LAMP微流控芯片即時檢測骨髓增殖性腫瘤分子標志物的研究

LAMP微流控芯片即時檢測骨髓增殖性腫瘤分子標志物JAK2V617F、MPLW515K/L的研究研究背景-骨髓增殖性腫瘤骨髓增殖性腫瘤（MPN）：慢性粒細胞白血病（CML）、真性紅細胞增多癥（PV）、原發(fā)性血小板增多癥（ET）、原發(fā)性骨髓纖維化（PMF）臨床困擾的問題:經(jīng)典MPN（PV,ET和PMF）之間可互相轉(zhuǎn)化或合并存在，不同類型的MPN與反應性增生之間的鑒別診斷困難。PVETPMFMPN診斷革命性的突破-分子標志物的發(fā)現(xiàn)WHO：JAK2V617F和MPLW515K/L基因突變列入PV、ET、PMF的診斷標準之一。JAK2V617F：JAK2基因14外顯子1849位堿基G>T點突變,PV95%，ET/PMF50%-60%。MPLW515K/L:MPL基因10號外顯子515位密碼子色氨酸TGG替換為賴氨酸AAG(515K)/亮氨酸TTG(515L)，ET/PMF5%～10%。梅奧診所制定經(jīng)典MPN分子診斷的路徑臨床醫(yī)生能有序使用這兩種分子指標避免昂貴的檢測費用聯(lián)合檢測意義重大明確MPN診斷有助于MPN治療及預后腦卒中的社區(qū)篩查骨髓增殖性腫瘤與缺血性卒中MPN是腦卒中的病因之一，部分患者在診斷為MPN之前，就因發(fā)生血栓導致急性缺血性腦卒中。JAK2V617F突變陽性為MPN患者腦血栓形成的獨立預測因子，血栓形成是MPN患者死亡主要原因。JAK2V617F突變的檢測有助于判定腦血管事件風險。專家建議在社區(qū)開展腦卒中MPN分子標志物篩查。社區(qū)篩查亟需建立MPN分子標志物POCT方法社區(qū)篩查：急性缺血性腦卒中患者早治療，減少血栓并發(fā)癥?；蛲蛔儥z測方法：PCR，測序。

即時檢驗（POCT)：現(xiàn)場、便攜和快速。建立即時檢測JAK2V617F、MPLW515K/L基因突變新方法，以實現(xiàn)對MPN的早期診斷，為腦卒中患者提供MPN分子標志物的社區(qū)篩查手段。研究目的研究方法-微流控芯片結(jié)合等溫擴增技術(shù)微流控芯片(Microchip)：實驗室的功能集成在幾平方厘米芯片上，可集成化、便于攜帶。Labonchip環(huán)介導等溫擴增(LAMP)：快速、靈敏度高,特異性強、操作方便。

Microchip-LAMP可擺脫對精良儀器設(shè)備及精確溫度的依賴研究內(nèi)容

單位點基因突變檢測微流控芯片的研制及其即時檢測JAK2V617F突變的應用。多位點基因突變檢測微流控芯片的研制及其在即時檢測JAK2V617F，MPLW515K/L突變的應用。第一部分單位點基因突變檢測微流控芯片的研制及其即時檢測

JAK2V617F突變的應用技術(shù)路線研究方法與結(jié)果-引物設(shè)計JAK2V617F野生型引物：F3-W，B3-W，F(xiàn)IP-W,BIP-W，P-W,PNA-MJAK2V617F突變型引物：F3-M，B3-M，F(xiàn)IP-M,BIP-M，P-M,PNA-W研究方法與結(jié)果-熒光染料鈣黃綠素反應前加入LAMP反應體系，一步反應后無需開蓋，可根據(jù)是否有肉眼可見綠色熒光準確判斷反應結(jié)果。引物驗證-可視化檢測V617F突變型引物V617F野生型引物HELHELHL-60

HL-60

HEL:

純合JAK2V617F突變的人紅白血病細胞株作為陽性對照HL-60:人早幼粒白血病細胞細胞株作為突變陰性對照引物驗證-實時濁度檢測JAK2V617F突變LAMP引物特異性擴增V617F陽性DNA引物驗證-實時濁度檢測JAK2V617F野生型LAMP引物特異性擴增V617F突變陰性DNALAMP產(chǎn)物測序分析JAK2基因14外顯子1849位堿基G>T點突變LAMP產(chǎn)物酶切鑒定方法與結(jié)果-單位點基因突變微控芯片設(shè)計全血細胞熱裂解區(qū)擴增及檢測區(qū)濾過區(qū)螺絲閥陰性對照陽性對照方法與結(jié)果-JAK2V617F等溫微流控芯片設(shè)計與制作ibLchip問題：1.核酸提取2.直觀檢測芯片3D示意圖樣品進授權(quán)國家發(fā)明專利：整合全血核酸提取、擴增即可視化檢測腫瘤基因突變的微流控芯片（ZL201410554594.0）結(jié)果出方法與結(jié)果-芯片核酸提取ABC0.5μl全血：6ng50kb:基因組DNA完整性方法與結(jié)果-芯片靈敏度檢測基于芯片微通道LAMPV617F突變檢出限熒光染料鈣黃綠素617F(+)(-)0.01%NWMP結(jié)果-臨床樣本分析A:野生型B:雜合型

