組織工程及其相關材料

關于組織工程及其相關材料第1頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五8.1組織工程的基本概念和研究進展8．1．1組織工程學產(chǎn)生的背景（1）隨著人類物質(zhì)、文化生活水平的提高，對損傷、疾病的治療要求越來越高，不儀要求治好傷、病，還要求良好的功能及完美的外形，應用傳統(tǒng)的治療方法難以達到如此完善的地步，需要尋找新的治療途徑。。當前修復缺損器官的主要方法：自體移植、異體移植、組織代用品（如假肢等。）問題點很多？？第2頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五（2）細胞生物學技術的高速發(fā)展自從20世紀50年代以來：利用養(yǎng)分和酶已經(jīng)將組織離解為有功能的細胞成分，體外細胞培養(yǎng)技術的研究也得到了長足的進步；使大規(guī)模細胞的培養(yǎng)成為可能；細胞組織類型培養(yǎng)技術的普及，以及對體外細胞作用的認識和理解，為重建有功能的組織成為可能；細胞生物學、生物分子、材料科學、臨床醫(yī)學及其生物工程等多學科的發(fā)展也為組織工程的建立奠定了堅實的基礎。第3頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五（3）巨大的市場需求為組織工程學發(fā)展注入了動力。眾多的投資公司注入大量資本進行組織工程學研究。這些是組織工程學研究發(fā)展的基礎與動力。第4頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五8．1．2組織工程學原理組織工程的概念最早是由美國的RobertLanger和J.Vacanti在20世紀80年代中期提出的一個新的研究思路，即希望能夠在一種可生物降解的支架材料上種植人體活細胞，使之在生長因子的作用下，再生成為組織。第5頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五MaPeter，MaterialsToday.2004,7(5):30-40第6頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五1987年，在美國國家科學基金會（NSF）的生物工程會議上提出了“組織工程（TissueEngineering)”一詞。1988年NSF的一個專門工作小組對組織工程的內(nèi)涵作了這樣的定義：應用工程科學和生命科學的原理和方法，認識哺乳動物正常和病理組織與器官的結(jié)構(gòu)-功能關系，并開發(fā)具有生物活性的人工替代物，以恢復、維持或改善組織、器官的功能。第7頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五由此可見：組織工程是一個嶄新的概念，它融合了工程學和生命科學的基本概念、基本理論、基本技術和基本方法,在體外將人體某部分的組織細胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進行人工培養(yǎng)繁殖,擴增,然后移植到人體內(nèi)所需要的部位,從而達到器官修復或再造的治療目的的一種技術。組織工程是一門多學科交叉的邊緣學科，雖很年輕，但是它將是21世紀最具有潛力的高技術產(chǎn)業(yè)之一，具有重要的社會意義和經(jīng)濟效益。第8頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五8．1．3組織工程的關鍵技術組織工程這一概念的核心內(nèi)容是：活的細胞；可以供細胞進行生命活動的支架材料；組織細胞與支架材料的相互作用（生長因子和生物細胞培養(yǎng)工程）。第9頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五8．1．3組織工程的關鍵技術第10頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五歸納：組織工程的內(nèi)涵：組織工程學是綜合應用工程學和生命科學的基本原理、基本理論、基本技術和基本方法，在體外預先構(gòu)建一個有生物活性的種植體，然后植入體內(nèi)，修復組織缺損，替代組織、器官的一部分或全部功能，或作為一種體外裝置，暫時替代器官部分功能，達到提高生活、生存質(zhì)量，延長生命活動的目的。這一內(nèi)涵的核心是活的細胞、可供細胞進行生命活動的支架材料以及細胞與支架材料的相互作用，這是組織工程學研究的主要科學問題。一旦在體外能成功地制造出“組織”或“器官”，則通過醫(yī)生的創(chuàng)造性勞動，將“組織”、“器官”植入人體，完成復制或修補人體組織、器官的藝術創(chuàng)作。第11頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五應用于體外構(gòu)建工程的組織、器官的細胞主要可以是自體細胞、同種異體細胞和異種細胞。其中自體細胞存在來源嚴重短缺的限制；異種細胞存在著移植排斥反應、傳染動物源性病毒和倫理的制約；同種異體細胞同時也存在著來源有限和移植排斥反應等的問題。干細胞的研究為解決制約組織工程的細胞問題提供了一定的可能。（1）種植細胞的研究第12頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五干細胞（StemCell）：是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下可以分化成多種功能細胞。分為：高度的增殖潛能（自我更新能力或自我維持能力）高度的分化潛能（可分化為多種組織）第13頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五根據(jù)這一定義，在個體發(fā)育的不同階段以及成體的不同組織中均存在著干細胞，只是隨著年齡的增長，干細胞的數(shù)量逐漸減少，其分化潛能也逐漸變窄。在干細胞的發(fā)育過程中，還有一種中間類型的細胞稱為祖細胞(progenitorcells)，祖細胞也具有有限的增殖和分化能力，與干細胞不同的是，祖細胞沒有自我更新能力，它在經(jīng)過幾輪細胞分裂周期后產(chǎn)生的兩個子代細胞均為終末分化細胞(terminaldifferentiatedcells)第14頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五干細胞的分類按照發(fā)生學來源，干細胞可以分為胚胎干細胞(embryonicstemcell，ESC)和成體干細胞(somaticstemcell)。根據(jù)不同的分化潛能，干細胞可以被分為全能干細胞(totipotentstemcell)、多能干細胞(pluripotentstemcell)、單能干細胞(unipotentstemcell)。第15頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五干細胞的分類根據(jù)干細胞組織發(fā)生的部位進行分類。目前，已經(jīng)從許多組織或器官中成功地分離出干細胞，其中包括：胚胎干細胞、造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、肌肉干細胞、成骨于細、內(nèi)胚層干細胞、視網(wǎng)膜干細胞及胰腺干細胞等。第16頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五根據(jù)個體發(fā)育過程中出現(xiàn)的先后次序不同，分為：全能干細胞，包括：胚胎干細胞（embryonicstemcells,ES細胞）生殖干細胞（embryonicgermcells,EG細胞）:具有全能性，能夠分化成全身200多種細胞類型，進一步形成機體的任何組織和器官。

