工業(yè)發(fā)酵染菌的防止課件

第十章

工業(yè)發(fā)酵染菌的防止和滅菌江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院張志才E.Mail：zhangzhicai2001@一、染菌的危害二、雜菌污染的原因與防治三、噬菌體污染的防止絕大多數(shù)工業(yè)發(fā)酵，無論是單菌發(fā)酵還是混合菌種發(fā)酵，都是純種發(fā)酵，除菌種以外的微生物都被視為雜菌。所謂染菌，是指在發(fā)酵培養(yǎng)基中侵入了有礙生產(chǎn)的其它微生物。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)都有可能遭受雜菌或噬菌體的污染。一、染菌的危害：對發(fā)酵本身的影響：輕者影響產(chǎn)量或質(zhì)量，重者可能導(dǎo)致倒罐，甚至停產(chǎn)，造成原料、人力和設(shè)備力的浪費。因此，防止雜菌和噬菌體污染是保證發(fā)酵正常進行的關(guān)鍵之一。對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響

（1）對過濾的影響發(fā)酵液的粘度加大；菌體大多自溶；由于發(fā)酵不徹底，基質(zhì)的殘留濃度加度。造成過濾時間拉長，影響設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞生產(chǎn)平衡；大幅度降低過濾收率。（4）、染菌對三廢處理的影響使過濾后的廢菌體無法利用，發(fā)酵染菌的廢液，生物需氧量（BOD）增高，增加三廢治理費用和時間。染菌對三廢處理的影響使過濾后的廢菌體無法利用，發(fā)酵染菌的廢液，生物需氧量（BOD）增高，增加三廢治理費用和時間。

防重于治，事前防止勝于事后挽救。即使在發(fā)酵后期染菌，對產(chǎn)量無顯著影響，也對提取不利，會降低產(chǎn)品質(zhì)量及收率。染菌原因：菌種、空氣、設(shè)備、原料等。除了需要采取措施確保菌種本身的純度、不使接種物帶入雜菌外，深層發(fā)酵中必需認(rèn)真做好培養(yǎng)基及有關(guān)發(fā)酵設(shè)備的滅菌、空氣除菌、無菌操作等工作，以確保發(fā)酵的順利進行。一、雜菌污染的原因與防治從染菌的現(xiàn)象分析染菌原因：（1）從染菌時間來看，早期染菌(如接種后12h或24h)，除了種子帶菌外，主要是培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底。相反，中、后期染菌則可能與中間補料、設(shè)備滲漏以及操作不合理等有關(guān)，也可能是空氣過濾器不嚴(yán)所致。（2）從污染的雜菌類型看，污染耐熱的芽孢桿菌，多數(shù)是因培養(yǎng)基滅菌不徹底或設(shè)備存在死角所致。污染無芽孢桿菌、球菌等不耐熱菌，可能是從蒸氣的冷卻水中帶來的，空氣系統(tǒng)密封不嚴(yán)造成。感染淺綠色菌落(G-桿菌、球菌)，來源是水，可熊是設(shè)備滲漏或冷卻器穿孔。感染霉菌、酵母，一般是由于滅菌不徹底或無菌操作不嚴(yán)造成的。（3）大面積發(fā)酵罐染菌是指整個工廠各個產(chǎn)品的發(fā)酸罐都出現(xiàn)雜菌現(xiàn)象，而且染的是同一種菌，主要是空氣過濾器除菌不凈，空氣帶菌而造成。（4）部分發(fā)酵罐(或罐組)雜菌，例如生產(chǎn)同—產(chǎn)品的幾個發(fā)酸罐都染菌，如果染菌出現(xiàn)在早期，可能是種子帶雜菌；出現(xiàn)在中后期，則可能是補料或空氣帶菌所致。在使用連消的設(shè)備中，如果用連消進料的發(fā)酵罐都出現(xiàn)染菌，則可能是連消系統(tǒng)滅菌不徹底而引起的。（5）個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌，較多地是由于設(shè)備問題而造成的。如閥門的滲漏或罐體被損，特別是蛇形管的穿孔，有時不易察覺。有時設(shè)備破損引起的染菌會出現(xiàn)每批染菌時間前移現(xiàn)象。（6）個別發(fā)酵罐偶然染菌的原因最為復(fù)雜，各種染菌途徑都有可能引起。防治染菌要點：（1）空氣系統(tǒng)防止空氣帶菌主要是提高空壓機進口空氣的潔凈度、防止空氣帶油、水及過濾器失效。如提高空壓機吸氣口位置并加強壓縮前的過濾，防止空氣冷卻器漏水頂進入空氣系統(tǒng)；在空氣過濾器滅菌時要防止沖翻介質(zhì)而短路，防止考焦介質(zhì)或著火；當(dāng)突然停止進空氣時，要防止發(fā)酵液倒流入過濾器內(nèi)；裝填纖維介質(zhì)時要壓緊；操作中要防止空氣的壓力劇變和流速激增等。（2）蒸汽重視飽和蒸汽的質(zhì)量，嚴(yán)防蒸汽中夾帶大量冷凝水，防止蒸汽壓力大幅度波動，保證生產(chǎn)用汽壓在0.3~0.35MPa以上。（3）設(shè)備a．連消設(shè)備的連消塔要簡單，易拆裝清理，操作時蒸汽能與物料均勻混合，并易控溫度；維持罐在料液輸送時培養(yǎng)基在罐中能均勻地緩慢上升，不走短路。b．發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備應(yīng)注意嚴(yán)密和防止泄漏，避兔形成“死角”。與物料、空氣、下水道連接的閥門皆需保證嚴(yán)密度。c．用超凈工作臺及凈化室代替無菌室，以提高無菌程度。（4）工藝操作a．空罐準(zhǔn)備放罐后應(yīng)進行全面檢查和清洗。要清理罐內(nèi)殘渣，去除罐壁污垢，清除空氣分布管、溫度計套管等處堆積的污垢及罐內(nèi)的“死角”。要防止端面軸封漏氣、攪拌填科箱及閥門滲漏等。蛇管和夾層要按設(shè)計規(guī)定的壓力定期試壓?？障麜r應(yīng)先將罐內(nèi)空氣排盡，保持蒸汽暢通，閥門、管道均要徹底滅菌。

