綠茶多糖的制備及其含量測(cè)定

綠茶多糖的制備及其含量測(cè)定【摘要】目的建立一種穩(wěn)定、簡(jiǎn)便的綠茶多糖含量測(cè)定方法。方法采用精制綠茶多糖測(cè)得綠茶多糖對(duì)葡萄糖的換算因子后,樣品經(jīng)除雜處理后,用苯酚－硫酸法測(cè)定綠茶中多糖的含量。結(jié)果用此方法測(cè)定多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其相關(guān)系數(shù)為0.9997,平均回收率為99.62%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏向?yàn)?.94%。結(jié)論該方法所需儀器簡(jiǎn)單，操作方便,顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，合適于綠茶及其制品的多糖含量的常規(guī)檢測(cè)?！娟P(guān)鍵詞】綠茶多糖提取苯酚－硫酸法PreparatinandDeterinatinfPlysaharidefrGreenTeaAbstrat:bjetiveTdevelpastableandsipleethdteasuretheplysaharideinGreenTea.ethdsAfterthenversineffiientfplysaharidefrGreenTeatgluseasbtained,thententfplysaharideaseasuredbyphenl-sulfuriaidethd.ResultsTherrelatineffiientfstandardurveas0.9997,thereveryrateas99.62%andRSDas1.94%.nlusinTheethdisnvenient,stableandaurate,hihanbeusedfrntentdeterinatinfplysaharidefrGreenTeaasellasit'srelatedprduts.Keyrds:GreenTea;Plysaharide;Extratin;Phenl-sulturiaidethd綠茶是歷史最早的茶類，又稱不發(fā)酵茶，以適宜茶樹新梢為原料，經(jīng)殺青、揉捻、枯燥等典型工藝過程制成。其干茶色澤和沖泡后的茶湯、葉底以綠色為主調(diào)，綠茶也因此得名。最新科學(xué)研究結(jié)果說明，綠茶中主要化學(xué)組成為咖啡因、茶多酚、茶多糖等，咖啡因是一種興奮劑,具有較好的鎮(zhèn)痛作用，咖啡因也是一種和緩的利尿劑,藥用上的咖啡因是頭痛鎮(zhèn)痛的一個(gè)組分,它可與麥角胺的酒石酸鹽結(jié)合起來治療偏頭痛［1］；茶多酚是一種新型的天然食品抗氧化劑,與抗壞血酸配合時(shí),其抗氧化性能優(yōu)良，茶多酚也具有高效的抗癌、抗衰老、降血脂等一系列的藥理功能［2］；茶多糖具有降血糖、降血脂、降血壓及減慢心率、耐缺氧的作用，同時(shí)茶多糖在抗凝血、防血栓形成、保護(hù)血象和增強(qiáng)人體非特異性免疫功能方面均有明顯效果［3］，因此從綠茶中提取的多糖成分在開發(fā)降糖新藥和功能性食品方面有著廣闊的前景。綠茶多糖的含量測(cè)定對(duì)于提取原料的選擇及提取工藝的評(píng)價(jià)具有重要意義。本研究用精制綠茶多糖測(cè)得綠茶多糖對(duì)葡萄糖的換算因子，然后將經(jīng)95％乙醇浸泡處理后的綠茶用水提取多糖，采用苯酚－硫酸法測(cè)定其含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法1.1材料核酸蛋白分析儀〔DU-640〕，Bekan公司；電熱恒溫水槽〔DK-8D型〕，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器；臺(tái)式冷凍離心機(jī)〔D-78532Tuttlingen,universal132R〕德國(guó)；Alphal-2型真空凍干機(jī)，德國(guó)hrist公司；自動(dòng)收樣器，美國(guó)haters公司等;葡萄糖、苯酚〔分析純重蒸餾試劑〕、濃硫酸、95％乙醇、三氯甲烷、正丁醇、丙酮、乙醚、活性炭、聚酰胺吸附樹脂等，以上試劑均為分析純。白沙綠茶〔來自于海南白沙農(nóng)場(chǎng)〕。1.2方法1.2.1精制綠茶多糖的制備取枯燥綠茶20g，粉碎，過50目篩，用95％乙醇浸泡1d后，殘?jiān)鼤窀?，熱水浸?