多能干細胞：具有分化成多種細胞和組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力。（在胎兒、兒童和成人組織中存在的多能干細胞統(tǒng)稱“成體干細胞（Adultstemcell）”。第17頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五胚胎干細胞

（Embryonicstemcell，ESC）從早期胚胎的內(nèi)細胞群（Innercellmass，ICM）或原始生殖細胞（primordialgermcellsPGCS）分離出來的多潛能細胞系。它具有與早期囊胚ICM或PGCS相似的生物學特性，在體外能夠保持正常二倍體核型和未分化狀態(tài)，并且有多方向分化潛能，在適當條件下，ES細胞可被誘導分化為多種細胞、組織，也可以與受體胚胎嵌合，形成嵌合體。第18頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五胚胎干細胞的優(yōu)點

——全能性內(nèi)細胞群的細胞可以發(fā)育成除了胎盤以外的完整個體，因而這些細胞被認為具有全能性。第19頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五成體干細胞

（adultstemcell，ASC）成體干細胞是存在于成體動物的許多組織和器官，具有修復和再生能力的細胞。成體干細胞大多數(shù)時候處于靜息狀態(tài)。在正常生理條件下，它傾向于更新、并分化為所在特定組織的若干種細胞，保持生長和衰退的動態(tài)平衡。而在特殊條件誘導下，它能超越特定組織，或者按照一定的程序分化形成新的其他組織的功能性細胞，參與損傷組織的修復。第20頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五成體干細胞的優(yōu)點成體干細胞則可從患者自身獲得，不存在組織相容性的問題。成體干細胞不會誘發(fā)畸胎瘤的發(fā)生。成體干細胞也不存在倫理學爭執(zhí)。第21頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五成體干細胞的不足尚未從人體的全部組織中分離出成體干細胞.成體干細胞含量極微，很難分離和純化，且數(shù)量隨年齡增長而降低在一些遺傳缺陷疾病中，遺傳錯誤很可能也會出現(xiàn)于病人的干細胞中，這樣的干細胞不適于移植成人身上獲得的干細胞可能沒有年輕人的干細胞那樣的增殖能力由于日常生活中人是暴露在各種環(huán)境之下的，日光和毒素等都有可能造成基因突變，成體干細胞可能包含更多的DNA異常等等。第22頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五現(xiàn)在研究比較集中的一些成體干細胞神經(jīng)干細胞造血干細胞間充質(zhì)干細胞骨及軟骨干細胞心臟干細胞皮膚干細胞脂肪干細胞腸胃干細胞胰腺干細胞肝臟干細胞前列腺干細胞角膜干細胞氣管干細胞血管內(nèi)皮干細胞生殖干細胞腫瘤干細胞第23頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五造血干細胞造血干細胞是體內(nèi)各種血細胞的唯一來源，它主要存在于骨髓、外周血、臍帶血中。造血干細胞易于分離純化，其體外擴增和誘導分化技術已較成熟；體外在多種細胞因子聯(lián)合作用下，能夠大量擴增并可以向紅系、粒系、巨核系等各類細胞定向分化。第24頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五造血干細胞的臨床應用急性白血病、慢性白血病、重型再生障礙性貧血、地中海貧血、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)疾病還可用于治療小細胞肺癌、乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌、神經(jīng)母細胞瘤等多種實體腫瘤。中華骨髓庫中國干細胞網(wǎng)第25頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五神經(jīng)干細胞神經(jīng)干細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中保持分裂和分化潛能的細胞。神經(jīng)干細胞可以進一步增殖、分化成中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些細胞類型。