b．實罐滅菌配制培養(yǎng)基時要防止原料結(jié)塊。配料罐出口應(yīng)有篩板過濾器(篩孔直徑＜0.5mm)，以防塊狀物及異物進入罐內(nèi)。滅菌時，要保證各路進氣暢通及罐內(nèi)料液翻騰激烈，控制好溫度與壓力；嚴(yán)防泡沫冒頂及料液倒流到空氣系統(tǒng)中。

c．連消料液進入連消塔前需先預(yù)熱。滅菌過程中，料液溫度及其在維持罐停留的時間都必須符合要求，確保滅菌徹底。當(dāng)冷卻管開放冷水時，防止因突然冷卻造成負(fù)壓而吸入外界空氣。為確保滅菌溫度穩(wěn)定，連消必須實現(xiàn)自動控制。

d．補料補入發(fā)酵罐內(nèi)的料液一定要保證無菌。

e．種子有關(guān)種子操作的制度要嚴(yán)格遵守。搖瓶瓶塞要確保嚴(yán)密。種子培養(yǎng)基滅菌時要防止升溫太快。

f．無菌試驗無菌試驗要嚴(yán)格取樣操作，力求減少誤差。應(yīng)同時用肉湯和雙碟作對照，以便迅速作出判斷。當(dāng)發(fā)現(xiàn)染菌時，要通過分辯菌型來探索菌源，并對雜菌作耐熱試驗考察。如果懷疑種子罐染菌，則種子不能輕率進發(fā)酵罐。種子帶菌的原因及防止1、帶菌的原因（1）無菌室的無菌條件不符合要求；（2）培養(yǎng)基滅菌不徹底；（3）操作不當(dāng)。2、種子帶菌的防止種子帶雜菌是發(fā)酵前期染菌的原因之一。在每次接種后應(yīng)留取少量的種子懸浮液進行平板、肉湯培養(yǎng)，借以說明是否是種子中帶雜菌。種子培養(yǎng)的設(shè)備和裝置有無菌室、滅菌鍋和搖瓶機等。（1）無菌室