次，過濾，合并濾液，加熱濃縮至總體積的1/4，將濃縮液離心，上清液中參加三倍體積的95％乙醇沉淀，4℃冷凍過夜，離心，殘?jiān)靡颐眩瓱o水乙醇溶劑系統(tǒng)反復(fù)洗滌，然后將殘?jiān)婵盏蜏乜菰锏玫骄G茶多糖粗品。綠茶多糖粗品加水溶解，用Sevag法去蛋白［4］，然后將去蛋白多糖溶液上聚酰胺吸附樹脂，用蒸餾水洗脫，洗脫至洗脫液參加95%乙醇無沉淀為止。將洗脫液濃縮至一定體積，得精制綠茶多糖提取液。精制多糖提取液參加活性碳(固液比為1∶10)90℃脫色約2h，趁熱過濾，濾液濃縮至一定體積后，再用蒸餾水透析2d，低溫冷凍枯燥得精制綠茶多糖。稱重，計(jì)算得率，備用。1.2.26％苯酚溶液配制臨用前用80%苯酚溶液〔取重蒸餾苯酚80g加蒸餾水20g溶解，搖勻置棕色瓶，4℃保存〕加蒸餾水稀釋配制而成。1.2.3標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的配制精細(xì)量取105℃枯燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖1000g,置于1000l量瓶中加水至刻度，配成1g/l的葡萄糖母體溶液，然后稀釋20倍，得到要用的50μg/l的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.2.4吸收波長(zhǎng)選擇精細(xì)量取50μg/l標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液1l,置20l具塞試管中,依次參加6%苯酚溶液1.0l，濃硫酸5.0l,靜置10in后搖勻,室溫放置20in,以蒸餾水同法操作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)400～600n之間進(jìn)展掃描,確定最大吸收波長(zhǎng)487n。1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制備［5］分別精細(xì)汲取50μg/l標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8l置具塞的試管中，各以水補(bǔ)至2.0l,依次參加6%苯酚溶液1.0l，濃硫酸5.0l,靜置10in后搖勻,室溫放置20in,以2.0l蒸餾水同法操作為空白對(duì)照,在487n波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以多糖濃度為橫坐標(biāo)〔μg/l〕，光密度為縱坐標(biāo)，繪制曲線，得回歸方程為：Y=0.0154X+0.0038,r=0.9997。1.2.6換算因素確定精細(xì)稱取枯燥至恒重的精制綠茶多糖約5g，置25l容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得綠茶多糖儲(chǔ)藏液。精細(xì)汲取該溶液2l，按“1.2.5〞項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，以2.0l蒸餾水同法操作為空白對(duì)照。由回歸方程求出此綠茶多糖儲(chǔ)藏液中葡萄糖濃度，并計(jì)算其中葡萄糖含量。按下式計(jì)算換算因子：f=/·D〔為稱取精制綠茶多糖的重量(μg)，為綠茶多糖儲(chǔ)藏液中葡萄糖的濃度〔μg/l〕，D為精制綠茶多糖的稀釋倍數(shù)〕。1.2.7綠茶樣品中多糖含量測(cè)定樣品溶液制備：取樣品綠茶1g，精細(xì)稱定，粉碎，過50目篩，用95％乙醇浸泡1d后，殘?jiān)鼤窀?，熱水浸?次，過濾，合并濾液，待冷后轉(zhuǎn)移于1000l容量瓶，加蒸餾水稀釋至刻度作供試品溶液。樣品中綠茶多糖含量測(cè)定：精細(xì)汲取所得樣品溶液2.0l于具塞試管中，按“1.2.5〞項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算供試液中葡萄糖含量，按下式計(jì)算各樣品中多糖的含量。多糖含量=Df/×100％。式中：為樣品溶液中葡萄糖的含量，D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，f為換算因子，為樣品重量。1.2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精細(xì)量取樣品溶液2.0l，按“1.2.5〞項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，每隔30in測(cè)1次，連續(xù)3h考察其穩(wěn)定性。