當移植入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后不具有免疫排斥反應第26頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五干細胞技術應用1.疾病治療研究干細胞增殖和分化機制的最終目的是應用干細胞治療疾病。理論上講，干細胞可以用于各種疾病的治療，但其最適合的疾病主要是組織壞死性疾病如缺血引起的心肌壞死，退行性病變?nèi)缗两鹕C合癥，自體免疫性疾病如胰島素依賴型糖尿病等。第27頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五干細胞的應用涉及到醫(yī)學的多個領域。目前，在干細胞生物學上已能在體外鑒別、分離純化、擴增和培養(yǎng)人體胚胎干細胞、原始生殖干細胞以及多種組織干細胞。用干細胞治療疾病的設想已進入實踐檢驗。造血干細胞工程產(chǎn)品如骨髓、擴增及定向誘導分化的造血細胞和免疫細胞、轉(zhuǎn)基因的基質(zhì)細胞等，已經(jīng)進入臨床應用。造血干細胞移植已成為治療白血病、各種惡性腫瘤放、化療后引起的造血和免疫系統(tǒng)功能障礙等疾病的重要手段。第28頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五2.體外制造人體器官干細胞和動物工程、生物載體材料等的結(jié)合將有可能解決這一問題。比如通過形成嵌合體，在嚴格的控制下，使動物的某些器官來源于人體干細胞。這些來自人體干細胞的器官可應用于臨床移植治療。第29頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五又如，利用細胞培養(yǎng)技術和生物可降解載體材料的結(jié)合在體外人工控制細胞分化、增殖并生長成需要的組織，使之批量產(chǎn)出，用來修補由于意外損傷等引起功能喪失的體內(nèi)組織，滿足臨床康復的需要，并有可能對一些目前尚無根治辦法的疾病，如惡性腫瘤、帕金森病、中風等提供解決方案。以干細胞工程為代表的現(xiàn)代組織工程是一個迅速發(fā)展的新領域。第30頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五體外克隆人體器官應用于臨床移植治療是干細胞研究的又一個重要方向。其目標是用病人的體細胞移植到去核的卵母細胞內(nèi)，經(jīng)過一定的處理使其發(fā)育成囊胚，再利用囊胚建立胚胎干細胞，在體外進行誘導分化成特定的組織或器官，再將這些組織或器官移植到病人身上。從理論上講，利用干細胞技術，將從根本上解決同種異體器官移植過程中最難的免疫排斥反應問題，同時還較好地解決了組織器官的來源問題。第31頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五（２）支架材料制備技術的研究支架在組織工程中的作用：為吸附在支架材料表面的細胞提供一個便于生存的三維空間，以利于細胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和進行營養(yǎng)物資的交換，并能夠排斥廢物;（關鍵詞：吸附、三維連通孔隙）為細胞的遷移、鋪展、生長、分化和最終發(fā)育形成具有特定形態(tài)功能的器官或組織奠基。（關鍵字：材料的表面特性、降解性）第32頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五組織工程支架材料的要求符合生物安全性要求合適的可生物降解吸收性合適的孔尺寸、高孔隙率和相連的孔形態(tài)特定的三維外形高表面積和合適的表面理化性質(zhì)與植入部位組織力學性能相匹配的結(jié)構(gòu)強度（關鍵技術：材料的設計、制備）第33頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五支架設計及制備技術支架材料天然高分子材料合成降解聚合物生物陶瓷生物復合材料第34頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五合成聚合物材料聚丙烯酸及其衍生物聚乙二醇及其共聚物聚乙烯醇聚交酯聚乳酸（PLA）聚（D,L-乳酸-co-乙醇酸）（PLGA）聚乙交酯（PGA）等第35頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五其它形態(tài)支架的制備技術微球基質(zhì)

