ZFNTALENCRISPRCas三種基因編輯工具課件

基因打靶的里程碑事件

——ZFN、TALEN、

CRISPR-CaS姓名：邢亞迪專業(yè)：作物遺傳育種導(dǎo)師：何光華教授基因打靶的里程碑事件

——ZFN、TALEN、

CRISPR1

任何對(duì)基因進(jìn)行特異性修飾的工具都是由兩個(gè)部分組成：1DNA特異性識(shí)別結(jié)合域2核酸內(nèi)切酶活性區(qū)域ZFN

=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶TALEN

=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶CAS9=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶任何對(duì)基因進(jìn)行特異性修飾的工具都是由兩個(gè)部分組成2ZFN原理ZFN=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶DNA識(shí)別域：由一系列Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成（一般3~4個(gè)），每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基。核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時(shí)切割雙鏈DNA。ZFN原理ZFN=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶3TALEN=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶DNA識(shí)別域：由一系列TAL蛋白串聯(lián)組成（一般20個(gè)左右），每個(gè)TAL蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)對(duì)應(yīng)的堿基。核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時(shí)切割雙鏈DNATALEN=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶4TALEN的定義及原理

TALE（Transcriptionactivator-likeeffectors）:

一種源于植物致病菌的靶向基因操作技術(shù)。

科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，來(lái)自植物細(xì)菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系,一個(gè)模塊單元識(shí)別一個(gè)堿基，簡(jiǎn)單且特異性極好。

通過(guò)組合各類模塊，可對(duì)任意核苷酸序列進(jìn)行靶向特異性敲除或內(nèi)源基因的表達(dá)調(diào)控。

目前已在人、大鼠、小鼠、豬、羊、斑馬魚(yú)、擬南芥及酵母等多類物種中得到成功應(yīng)用。TALEN的定義及原理TALE（Transcript5全長(zhǎng)為34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異性識(shí)別核苷酸堿基。NG可以識(shí)別THD可以識(shí)別CNI可以識(shí)別ANN可以識(shí)別G或A通過(guò)這種特異性識(shí)別，將多個(gè)Tal蛋白組裝在一起，再加上FokI核酸內(nèi)切酶，就可以構(gòu)成可以識(shí)別目的片段的Tale蛋白。全長(zhǎng)為34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異6TALEN的特異性打靶的原理：一對(duì)可以特異性識(shí)別靶基因的TALE，定位到需要編輯的基因組區(qū)域；然后非特異性核酸內(nèi)切酶Fok1切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）；再通過(guò)DNA的自我修復(fù)，引起堿基的缺失或突變，從而引起基因突變。Fok1只有在形成二聚體的時(shí)候才有內(nèi)切酶活性。TALEN的特異性打靶的原理：7TALEN介導(dǎo)的基因敲除TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，表達(dá)兩個(gè)融合蛋白，分別與靶位點(diǎn)特異結(jié)合，由于兩個(gè)TALEN融合蛋白中的FokI臨近，形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，在兩個(gè)靶位點(diǎn)之間剪切DNA。TALEN介導(dǎo)的基因敲除8TALEN介導(dǎo)的同源重組形成DSB時(shí)，同源重組可將需要敲入的序列組合如基因組。TALEN介導(dǎo)的同源重組形成DSB時(shí)，同源重組可將9TALEN的技術(shù)特點(diǎn)任意敲除，無(wú)基因序列、細(xì)胞、物種限制，永久失活成功率高，在保證轉(zhuǎn)染效率的前提下，有效性可達(dá)95%以上打靶效率高,可完全替代RNAi技術(shù)脫靶率低，尚未發(fā)現(xiàn)明顯脫靶效應(yīng)周期短，只需按照常規(guī)構(gòu)建質(zhì)粒方法構(gòu)建Talen質(zhì)粒TALEN的技術(shù)特點(diǎn)任意敲除，無(wú)基因序列、細(xì)胞、物種限制，永10ZFNTALENCRISPRCas三種基因編輯工具課件11CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR序列：