1.2.9重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)精細(xì)稱取同批綠茶樣品5份各1g，按“1.2.7〞項(xiàng)下的方法同時(shí)制取5份樣品溶液。精細(xì)汲取樣品溶液2.0l，分別置于10l具塞刻度試管中，按“1.2.5〞項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖的含量。1.2.10回收率實(shí)驗(yàn)取綠茶樣品6份，每份約0.5g，精細(xì)稱定，精細(xì)參加精制多糖20g，然后按“1.2.7〞樣品液的制備和“1.2.5〞標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，根據(jù)“1.2.9〞的結(jié)果該批綠茶中多糖的平均含量為3.48%，計(jì)算回收率。2結(jié)果2.1精制綠茶多糖的得率20g枯燥的綠茶按“1.2.1〞方法制得精制綠茶多糖0.51g，得率為2.55%。2.2換算因子f=1.26。2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)樣品溶液在3h內(nèi)顯色穩(wěn)定，結(jié)果見表1。RSD=1.31%〔n=7〕。表1綠茶多糖含量測(cè)定穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果〔略〕2.4重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)以同批綠茶為樣品測(cè)定多糖的含量，檢驗(yàn)此測(cè)定方法的重現(xiàn)性，結(jié)果見表2。RSD=1.69%(n=5)。2.5回收率實(shí)驗(yàn)精細(xì)汲取含量的綠茶5份，測(cè)定加樣回收率，結(jié)果見表2。表2多糖重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)〔略〕3結(jié)論苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖含量是由Dubis等［6，7］提出的。其原理是：多糖或寡糖被濃硫酸在適當(dāng)高溫下水解，產(chǎn)生單糖，并迅速脫水成糠醛衍生物，該衍生物在強(qiáng)酸條件下與苯酚起顯色反響，生成橙黃色物質(zhì)，在波長(zhǎng)490n左右處和一定濃度范圍內(nèi)，其吸光度A值與糖濃度呈線性關(guān)系，從而可用比色法測(cè)定其含量。本法簡(jiǎn)單，顯色穩(wěn)定，靈敏度高，重現(xiàn)性好。表3多糖加樣回收率實(shí)驗(yàn)〔略〕利用精制綠茶多糖測(cè)定并計(jì)算換算因子，再利用換算因子計(jì)算綠茶多糖含量，可有效消除用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量而帶來的誤差。加樣回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明，采用此方法測(cè)定綠茶多糖含量，平均回收率高達(dá)〔99.62±1.93〕%，RSD=1.94%。我國(guó)是茶葉消費(fèi)大國(guó),特別是綠茶占了相當(dāng)大的比例,但目前中低檔綠茶嚴(yán)重滯銷，因此，深化開展綠茶多糖的研究有著重大的意義,不僅有利于茶葉資源的充分利用,而且對(duì)預(yù)防疾并促進(jìn)安康都有積極作用，隨著綠茶研究的不斷深化，從綠茶中提取的多糖有望成為一些疾病的重要治療藥品和功能食品?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】［1］關(guān)崇新.茶葉中咖啡因含量的測(cè)定［J］.鞍山師范學(xué)院學(xué)報(bào),2001,3(3):45.［2］Nutraner.綠茶是一種抗氧化劑［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè),2001,23(3):191.［3］嚴(yán)鴻德，汪東風(fēng)，王澤農(nóng)，等.茶葉深加工技術(shù)［］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998：81.［4］齊慧玲，魏紹云，王繼倫.等.Sevag法去除白及多糖中蛋白的研究［J］.天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