下一代測序技術在臨床實驗診斷中的應用

下一代測序技術

在臨床實驗診斷中的應用

測序技術的發(fā)展1954年，Whitfeld等用化學降解的方法測定多聚核糖核苷酸序列1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法，Gilbert等發(fā)明的化學降解法進行DNA測序80年代中期出現了以熒光標記代替放射性同位素標記、以熒光信號接收器和計算機信號分析系統(tǒng)代替放射性自顯影的自動測序儀90年代中期出現毛細管電泳技術Sanger測序技術指標讀長可達1000bp準確率99.999%每千堿基對測序成本僅$0.5每天的數據通量可以達到600000

bp對于一代測序而言，其速度和成本已達到極限。測序技術的發(fā)展進入21世紀后，以Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的SOLiD技術為標志的下一代測序技術誕生了。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)——GenomeSequencer20System，開創(chuàng)了邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）的先河?！癗extgenerationsequencing”PubmedsearchingJun10,2015FortheFirsttime:Whole-GenomeSequencingDeliversNewTreatmentOptionsforTwinswithRareGeneticMovementDisorder50-HourWholeGenomeSequencingProvidesRapidDiagnosisforChildrenWithGeneticDisorders下一代測序（NGS）已逐漸應用于臨床分子診斷不同規(guī)模的NGS實驗在臨床分子診斷中的應用全基因組測序（Genome）：產前診斷全外顯子組測序（Exome）：發(fā)現、鑒定致病基因靶向目標基因測序（Panel）：臨床分子診斷SangerPanelExomeGenome非常準確價格低廉/外顯子檢測周期短可以優(yōu)化“偶然發(fā)現”可能性低容易分析結果容易解讀無基因偏倚標準化工作流程可以對用完的數據進行再分析測序無偏倚極少技術偏倚同時檢測結構性變異和SNV對遺傳異質性高的疾病診斷率低需要對panel進行設計和再設計針對不同的疾病需要不同的panel需要足夠的樣本存在測序偏倚沒有非編碼區(qū)信息“偶然發(fā)現”存在數據分析瓶頸非編碼區(qū)變異的解釋耗時臨床分子診斷中各種測序方法的優(yōu)劣比較Contributionofdifferentfactorstotheoverallcostofasequencingprojectacrosstime在臨床診斷領域首次利用WES，對一例原先懷疑為Batter綜合征的患兒作出了先天性氯化物丟失性腹瀉的正確診斷，該患兒發(fā)生了SLC26A3基因的D652N的新生純合突變NGS在臨床分子診斷中的應用NGS在神經肌肉系統(tǒng)疾病分子診斷中的應用(1)將NGS技術作為常規(guī)診斷試驗進行候選基因突變篩查對于神經肌肉系統(tǒng)疾病患者的臨床診療和遺傳咨詢具有重要價值NGS在神經肌肉系統(tǒng)疾病分子診斷中的應用(2)DMD和BMD是最常見的NMDDMD基因巨大，常規(guī)方法難度大89例DMD和BMD患者，18例女性攜帶者和245例非DMD患者CNV：99.99%精確性

和98.96%敏感性SNV：100%準確率9例患者發(fā)生部分外顯子缺失，可知精確斷裂位置信息NGS在視網膜疾病分子診斷中的應用（1）作者病例數基因數臨床診斷基因診斷率Neveling,etal.100111視網膜變性36%Audo,etal.20254遺傳性視網膜病家系57%Bowne,etal.2146常染色體顯性遺傳視網膜變性家系24%Glockle,etal.170105遺傳性視網膜營養(yǎng)不良55%～80%Wang,etal.123163視網膜變性37%Fu,etal.31163常染色體隱性視網膜變性家系40%較之傳統(tǒng)的分子診斷方法（如采用Sanger測序技術逐個基因進行分析），NGS能夠有效提高各種類型視網膜疾病分子診斷的能力和效率；同時能有效降低分子診斷的費用NGS在視網膜疾病分子診斷中的應用（2）105個已知視網膜疾病致病基因組成的NGS診斷panel107例臨床未經篩選的視網膜疾病患者視網膜變性患者的分子診斷率：55%Bardet–Biedl綜合征或Usher綜合征患者：80%均發(fā)現致病或候選致病變異NGS在遺傳病攜帶者檢測中的應用利用NGS技術，能對嚴重影響兒童健康的遺傳病進行全面、系統(tǒng)篩查NGS在線粒體疾病分子診斷中的應用42例經常規(guī)基因檢測未能診斷的嬰兒型線粒體病此panel包含線粒體基因組、100個已知線粒體病致病基因及1000個與線粒體功能相關基因與正常人相比，患者群體中具有功能影響的變異（罕見變異、影響蛋白功能的變異及隱性遺傳的變異）負荷增加了5倍55%存在隱性基因突變或致病性線粒體基因突變：10例（24%）患者進行明確的分子診斷；

13例（31%）患者出現核基因突變，其中2例患者的突變經功能研究發(fā)現可疑引起線粒體病NGS在產前診斷中的應用利用NGS技術對孕婦外周血中的cfDNA進行無創(chuàng)產前診斷（noninvasiveprenataltesting,NIPT）已成為該領域的發(fā)展趨勢基于孕婦外周血無細胞血漿胎兒DNA的無創(chuàng)產前診斷的21三體（0.3%vs.3.6%,P<0.001）和18三體（0.2%vs.0.6%,P=0.03）的假陽性率遠低于傳統(tǒng)的產前篩查NIPT能夠檢出全部攜帶常染色體異倍體的孕婦，陰性預測值為100%（95%CI：99.8%～100%）同時，NIPT對21三體（45.5%vs4.2%）和18三體（40.0%vs8.3%）的陽性預測值顯著高于標準篩查方法可以作為常染色體異倍體篩查的一線方法NGS在腫瘤分子診斷中的應用診斷用藥治療監(jiān)測預后評估……精準醫(yī)學計劃2015年1月20日，美國總統(tǒng)奧巴馬在國情咨文演講中提出了“精準醫(yī)學計劃”，30日白宮發(fā)布文件正式啟動“精準醫(yī)學計劃”，希望精準醫(yī)學可以引領一個醫(yī)學新時代。精準醫(yī)學

