生物樣本樣品前處理課件

生物樣品前處理范亞新生物樣品前處理范亞新富集樣品，提高檢測(cè)方法靈敏度最終進(jìn)樣提取物與流動(dòng)相及色譜柱兼容生物基質(zhì)樣品太“臟”：各類生物基質(zhì)中存在大量蛋白、鹽分和磷脂類化合物等，可能干擾目標(biāo)化合物的測(cè)定簡(jiǎn)介富集樣品，提高檢測(cè)方法靈敏度最終進(jìn)樣提取物與流動(dòng)相及色譜柱兼前處理技術(shù)1、直接稀釋法：簡(jiǎn)單、回收率高、成本低，但選擇性差，應(yīng)用有限2、超濾法：多用于測(cè)定游離藥物濃度3、蛋白沉淀法：幾乎適用于所有小分子化合物，簡(jiǎn)單快速，回收率高，但選擇性差，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重4、液液提取法：基質(zhì)效應(yīng)降低，低成本，重復(fù)性好；但難以自動(dòng)化，不適用于水溶性化合物的提取，極性相差較大的化合物同時(shí)提取困難5、固相萃取法：可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，基質(zhì)效應(yīng)降低，同時(shí)完成樣品的富集與凈化；但成本較高前處理技術(shù)1、直接稀釋法：簡(jiǎn)單、回收率高、成本低，但選擇性差液液提取法利用目標(biāo)化合物在生物基質(zhì)和與水不互溶的有機(jī)溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使化合物從生物基質(zhì)中轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中。兩相的分離需借助兩相的密度差來實(shí)現(xiàn)原理：相似相溶分配系數(shù)：kA=yA/xAyA和xA分別表示在萃取相和萃余相中的質(zhì)量比率選擇性系數(shù)（分離系數(shù)）：β=kA/kB=萃取劑的選擇：1、選擇性好：表現(xiàn)為選擇性系數(shù)大。2、萃取容量大：表現(xiàn)為分配系數(shù)大。3、萃取劑與原溶劑的互溶度。4、萃取劑和原溶劑有較大的密度差。5、化學(xué)穩(wěn)定性耐酸耐堿、抗氧化還原、耐熱、無腐蝕。6、安全性好。7、經(jīng)濟(jì)性好。Tips:PH和溫度對(duì)萃取有一定影響。液液提取法利用目標(biāo)化合物在生物基質(zhì)和與水不互溶的有機(jī)常用液液提取溶劑溶劑名稱分子量沸點(diǎn)（℃）密度（g/mL)偶極矩（D)二氯甲烷84.9401.331.60乙酸乙酯88.177.10.901.78氯代正丁烷92.6770.89乙醚74.134.50.711.15戊烷72.236.10.630

環(huán)己烷84.280.70.780正己烷86.2690.660.08甲苯92.2110.60.870.36異丙醇*60.182.40.791.66四氫呋喃*72.1660.891.63乙腈*41.181.60.783.92正丁醇*74.11171.001.50水*18.01001.001.84注：“*”表示與水互溶偶極矩越小，極性越小常用液液提取溶劑溶劑名稱分子量沸點(diǎn)（℃）密度（g/mL)偶極固相提取法

HLB(Hydrophilic-LipophilicBalanceCopolymer)材料的優(yōu)點(diǎn)△水可浸潤(rùn)△反相保留△PH1-14范圍內(nèi)穩(wěn)定△沒有裸露硅羥基固相提取法

HLB(Hydrophilic-Lipophil固相提取法固相提取法固相提取法固相提取法固相提取法改變化合物PH，酸性保留，堿性洗脫固相提取法改變化合物PH，酸性固相提取法改變化合物PH，堿性保留，酸性洗脫固相提取法改變化合物PH，堿性固相提取法改變吸附劑PH，堿性保留，酸性洗脫固相提取法改變吸附劑PH，堿性固相提取法改變吸附劑PH，酸性保留，堿性洗脫固相提取法改變吸附劑PH，酸性LC-MS-MS方法需考慮的問題

基質(zhì)效應(yīng)※樣品中除被檢測(cè)化合物外的成分，對(duì)化合物測(cè)定造成影響的效應(yīng)?！鶅煞N方式檢測(cè)基質(zhì)效應(yīng)：柱后灌流法（定性），樣品處理比較法（定量）?！鉀Q方案：1、改變樣品前處理方法。（液液提取和固相提取法可降低基質(zhì)效應(yīng)）2、優(yōu)化色譜條件。（將干擾物和待測(cè)物分離）3、優(yōu)化質(zhì)譜條件。（更換離子源，APCI源優(yōu)于ESI源）4、同位素內(nèi)標(biāo)。（終極辦法，最有效）生物基質(zhì)中的磷脂化合物易導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)，大多數(shù)表現(xiàn)為基質(zhì)抑制。建議：LC-MS-MS方法時(shí)監(jiān)測(cè)m/z184→m/z184離子對(duì)。LC-MS-MS方法需考慮的問題

基質(zhì)效應(yīng)※樣品中除被檢測(cè)化LC-MS-MS方法需考慮的問題

非特異性吸附※在低蛋白含量的生物基質(zhì)（尿液，腦脊液，透析液等）中，化合物在存放/轉(zhuǎn)移過程中與容器材料發(fā)生特異性結(jié)合的現(xiàn)象?！谙鄳?yīng)的生物基質(zhì)中或水中測(cè)試，做轉(zhuǎn)管實(shí)驗(yàn)?！ǔ８鼡Q儲(chǔ)存材料，或者在基質(zhì)中加入一定量表面活性劑可消除非特異性吸附現(xiàn)象。

