這樣用tfa處理肽-樹脂可以很容易地得到多肽酰胺。另外注意到此樹脂有一個自由氨基，這將增加產(chǎn)物保存時的穩(wěn)定性；同時意味著不需要經(jīng)過一個預先去保護循環(huán)，就可以直接連上第一個氨基酸。它們的替代值一般為0.2-0.3l/g。rink酰胺pega樹脂也被一個rink接頭功能化，和前面介紹的〔3-3〕性質(zhì)相似：不過它有更高的替代值〔0.3-0.4l/g〕。近年來，peg類型樹脂〔如pega〕的一些新的應用越來越引起人們的興趣。這些應用包括免疫學、樹脂上酶合成及酶分析，和多肽文庫的合成，而后者是發(fā)現(xiàn)新藥物的強有力的工具。上述〔3-1〕就特別合適此類工作。auzanneaufi等[12]研究了具有高含量peg的三種類型的pega。樹脂在從水到d的不同溶劑中膨脹很好，載荷為0.35l/g。他們在此樹脂上合成出了幾個高純度的多肽，研究說明，作為相應的滅菌肽，它們有足夠的致死活性。renil，ferreras等[13]合成出了兩種類型的pega。由雙/單-丙烯酰胺-peg與丙烯酰胺peg共聚，得出一個低交聯(lián)度的樹脂〔類型i〕：進而，丙烯酰-肌氨酸乙酯與雙-丙烯酰胺peg共聚得到較多交聯(lián)的樹脂〔類型ii〕；載體在很廣范圍的溶劑中顯示了高膨脹性，包括h2、d、乙腈、tfa和甲苯。類型i通過單體組成的不同，給出的容量在0.07-1.0l/g之間，可應用于固相酶文庫；用乙二胺處理類型ii后，應用于連續(xù)流動多肽合成，且能給出相當好的產(chǎn)量和純度。aarer.ja和ttngj等[14]報道，在一個3-巰基-3戊酮酰胺-peg-聚-〔n,n-二甲基丙烯酰胺〕共聚物上載體〔hs-pega〕上，通過最優(yōu)化的b-spps,可以從固相載體上直接得到未保護的多肽。這種方法降低了操作中的損失，明顯進步了整個的化學偶聯(lián)效率。他們合成了幾個15-47個殘基的肽，并且這種方法可以擴展到用來實現(xiàn)順序的分子內(nèi)絡合，允許進入大得多的聚合肽和蛋白質(zhì)系統(tǒng)。4、固相多肽合成樹脂和其它一些進展除了以上三種普遍類型的固相載體，還有許多其它的載體被提出來并得到了有價值的應用。包括一些碳水化合物、接枝peg聚酰胺、控制細孔度的硅玻璃和pe薄片等。而近年來的研究工作已從單純的合成肽鏈，向功能化和自動化轉(zhuǎn)變。如上面提到的應用于免疫學和多肽文庫的合成，這方面的工作有teggy和frankr[15]用于1，3-二氨基丙烷修飾hitrap瓊脂糖凝膠，并接上一個酰胺接頭得到的載體，urrayjs[16]用水相容性的聚丙烯酰胺類樹脂，加上一個不裂解的接頭，然后在固相載體上合成出目的多肽。將結(jié)果肽-樹脂注射進動物以引出抗肽免疫反響。buettnerja和dadda[17]等開展了一種新的親水性樹脂。這種樹脂能用于多肽合成，以及直接估價為目的蛋白質(zhì)而化合的多肽文庫。他們用一個兩色“多肽文庫免疫印跡色譜分析〞〔pelian〕技術(shù)來探測合成出的多肽文庫順序。sebestytenf[18]等亦提出了開展有色多肽和多肽文庫的方法。eryj等研究了二硫鍵作為b-bzlspps的多肽-樹脂接頭，認為這種方法具有生物化學上的應用潛力。直接將多肽偶聯(lián)在活性蛋白載體上，可能應用于抗體的產(chǎn)生。其它方面，llyd-illiasp等用了一個光不穩(wěn)定的樹脂，合成了一個完全被保護的八肽，此肽包含一個et殘基，他們指出在用光裂解時，此et可以防止被氧化[20]。englebrestndr和hardingdr用氨丙基perlza小珠纖維做載體，通過一個對tfa不穩(wěn)的4-甲氧基苯氧乙酰基〔hpa〕接頭進展fspps[21]。他們進展了連續(xù)流動和間歇式合成，并同一個ps載體和標準化的〔abifast〕spps方案合成出的一些肽進展了比擬。他們關(guān)于perlza工作的全面目的是為親合色譜法和抗體產(chǎn)生了比擬。他們關(guān)于perlza工作的全面目的是為親合色譜法和抗體產(chǎn)生出樹脂束縛的多肽配位體。他們還于1993年將這種多肽樹脂應用于從粗重組培養(yǎng)基中別離出的凝乳酶[22]。