是一種在預防和治療疾病時，考慮到人體在遺傳、環(huán)境和生活方式中存在個體化差異的新方法。精準醫(yī)學計劃將產出推動精準醫(yī)學概念進入臨床實踐的科學證據。美國精準醫(yī)學計劃-定義把按基因匹配癌癥療法變得像匹配血型那樣標準化，把找出正確的用藥劑量變得像測量體溫那樣簡單，每次都給恰當的人在恰當的時間使用恰當的療法。美國精準醫(yī)學計劃-定義美國總統(tǒng)奧巴馬的解釋美國精準醫(yī)學計劃-目標著重發(fā)展癌癥基因組學支持靶向藥物的臨床試驗、藥物組合解決方案以及限制靶向用藥耐藥性的研究開發(fā)新的腫瘤細胞模型以預測藥物組合有效性，并研究藥物耐藥機制短期目標：致力于將精準醫(yī)學應用于癌癥領域針對不同人群的靶向抗腫瘤藥物的創(chuàng)新性臨床試驗癌癥的綜合療法攻克藥物耐受長期目標：為實現多種疾病的個性化治療提供有價值的信息創(chuàng)建大于100萬的志愿者隊列，他們愿意共享基因數據、生物樣本及所有電子健康信息。通過分析百萬志愿者的基因信息，研究遺傳性變異在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，了解疾病治療的分子基礎，為藥物研發(fā)與患者“精準治療”明確方向。高級藥物基因組學，針對每個病人使用正確劑量的正確藥物確定疾病新的治療和預防目標測試移動設備對人們健康生活習慣養(yǎng)成的作用為更多疾病的精準醫(yī)學提供科學基礎美國精準醫(yī)學計劃-目標中國的精準醫(yī)學國家精準醫(yī)療戰(zhàn)略專家會議組建19人專家委員會計劃在2030年前投入600億元精準醫(yī)學時代的到來美國精準醫(yī)學：強調的基因組、蛋白質組學等大多存在于分子層面，并以癌癥等重大疾病為主要攻克對象；中國精準醫(yī)學：定義更加寬泛，現代科技中不局限于分子層面，且加入了其他科技以及傳統(tǒng)醫(yī)學，并把有效與安全、經濟，個體和社會效益放在同等重要的地位。中國疾病分布有自身特點：中國癌癥患者多，腫瘤患者每年新增350萬例，且癌癥發(fā)病譜有自身特點在遺傳病上，每年出生的缺陷新生兒120萬例中國是一個傳染病大國，抗生素濫用非常突出中國版精準醫(yī)療需要聚焦在惡性腫瘤、疑難罕見病、疑難性疾病、藥物基因組學。我國應發(fā)展具有中國特色、符合中國國情的精準醫(yī)學中國的精準醫(yī)學NGS在腫瘤分子診斷中的應用RainDropSourceKRASBackgroundSample+ThunderboltsEGFRTP53ThunderboltcancerpanelIncludeskeydrivermutations,tumorsuppressorgenes,drugresistancemarkersDividesample’stargetsintodigitalsingle-moleculeformatAllthedropletshaveALLtheprimerpairsIndexingbarcodesincorporatedin2ndstandard-formatPCRreactionFlowcell-readyforIlluminasequencersABL1EGFRGNAQKRASPTPN11AKT1ERBB2GNASMETRB1ALKERBB4HNF1AMLH1RETAPCEZH2HRASMPLSMAD4ATMFBXW7IDH1NOTCH1SMARCB1BRAFFGFR1IDH2NPM1SMOCDH1FGFR2JAK2NRASSRCCDKN2AFGFR3JAK3PDGFRASTK11CSF1RFLT3KDRPIK3CATP53CTNNB1GNA11KITPTENVHL50ImportantCancerGenes230AmpliconsOncologyCompanionDx我們的實踐WES用于范可尼貧血（FA-A）的

臨床分子診斷FANCA基因的復合雜合突變WES用于家族性馬蹄內翻足的

臨床分子診斷FLNBc.4810G>T,p.D1604YWES用于先天性關節(jié)攣縮畸形的

臨床分子診斷WES用于出血病患者的分子診斷病人資料患者，女性，臨床類似血友病出血表現用凝血酶原復合物治療有效DIC、凝血因子活性檢測均正常VWD排除血小板功能正常其弟與其有相似的臨床出血表現，父母為近親婚配遺傳性出血性疾?。蜃庸δ苋毕荩浚㎞GS結果631A>C,211T>P

F10基因表型診斷APTT:

50.2sFⅤ:124.9%PT:

11.3sFⅧ:76.7%INR:

0.98FⅪ:118.7%FIB:

3.71g/LFⅫ:80.7%FⅡ:

109.8%FⅦ:

100.4%FⅨ:72.0%FⅩ(PT法):

108.3%FX:C（APTT法）=4.36%病人凝固時間=76.7s發(fā)色底物法：FX:C=109.4%NGS應用于疾病基因診斷存在的問題基因變異致病性的確定（缺乏統(tǒng)一、精確注釋、經審核的基因型-表型數據庫;文獻報道中有27%的致病變異實為多態(tài)性或注釋錯誤）偶然發(fā)現結果的報告（ACMG指南及引發(fā)的爭議）N