靜電液滴、乳化纖維支架

靜電紡絲管狀支架

無紡網(wǎng)粘合 溶劑流涎和擠塑第36頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五在上述的各種制備技術中急需解決的是支架強度問題此外，對于一些合成的聚合物因其生物活性的其缺乏尚還需要進行必要的表面處理，而無機材料則沒有此必要。第37頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五生物材料的表面工程仿生表面工程（工程化生物材料表面引發(fā)特定的細胞生理響應，給細胞創(chuàng)造一個良好的人工ECM環(huán)境） 要求：良好的生物相容性；適宜的表面親水－疏水平衡；具有較強的細胞識別功能；適宜的表面拓撲結(jié)構(gòu)；可消除非特異性識別；易于加工和成型。第38頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五第39頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五第40頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五一、培養(yǎng)細胞的生存條件（1）無污染的環(huán)境由于體內(nèi)存在著強大的免疫系統(tǒng)和解毒器官（如肝等），對于入侵的有害物質(zhì)可以進行防御和清除，使細胞免受危害。如果在體外細胞受到污染，則細胞就將凋亡。所以無污染的環(huán)境是細胞生存的首要條件。第41頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五（2）基本的營養(yǎng)物質(zhì)的保證培養(yǎng)細胞所需要的營養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)的基本相同。體外培養(yǎng)細胞的營養(yǎng)是由細胞培養(yǎng)基提供的。培養(yǎng)液已經(jīng)商品化，為培養(yǎng)細胞提供了極大的方便。（商品號如：RPMI1640、TC199、MEM等。由于各種細胞的培養(yǎng)條件的不同，在大多數(shù)的培養(yǎng)液中還需要添加血清（如小牛血清等），以提供包括生長因子在內(nèi)的多種微量蛋白質(zhì)成份等。或者也有直接添加生長因子或細胞因子的情況。第42頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五（3）溫度人和哺乳動物培養(yǎng)的細胞最適宜的溫度是35～37℃，偏離此范圍，細胞的正常代謝和生長就要受到到影響。細胞對低溫的耐受力較高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝強度與溫度成正比，溫度低于0℃時，細胞代謝隨溫度降低而減慢，但是對細胞無傷害作用，一旦再放置于37℃培養(yǎng)，細胞還能夠生長。若置于冰點以下，細胞將死亡，但是，若在培養(yǎng)液中添加保護劑（如甘油），封入安瓶中，即可在液氮中冷凍保存，復蘇后還可以繼續(xù)生長。第43頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五（4）氣體環(huán)境和氫離子濃度氣體也是細胞生存的必要條件之一。所需的氣體為氧氣和二氧化碳。氧氣參入三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供細胞的生長、增殖和合成各種物質(zhì)。二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物也是細胞所需要的成份，主要是與維持培養(yǎng)基的PH值有關。大多數(shù)細胞耐酸性強于耐堿性，在偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。為維持培養(yǎng)基的PH值，常用CO2/HCO3-和磷酸緩沖溶液體系來完成。通常的培養(yǎng)基的PH值在6.8-7.2之間。第44頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五（5）滲透壓大多數(shù)細胞對滲透壓有一定的耐受性。人血漿的滲透壓為290mOsm/kg，可以視為培養(yǎng)基的理想滲透壓。實驗控制值的范圍為：230－320mOsm/kg。第45頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五二、培養(yǎng)細胞的類型與生命期（1）體外培養(yǎng)細胞的類型體外培養(yǎng)的細胞種類很多，主要的分類方法是根據(jù)細胞在培養(yǎng)皿中是否貼附支持物上生長性質(zhì)分成兩大類：貼附細胞：如成纖維細胞、上皮細胞、游走細胞等懸浮細胞：如淋巴細胞等。第46頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五

（2）培養(yǎng)細胞的生命期

體內(nèi)細胞處于動態(tài)平衡，其生存期與機體壽命相一致。但是從機體中取出后，培養(yǎng)細胞的生命期則與細胞的性狀有關。在培養(yǎng)液中的細胞生命期為1年左右，傳30－50代。細胞的全生存期分為：第一期原代或初代培養(yǎng)期：該期內(nèi)的細胞與體內(nèi)的細胞性狀最相似，是最理想的實驗材料第二期傳代培養(yǎng)期指傳代后的細胞系。此期最長，在傳代30－50代后進入衰退期。為保持細胞的性質(zhì)，細胞在傳代早期需要凍存保種，如不凍存則會反復傳代而可能喪失細胞二倍體性質(zhì)。第三期衰退期在該期間細胞雖生存但是繁殖很慢或不繁殖，一致細胞衰亡。第47頁，共55頁，2022年，5月20日，18點50分，星期五細胞株：在實際的研究過程中，由于第一期的細胞是最理想的，但是要得