常見表面活性劑：Triton-X-100，吐溫等1、表面活性劑需確立一個(gè)濃度范圍而不是單一濃度。2、樣本已經(jīng)采集，考慮將待測(cè)物從容器中解離出來。TipsLC-MS-MS方法需考慮的問題

非特異性吸附※在低蛋白含量討論和問題Thankyou!討論和問題Thankyou!生物樣品前處理范亞新生物樣品前處理范亞新富集樣品，提高檢測(cè)方法靈敏度最終進(jìn)樣提取物與流動(dòng)相及色譜柱兼容生物基質(zhì)樣品太“臟”：各類生物基質(zhì)中存在大量蛋白、鹽分和磷脂類化合物等，可能干擾目標(biāo)化合物的測(cè)定簡(jiǎn)介富集樣品，提高檢測(cè)方法靈敏度最終進(jìn)樣提取物與流動(dòng)相及色譜柱兼前處理技術(shù)1、直接稀釋法：簡(jiǎn)單、回收率高、成本低，但選擇性差，應(yīng)用有限2、超濾法：多用于測(cè)定游離藥物濃度3、蛋白沉淀法：幾乎適用于所有小分子化合物，簡(jiǎn)單快速，回收率高，但選擇性差，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重4、液液提取法：基質(zhì)效應(yīng)降低，低成本，重復(fù)性好；但難以自動(dòng)化，不適用于水溶性化合物的提取，極性相差較大的化合物同時(shí)提取困難5、固相萃取法：可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，基質(zhì)效應(yīng)降低，同時(shí)完成樣品的富集與凈化；但成本較高前處理技術(shù)1、直接稀釋法：簡(jiǎn)單、回收率高、成本低，但選擇性差液液提取法利用目標(biāo)化合物在生物基質(zhì)和與水不互溶的有機(jī)溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使化合物從生物基質(zhì)中轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中。兩相的分離需借助兩相的密度差來實(shí)現(xiàn)原理：相似相溶分配系數(shù)：kA=yA/xAyA和xA分別表示在萃取相和萃余相中的質(zhì)量比率選擇性系數(shù)（分離系數(shù)）：β=kA/kB=萃取劑的選擇：1、選擇性好：表現(xiàn)為選擇性系數(shù)大。2、萃取容量大：表現(xiàn)為分配系數(shù)大。3、萃取劑與原溶劑的互溶度。4、萃取劑和原溶劑有較大的密度差。5、化學(xué)穩(wěn)定性耐酸耐堿、抗氧化還原、耐熱、無腐蝕。6、安全性好。7、經(jīng)濟(jì)性好。Tips:PH和溫度對(duì)萃取有一定影響。液液提取法利用目標(biāo)化合物在生物基質(zhì)和與水不互溶的有機(jī)常用液液提取溶劑溶劑名稱分子量沸點(diǎn)（℃）密度（g/mL)偶極矩（D)二氯甲烷84.9401.331.60乙酸乙酯88.177.10.901.78氯代正丁烷92.6770.89乙醚74.134.50.711.15戊烷72.236.10.630

環(huán)己烷84.280.70.780正己烷86.2690.660.08甲苯92.2110.60.870.36異丙醇*60.182.40.791.66四氫呋喃*72.1660.891.63乙腈*41.181.60.783.92正丁醇*74.11171.001.50水*18.01001.001.84注：“*”表示與水互溶偶極矩越小，極性越小常用液液提取溶劑溶劑名稱分子量沸點(diǎn)（℃）密度（g/mL)偶極固相提取法

HLB(Hydrophilic-LipophilicBalanceCopolymer)材料的優(yōu)點(diǎn)△水可浸潤(rùn)△反相保留△PH1-14范圍內(nèi)穩(wěn)定△沒有裸露硅羥基固相提取法

HLB(Hydrophilic-Lipophil固相提取法固相提取法固相提取法固相提取法固相提取法改變化合物PH，酸性保留，堿性洗脫固相提取法改變化合物PH，酸性固相提取法改變化合物PH，堿性保留，酸性洗脫固相提取法改變化合物PH，堿性固相提取法改變吸附劑PH，堿性保留，酸性洗脫固相提取法改變吸附劑PH，堿性固相提取法改變吸附劑PH，酸性保留，堿性洗脫固相提取法改變吸附劑PH，酸性LC-MS-MS方法需考慮的問題

基質(zhì)效應(yīng)※樣品中除被檢測(cè)化合物外的成分，對(duì)化合物測(cè)定造成影響的效應(yīng)?！鶅煞N方式檢測(cè)基質(zhì)效應(yīng)：柱后灌流法（定性），樣品處理比較法（定量）?！鉀Q方案：1、改變樣品前處理方法。（液液提取和固相提取法可降低基質(zhì)效應(yīng)）2、優(yōu)化色譜條件。（將干擾物和待測(cè)物分離）3、優(yōu)化質(zhì)譜條件。（更換離子源，APCI源優(yōu)于ESI源）4、同位素內(nèi)標(biāo)。（終極辦法，最有效）生物基質(zhì)中的磷脂化合物易導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)，大多數(shù)表現(xiàn)為基質(zhì)抑制。建議：LC-MS-MS方法時(shí)監(jiān)測(cè)m/z184→m/z184離子對(duì)。LC-MS-MS方法需考慮的問題

基質(zhì)效應(yīng)※樣品中除被檢測(cè)化LC-MS-MS方法需考慮的問題

非特異性吸附※在低蛋白含量的生物基質(zhì)（尿液，腦脊液，透析液等）中，化合物在存放/轉(zhuǎn)移過程中與容器材料發(fā)生特異性結(jié)合的現(xiàn)象?！谙鄳?yīng)的生物基