接種、移種等無菌操作需要在無菌室內(nèi)進行。無菌室面積不宜過大，一般約4~6米2高約2.6米。為了減少外界空氣的侵入，無菌室要有1~3個套間(緩沖過道)。無菌室內(nèi)部的墻壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求無裂縫，墻角最好做成圓弧形，便于揩擦清洗以減少空氣中微生物的潛伏場所，室內(nèi)布置應(yīng)盡量簡單，最好能安裝空氣調(diào)節(jié)裝置，通入無菌空氣并調(diào)節(jié)室內(nèi)的溫濕度。無菌室的每個套間一般都用紫外線滅菌。通常用30瓦紫外線滅菌燈照射20~30分鐘即可。紫外線殺菌的效率還與室內(nèi)空氣的性質(zhì)有關(guān)；空氣溫度高殺菌效率高，空氣中灰塵多殺菌效率低，而相對濕度高則紫外線燈的使用壽命長。紫外線能穿過石英但不能透過玻璃。無菌室的立視圖配合使用的化學(xué)滅菌藥劑有：用作噴灑或揩擦的(以揩擦為主)有75%酒精、0.25%新潔而滅(季胺鹽)、0.6~1%漂白粉、0.5%石炭酸、0.5%過氧乙酸、1%煤酚皂(來蘇爾)、0.5%高錳酸鉀、300單位/毫升土霉素、50單位/毫升制霉菌素等；用作熏蒸的有甲醛(每立方米空間約用10毫升)或硫磺(每立方米空間約用2~3克)。要根據(jù)不同情況采用不同的滅菌劑。如檢查出無菌室中潛伏的微生物中細(xì)菌較多，用石炭酸、土霉素等滅菌較好；如無菌室中霉菌多可以采用制霉菌素；如有噬菌體則用甲醛、雙氧水或高錳酸鉀等較好。無菌室內(nèi)無菌度的要求是：把無菌培養(yǎng)皿平板打開蓋子在無菌室內(nèi)放置30分鐘，根據(jù)一般工廠的經(jīng)驗，長出的菌落在3個以下為好。（2）培養(yǎng)基滅菌不徹底時間：通入表壓為1公斤／厘米2的蒸汽時，三角瓶中培養(yǎng)基的體積與升溫時間的關(guān)系假壓：（3）操作不當(dāng)——搖瓶機搖瓶機(亦稱搖床)是培養(yǎng)好氣菌的小型試驗設(shè)備或作為種子擴大培養(yǎng)之用，常用的搖瓶機有往復(fù)式和旋轉(zhuǎn)式兩種。死角所謂死角是指滅菌時因某些原因使滅菌溫度達不到或不易達到的局部地區(qū)。發(fā)酵罐及其管路如有死角存在，則死角內(nèi)潛伏的雜菌不易殺死，會造成連續(xù)染菌，影響生產(chǎn)的正常進行。法蘭連接的死角渣滓在罐底與用環(huán)式空氣分布管所形成的死角不銹鋼襯里的死角接種管路的死角排氣管的死角罐頂排氣管彎頭處如有堆積物，其中窩藏的雜菌不容易徹底消滅，而當(dāng)發(fā)酵時受攪拌的震動和排氣的沖擊就會一點點地剝落下來造成污染。另外排氣管的直徑太大，滅菌時蒸汽流速小也會使管中部分耐熱菌不能全部殺死。有的單位曾作過試驗，將排氣管做成每節(jié)可拆卸的，滅菌后將各節(jié)拆下分別檢查就發(fā)現(xiàn)某些末被殺死的耐熱菌。所以排氣管要與罐的尺寸有一定比例，不宜過大或過小不合理補料管配置造成的死角壓力表安裝不合理形成的死角A：不合理；B：合理無菌檢查與染菌的處理：為了防止在種子培養(yǎng)或發(fā)酵過程中污染雜菌，在接種前后、種子培養(yǎng)及發(fā)酵過程中分別進行無菌檢查，以便及時發(fā)現(xiàn)染菌，并在染菌后及時進行必要處理是很重要的。發(fā)酵過程的雜菌檢查（1）無菌檢查染菌通常通過3個途徑發(fā)現(xiàn)：無菌試驗，發(fā)酵液直接鏡檢，發(fā)酵液的生化分析。其中無菌試驗是判斷染菌的主要依據(jù)。無菌試驗方法有雙碟培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、肉湯培養(yǎng)、鏡檢等，其中以雙碟和肉湯培養(yǎng)為主。（2）染菌的判斷以肉湯和雙碟培養(yǎng)的反應(yīng)為主，鏡檢為輔。每8h一次的無菌檢查，至少用2只酚紅肉湯及1只雙碟同時取樣。無菌試驗時，如果肉湯連續(xù)3次變色(紅黃)或產(chǎn)生渾濁，或雙碟培養(yǎng)連續(xù)3次有雜菌菌落，即判斷為染茵。