纖維素微生物的分離

關(guān)于纖維素微生物的分離第1頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五1、纖維素在生物圈的分布狀況？2、纖維素酶的組成及作用？纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認為它至少包括三種組分，即CX酶、

C1酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。一、纖維素和纖維素酶第2頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五例：下列作物中，纖維素含量最高的是（）A、棉花B、亞麻C、秸稈D、朩材A、棉花例：微生物體內(nèi)能使纖維素分解成纖維二糖的酶是。C1酶和CX酶第3頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五例：要將能分解纖維素的細菌從土壤中分離出來，應(yīng)將它們接種在（）A、加入指示劑的鑒別培養(yǎng)基上B、含有蛋白胨的固體培養(yǎng)基上C、只含纖維素粉而無其他碳源的選擇培養(yǎng)基上D、含四大營養(yǎng)要素的培養(yǎng)基上第4頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五纖維素1、培養(yǎng)基：以_______為惟一碳源的選擇培養(yǎng)基。纖維素酶纖維素分解菌紅色消失，出現(xiàn)透明圈剛果紅纖維素紅色復(fù)合物剛果紅染色法2、鑒別篩選的原理：二、纖維素分解菌的篩選

即：可根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。第5頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五例:在加入剛果紅的培養(yǎng)基中會出現(xiàn)透明圈，產(chǎn)生的透明圈是（）A、剛果紅與纖維素形成的復(fù)合物B、剛果紅與纖維二糖形成的復(fù)合物C、纖維素分解后形成的葡萄糖導(dǎo)致的D、以纖維素分解菌為中心形成的第6頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五課題2是將土樣成的菌懸液直接涂布在以尿素為惟一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致.1、本實驗的流程與課題2中的實驗流程有哪些異同？三、實驗操作土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落第7頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五三、實驗操作土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落2.為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？這樣的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對高第8頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五三、實驗操作土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。3.將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應(yīng)該埋進土壤多深？第9頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五三、實驗操作土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落

目的？“選擇培養(yǎng)”是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定。思考：為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？選擇培養(yǎng)使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用.第10頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五選擇培養(yǎng)參照課本29頁旁欄中的比例配置，回答下列問題：a、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？b、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進行選擇的？

c、你能否設(shè)計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑有選擇作用，本配方中以纖維素為唯一碳源，所以能分解纖維素的微生物可以大量繁殖.用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照第11頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五剛果紅染色法方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)方法二：在倒平板時就加入剛果紅染色法優(yōu)點

缺點方法一方法二操作繁瑣，剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜操作簡便，不存在菌落混雜問題透明圈的產(chǎn)生基本上是纖維素分解菌的作用透明圈的產(chǎn)生可能是產(chǎn)淀粉酶的細菌，也可能是能降解色素的細菌的作用第12頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五挑選產(chǎn)生透明圈的菌落

參照課本剛果紅染色法，挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落單菌落挑取第13頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五為確定得到的菌是否是纖維素分解菌，還需進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗。纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量測定。課題延伸第14頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五例：用剛果紅染色時，加入剛果紅應(yīng)在（）①制備培養(yǎng)基時②梯度稀釋時③倒平板時④涂布時⑤長出菌落時A、①②

B、②⑤

C、③⑤D、④⑤第15頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五例：分離土壤中纖維素分解菌用到的方法是①稀釋倒平板法②涂布平板法③單細胞挑取法④選擇培養(yǎng)基分離A、①②

B、②③④

C、②③

D、①③④第16頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五例：分離土壤中纖維素分解菌的實驗過程中，操作有誤的是（）

A、經(jīng)選擇培養(yǎng)后將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上B、選擇培養(yǎng)這一步可以省略，但纖維素分解菌少C、經(jīng)稀釋培養(yǎng)后，用剛果紅染色D、對照組可用同樣量的培養(yǎng)液涂布到不含纖維素的培養(yǎng)基上第17頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五※接種微生物常用的方法有：平板劃線法稀釋涂布平板法※分離并統(tǒng)計纖維素分解菌的實驗中，宜采用，原因是：稀釋涂布平板法平板劃線法難以根據(jù)稀釋體積計算每克樣品中的細菌數(shù)量

第18頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五1．纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，因培養(yǎng)基中無凝固劑，利用液體選擇培養(yǎng)基以增加纖維素分解菌的濃度。2．為確定得到的菌是否是纖維素分解菌，還需進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗。纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量測定。3．流程中的“選擇培養(yǎng)”是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定。第19頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五第20頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五四、結(jié)果分析與評價（一）培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落（二）分離的結(jié)果是否一致

設(shè)置對照，若對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中無菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。如果不同，分析產(chǎn)生不同結(jié)果的原因。

由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，學(xué)生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。第21頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五五、課題延伸

本課題對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選，但是這只是分離純化的第一步。為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗，纖維素酶的測定方法一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量的測定。3．1為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵。3．2纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的葡萄糖含量進行定量測定。第22頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五再見！第23頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五1．纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，因培養(yǎng)基中無凝固劑，利用液體選擇培養(yǎng)基以增加纖維素分解菌的濃度。2．為確定得到的菌是否是纖維素分解菌，還需進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗。纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量測定。3．流程中的“選擇培養(yǎng)”是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定。第24頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五(1)方案土壤取樣→選擇培養(yǎng)→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→挑選產(chǎn)生透明圈的菌落。(2)選擇培養(yǎng)的目的：增加纖維素分解菌的濃度，確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。(3)涉及到的微生物技術(shù)主要有：培養(yǎng)基的制作、無菌操作技術(shù)、稀釋涂布平板法、選擇培養(yǎng)基的作用、土壤取樣等。第25頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五土壤取樣取樣的環(huán)境是怎樣的，作出這種選擇的理由是什么？

選擇纖維素豐富的環(huán)境，如樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等等。生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境第26頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五梯度稀釋

按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋，稀釋最大倍數(shù)到106第27頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五剛果紅染色法方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)方法二：在倒平板時就加入剛果紅思考：這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足

方法一缺點是操作煩瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用方法二優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題缺點一是由于培養(yǎng)基中還含有淀粉類物質(zhì)，可以使能產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應(yīng)；缺點二有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅，形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分.第28頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上1、制備培養(yǎng)基:參照旁欄中的比例2、涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1ml涂布在培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)第29頁，共31頁，2022年，5月20日，18點34分，星期五3、