zukerannrn和banvilles[23]建立了一個機器人工作站，使去除對tfa不穩(wěn)的側(cè)鏈保護基團從酸不穩(wěn)定樹脂上裂解下多肽實現(xiàn)自動化。工作站建立在一個zyark機器人手臂周圍，并同一個多肽合成工作站連在一起。肽樹脂樣品用一個tfa/去除劑混合液來去保護和裂解。混合液合適所有通常的用f化學的保護基團。用水-醚連續(xù)抽提移走去除劑和反響副產(chǎn)物。設備每2hr裂解一個50-500g的肽樹脂樣品，同時為肽提供一個10％ha水溶液。用此設備得到的粗肽與殘留的去除劑分開，產(chǎn)率在50-80％范圍內(nèi)。這種方法除了疏水的多肽外，對其他所有的多肽都適用；而且它最大程度地減少了人接觸有毒的裂解試劑的時機。4、展望固相多肽合成已經(jīng)有近40年的歷史了；然而到如今，人們還只能合成一些較短的肽鏈，更談不上隨心所欲地合成蛋白質(zhì)了，同時合成中的試劑毒性，昂貴費用，副產(chǎn)物等一直都是令人頭痛的問題，而在生物體內(nèi)，核糖體上合成肽鏈的速度和產(chǎn)率都是驚人的，那么，是否能從生物體合成蛋白質(zhì)的原理上得到一些啟發(fā)，應用在固相多肽合成〔樹脂〕上？這是一個令人感興趣的問題，也許是今后多肽合成的開展方向。參考文獻[1]多肽合成，黃惟德、陳常慶，科學出版社，1985[2]slidphasepeptidesynthesis,errifield,erikn[3]peptideheistry,2ndeditin,iklsbdanszky,[4]heialapprahestthesynthesisfpeptideandprteins,paulllyd-illias,fernandalberii,ernestgiralt,1997[5]ingert,ludviepj,haikfel,nvenientruttthilterinatedpeptidesfrnjugatinandsurfaefuntinalizatinstrategies,binjughe1995ay-jun;6(3);[7]synthesisntes,1996[8]sparrjt,knieb-rdnierng,bjeyseskerenu,urrayjs,large-preplydiethylarylaideresinslid-phasepeptidesynthesis;appliatinsinfheistry,peptres1996nv-de;96(6);[9]kandap,kennedyr,sparrjt,synthesisfplyaidesupprtsfruseinpeptidesynthesisandaspeptide-resinnjugatesfrantibdyprdutin,intjpeptprteinres1991t;38(4);[10]hayniesl,rugadeleba,antiirbialativitiesfaphiphilpeptidevalentlybndedtaater-inslubleresin,antiirbagentshether1995feb;39(2);[11]katessaguinnessbf,blakburn,et,“high-lad〞plyethyleneglyl-plystyrene(peg-ps)graftsupprtsfrslid-phasesynthesis,biplyers,1998,4(3);[12]auzanneaufi,eldal,bkk,synthesis,haraterizatinandbipatibilityfpegaresins,j.peptsi1995jan-feb;1(1);[13]renil,ferreras,delaiseej,fgednt,eldal,pegasupprtsfrbinatrialpeptidesynthesisandslid-phaseenzyatilibraryassays,jpeptsi1998ay,4(3);[14]aarerja,ttngj,adevaa,uirt,heialligatinfunprtetedpeptidesdiretlyfraslidsupprt,jpeptres1998apr;51(4);[15]tegge,frankr,p