（3）染菌率的統(tǒng)計以發(fā)酵罐染菌批(次)為基準(zhǔn)，染菌罐批(次)應(yīng)包括染菌重消后的重復(fù)染菌批(次)在內(nèi)。整個發(fā)酵周期中，無論前期或后期染菌，均作“染菌”論處。染菌率(％)=發(fā)酵(罐)染菌批(次)／總數(shù)罐批(次)*100%1）總?cè)揪剩褐敢荒陜?nèi)發(fā)酵染菌的批次與總投料批次數(shù)之比乘以100得到的百分率。2）設(shè)備染菌率：統(tǒng)計發(fā)酵罐或其他設(shè)備的染菌率，有利于查找因設(shè)備缺陷而造成的染菌原因。3）不同品種發(fā)酵的染菌率：統(tǒng)計不同品種發(fā)酵的染菌率，有助于查找不同品種發(fā)酵染菌的原因。4）不同發(fā)酵階段的染菌率：將整個發(fā)酵周期分成前期、中期和后期三個階段，分別統(tǒng)計其染菌率。有助于查找染菌的原因。5）季節(jié)染菌率：統(tǒng)計不同季節(jié)的染菌率，可以采取相應(yīng)的措施制服染菌。6）操作染菌率：統(tǒng)計操作工的染菌率，一方面可以分析染菌原因，另一方面可以考核操作工的滅菌操作技術(shù)水平。（4）染菌的處理發(fā)現(xiàn)染菌后，應(yīng)立即根據(jù)染菌的種類及生產(chǎn)菌的菌齡等具體情況分別進行處理。二噬菌體污染的防止在國內(nèi)外，發(fā)酵工業(yè)中噬菌體的危害是一個普遍的問題。對于丙酮丁醇、氨基酸、酶制劑和抗生素等發(fā)酵都有噬菌體的危害，所帶來的經(jīng)濟損失是相當(dāng)驚人的。因此，認(rèn)識并研究噬菌體的感染，戰(zhàn)勝噬菌體對發(fā)酵生產(chǎn)的危害是具有重要意義的。什么是噬菌體病毒是一類既具有化學(xué)大分子屬性，又具有生物體基本特征;既具有細(xì)胞外的感染性顆粒形式，又具有細(xì)胞內(nèi)的繁殖性基因形式的獨特生物類群。病毒以其結(jié)構(gòu)簡單一、特殊的繁殖方式以及絕對的細(xì)胞內(nèi)寄生，顯著區(qū)別干其他生物。噬菌體：宿主是細(xì)菌或真菌的病毒。噬菌體的污染源：噬菌體廣泛地存在于適合宿主菌生存的泥土、污水和空氣中。發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌的噬菌體可以從異常發(fā)酸液和工廠環(huán)境中分離出來，溶源性細(xì)菌也混雜在工廠周圍環(huán)綽的細(xì)菌中。這樣，噬菌體則極易污染發(fā)酵生產(chǎn)，導(dǎo)致發(fā)酵異常，造成嚴(yán)重?fù)p失?！獋€新的發(fā)酵工廠往往在產(chǎn)不久便出現(xiàn)噬菌體污染，造成生產(chǎn)混亂。研究認(rèn)為，當(dāng)有許多細(xì)菌存在時，相應(yīng)的噬菌體就會馬上出現(xiàn)，其濃度在自然條件下很容易增高。還有人認(rèn)為，溶源性細(xì)菌的一部分菌體細(xì)胞中噬菌體DNA在自然因素誘導(dǎo)下，與細(xì)菌染色體和其它附著處分離、增殖，演變?yōu)楦腥拘允删w。噬菌體污染與發(fā)酵異常：噬菌體污染后的情況因發(fā)酵工業(yè)的種類、污染的噬菌體特性、污染時間、感染復(fù)度(即培養(yǎng)物內(nèi)的噬菌體與細(xì)菌的比率)、培養(yǎng)基成分、發(fā)酵罐內(nèi)的物理和化學(xué)條件不同而異。即使同樣的噬菌體并不一定引起同樣的異常發(fā)酵情況。一般來說，噬菌體污染引起的異常發(fā)酵有以下幾種表現(xiàn)：(1)污染較輕，或在發(fā)酵末期污染，則使發(fā)酵過程減慢或降低發(fā)酵產(chǎn)率。也有的行業(yè)在這種情況下產(chǎn)率反而增高；(2)在細(xì)菌對數(shù)生長期污染，而且污染量大，就會造成細(xì)菌溶解，發(fā)酵終止。噬菌體污染后可以觀察到糖消耗減慢，pH異常變化，產(chǎn)氣減少，發(fā)酵液稀薄，繼之活的生