細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences）。Cas：

CRISPR相關(guān)基因（CRISPR-associatedgenes）CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌的免疫系統(tǒng)：CRISPR序列能特異性識(shí)別外源核酸序列；Cas蛋白的非特異性核酸內(nèi)切酶功能將外源核酸切斷。CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR序列：12兩個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)表達(dá)Cas9蛋白，一個(gè)表達(dá)sgRNA兩個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)表達(dá)Cas9蛋白，一個(gè)表達(dá)sgRNA13CRISPR-Cas9=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶

DNA識(shí)別域：向?qū)NA

核酸內(nèi)切酶：Cas9核酸內(nèi)切酶引導(dǎo)RNA由兩部分組成：CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA（transactingCRISPRRNA,tracrRNA)crRNA一端與雙鏈核苷酸互補(bǔ)結(jié)合，另一端與tracrRNA互補(bǔ)結(jié)合，形成向?qū)NA。CRISPR-Cas9=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶14PAM：NGGCas9蛋白與向?qū)NA結(jié)合、組裝的動(dòng)作是這套位點(diǎn)特異性的基因組修飾過(guò)程里的限速步驟。PAM序列為５’－ＮＧＧ－３’

靶序列后面必須為ＮＧＧ才能被向?qū)В遥危磷R(shí)別。PAM：NGG15CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求：PAM序列

PAM序列只有３個(gè)堿基：ＮＧＧ。

靶序列后面必須為ＮＧＧ才能被向?qū)В遥危磷R(shí)別。

在人類基因組中平均每８?jìng)€(gè)堿基就可以出現(xiàn)一個(gè)ＮＧＧCRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求：PAM序列

PAM序16最近有研究發(fā)現(xiàn)，crRNA和tracrRNA可以被“改裝”成一個(gè)向?qū)NA（single-guideRNA,sgRNA）。這個(gè)sgRNA足以幫助Cas9內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割。而且可以將sgRNA和Cas9裝在同一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒中表達(dá)。

這種RNA介導(dǎo)的Cas9酶切作用能夠在多種類型的細(xì)胞和生物體內(nèi)正常地行使功能，在完整基因組上的特定位點(diǎn)完成切割反應(yīng)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，crRNA和tracrRNA可以被“改裝”17CRISPR-Cas系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)ZNF成本高昂，效率低。Cas9的效率是TALEN的5倍。sgRNA全長(zhǎng)不超過(guò)100bp，構(gòu)建更容易CRISPR-Cas系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)ZNF成本高昂，效率低。18基因打靶的里程碑事件

——ZFN、TALEN、

CRISPR-CaS姓名：邢亞迪專業(yè)：作物遺傳育種導(dǎo)師：何光華教授基因打靶的里程碑事件

——ZFN、TALEN、

CRISPR19

任何對(duì)基因進(jìn)行特異性修飾的工具都是由兩個(gè)部分組成：1DNA特異性識(shí)別結(jié)合域2核酸內(nèi)切酶活性區(qū)域ZFN

=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶TALEN

=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶CAS9=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶任何對(duì)基因進(jìn)行特異性修飾的工具都是由兩個(gè)部分組成20ZFN原理ZFN=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶DNA識(shí)別域：由一系列Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成（一般3~4個(gè)），每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基。核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時(shí)切割雙鏈DNA。ZFN原理ZFN=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶21TALEN=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶DNA識(shí)別域：由一系列TAL蛋白串聯(lián)組成（一般20個(gè)左右），每個(gè)TAL蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)對(duì)應(yīng)的堿基。核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時(shí)切割雙鏈DNATALEN=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶22TALEN的定義及原理

TALE（Transcriptionactivator-likeeffectors）:

一種源于植物致病菌的靶向基因操作技術(shù)。

科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，來(lái)自植物細(xì)菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系,一個(gè)模塊單元識(shí)別一個(gè)堿基，簡(jiǎn)單且特異性極好。