C:純合突變

方法學準確性分析（30例PV,30例對照）

非標記探針高分辨率熔解曲線分析(MCA)，ibLchipV617F結(jié)果-臨床樣本分析

PV患者基因組DNAPCR擴增產(chǎn)物克隆后測序結(jié)果（反向）

非標記探針技術(shù)：JAK2V617F野生型；ibLchip：JAK2V617F雜合突變第一部分小結(jié)創(chuàng)新點ibLchip：整合全血核酸提取、基因擴增、可視化檢測國家發(fā)明專利：（ZL201410554594.0）1小時內(nèi)完成JAK2V617F突變檢測不足之處：ibLchip只能檢測單個基因突變細胞裂解液中獲得基因組DNA量有限需熱板、水浴鍋等插電設(shè)備，限制即時檢測的應用第二部分多位點基因突變檢測微流控芯片的研制及其在即時檢測

JAK2V617F，MPLW515K/L突變的應用前言MPN是多位點基因突變引起的疾病,診斷、治療和腦卒中社區(qū)篩查均需多重指標聯(lián)合檢測。即時檢測的主要標準：不需固定的檢測場所，試劑和儀器是便攜式的，并且可及時操作。研究目的研制一款多位點基因突變的LAMP微流控芯片，結(jié)合自主研發(fā)的便攜式核酸快速提取裝置和便攜式微型溫控儀，實現(xiàn)對MPN分子標志物的即時檢測。技術(shù)路線第二部分研究工作3D示意圖研究方法與結(jié)果-聚丙烯絲束/毛細管提取基因組DNAQubit定量5μl全血：50±2.5ng；10μl全血：81±4.2ng；20μl全血150±5.8ng15分鐘內(nèi)完成采血、基因組DNA提取基因組DNA具有完整性授權(quán)專利：一種快速提取全血基因組DNA的裝置（ZL201510532629.5）研究方法與結(jié)果-便攜式微型溫控儀溫控儀設(shè)計圖溫控儀實物圖溫控儀控制溫度為37～100°C，控制精度≤±0.3研究方法與結(jié)果-MPLW515K/L引物設(shè)計及驗證W515k引物特異性擴增W515K突變質(zhì)粒W515L引物特異性擴增W515L突變質(zhì)粒可視化檢測（515K引物）（515L引物）515K突變質(zhì)粒515L突變質(zhì)粒W515野生型引物特異性擴增W515野生型質(zhì)粒研究方法與結(jié)果可視化檢測515野生型引物515野生型質(zhì)粒研究方法與結(jié)果-MPLW515K/L引物設(shè)計及驗證實時濁度法W515k引物特異性擴增W515K突變質(zhì)粒W515L引物特異性擴增W515L突變質(zhì)粒研究方法與結(jié)果-MPLW515K/L引物設(shè)計及驗證實時濁度法W515野生型引物特異性擴增W515野生型質(zhì)粒方法與結(jié)果-MPL515K/LLAMP產(chǎn)物測序515LTGG-TTG515KTGG-AAG方法與結(jié)果-MPL515KLAMP產(chǎn)物酶切鑒定方法與結(jié)果-MPL515LLAMP產(chǎn)物酶切鑒定設(shè)計及制作檢測MPN多個分子標志物的LAMP微流控芯片μmLchip：ALAMPmicrochipforsimultaneousmulti-genemutationscreeninginpatientwithMPN）檢測基因檢測槽道陽性對照槽道V617F野生型1P1V617F突變型2P2W515K突變型3P3W515L

突變型4P4W515野生型5P5N,陰性對照；P,陽性對照；N*,空白對照μmLchip

μmLchipA，SU-8陽模；B，μmLchip實物圖研究流體控制的芯片流體控制芯片A,SU-8陽模；B,芯片實物圖檢測基因突變率的微流控芯片靈敏度檢測微流控芯片A，SU-8陽模；B，芯片實物圖芯片流體控制研究礦物油閥控制LAMP芯片流體

A，加熱前；B，65℃加熱1小時后LAMP微流控芯片檢測基因突變靈敏度分析

A,

W515K（0.1%）；B,W515L（0.1%）；V617F（0.01%）方法學準確度分析本室自建方法作為參考方法非標記探針HRM分析JAK2V617F突變，熒光定量PCR分析MPLW515K/L突變臨床樣本：30例ET患者，10例PMF患者ET患者：12例JAK2V617F突變陽性，1例MPLW515K突變陽性（同時伴JAK2V617F突變陽性，1例MPLW515L突變陽性。PMF患者：4例JAK2V617F突變陽性，1例MPLW515L突變陽性。μmLchip

與參考方法基本一致對1例未確認樣本（μmLchip：JAK2V617F突變陽性；非標記探針HRM法：陰性）進行亞克隆測序，測序結(jié)果確定此標本存在JAK2V617F突變。μmLchip檢測結(jié)果模式JAK2V617F突變型

MPLW515K突變型MPLW5