通過(guò)組合各類模塊，可對(duì)任意核苷酸序列進(jìn)行靶向特異性敲除或內(nèi)源基因的表達(dá)調(diào)控。

目前已在人、大鼠、小鼠、豬、羊、斑馬魚(yú)、擬南芥及酵母等多類物種中得到成功應(yīng)用。TALEN的定義及原理TALE（Transcript23全長(zhǎng)為34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異性識(shí)別核苷酸堿基。NG可以識(shí)別THD可以識(shí)別CNI可以識(shí)別ANN可以識(shí)別G或A通過(guò)這種特異性識(shí)別，將多個(gè)Tal蛋白組裝在一起，再加上FokI核酸內(nèi)切酶，就可以構(gòu)成可以識(shí)別目的片段的Tale蛋白。全長(zhǎng)為34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異24TALEN的特異性打靶的原理：一對(duì)可以特異性識(shí)別靶基因的TALE，定位到需要編輯的基因組區(qū)域；然后非特異性核酸內(nèi)切酶Fok1切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）；再通過(guò)DNA的自我修復(fù)，引起堿基的缺失或突變，從而引起基因突變。Fok1只有在形成二聚體的時(shí)候才有內(nèi)切酶活性。TALEN的特異性打靶的原理：25TALEN介導(dǎo)的基因敲除TALEN質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，表達(dá)兩個(gè)融合蛋白，分別與靶位點(diǎn)特異結(jié)合，由于兩個(gè)TALEN融合蛋白中的FokI臨近，形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，在兩個(gè)靶位點(diǎn)之間剪切DNA。TALEN介導(dǎo)的基因敲除26TALEN介導(dǎo)的同源重組形成DSB時(shí)，同源重組可將需要敲入的序列組合如基因組。TALEN介導(dǎo)的同源重組形成DSB時(shí)，同源重組可將27TALEN的技術(shù)特點(diǎn)任意敲除，無(wú)基因序列、細(xì)胞、物種限制，永久失活成功率高，在保證轉(zhuǎn)染效率的前提下，有效性可達(dá)95%以上打靶效率高,可完全替代RNAi技術(shù)脫靶率低，尚未發(fā)現(xiàn)明顯脫靶效應(yīng)周期短，只需按照常規(guī)構(gòu)建質(zhì)粒方法構(gòu)建Talen質(zhì)粒TALEN的技術(shù)特點(diǎn)任意敲除，無(wú)基因序列、細(xì)胞、物種限制，永28ZFNTALENCRISPRCas三種基因編輯工具課件29CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR序列：

細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences）。Cas：

CRISPR相關(guān)基因（CRISPR-associatedgenes）CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌的免疫系統(tǒng)：CRISPR序列能特異性識(shí)別外源核酸序列；Cas蛋白的非特異性核酸內(nèi)切酶功能將外源核酸切斷。CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR序列：30兩個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)表達(dá)Cas9蛋白，一個(gè)表達(dá)sgRNA兩個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)表達(dá)Cas9蛋白，一個(gè)表達(dá)sgRNA31CRISPR-Cas9=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶

DNA識(shí)別域：向?qū)NA

核酸內(nèi)切酶：Cas9核酸內(nèi)切酶引導(dǎo)RNA由兩部分組成：CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA（transactingCRISPRRNA,tracrRNA)crRNA一端與雙鏈核苷酸互補(bǔ)結(jié)合，另一端與tracrRNA互補(bǔ)結(jié)合，形成向?qū)NA。CRISPR-Cas9=DNA識(shí)別域+核酸內(nèi)切酶32PAM：NGGCas9蛋白與向?qū)NA結(jié)合、組裝的動(dòng)作是這套位點(diǎn)特異性的基因組修飾過(guò)程里的限速步驟。PAM序列為５’－ＮＧＧ－３’

靶序列后面必須為ＮＧＧ才能被向?qū)В遥危磷R(shí)別。PAM：NGG33CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求：PAM序列

PAM序列只有３個(gè)堿基：ＮＧＧ。

靶序列后面必須為ＮＧＧ才能被向?qū)В遥危磷R(shí)別。

在人類基因組中平均每８?jìng)€(gè)堿基就可以出現(xiàn)一個(gè)ＮＧＧCRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求：PAM序列

PAM序34最近有研究發(fā)現(xiàn)，crRNA和tracrRNA可以被“改裝”成一個(gè)向?qū)NA（single-