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文檔簡介
學習目標1、掌握HPLC的分離原理、高效液相色譜分析的樣品處理方法、分離方式的選擇和定量分析方法及HPLC實驗技術。2、了解高效液相色譜儀的構造、儀器各部分的功用及儀器的維護和保養(yǎng),熟悉其工作過程及常用固定相及流動相的特性及選用原則。HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜分析法閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系學習目標HighPerformanceLiquid一、液相色譜分離原理
特指一種用液體為流動相的色譜分離分析方法。液體待檢測物被注入色譜柱,通過流動相推動,在固定相中移動,由于被測物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同,不同的物質(zhì)以不同的順序離開色譜柱,通過檢測器得到不同的峰信號,最后通過分析比對這些信號來判斷待側物所含有的物質(zhì)。第一節(jié)高效液相色譜分離的原理1、液相色譜分析法閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系一、液相色譜分離原理特指一種用液體為流動相的2、液相色譜法分類1)液-液分配色譜法(LLC)2)液-固吸附色譜法(LSC)3)離子交換色譜法(IC)4)空間排阻(凝膠)色譜法閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系2、液相色譜法分類1)液-液分配色譜法(LLC)閩北職業(yè)技術1)液-液分配色譜法(LLC)分離機制:利用組分在兩相中溶解度的差異實現(xiàn)分離。固定相:載體+固定液(物理或機械涂漬法)。缺點:系統(tǒng)內(nèi)部壓力大,易流失,不實用。
極性固定液→NLLC,非極性固定液→RLLC正相色譜——固定液極性>流動相極性(NLLC),極性小的組分先出柱,極性大的組分后出柱,適于分離極性組分。反相色譜——固定液極性<流動相極性(RLLC),極性大的組分先出柱,極性小的組分后出柱,適于分離非極性組分。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系1)液-液分配色譜法(LLC)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程2)液-固吸附色譜法(LSC)流動相為液體,固定相為固體吸附劑。分離機制:利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異實現(xiàn)分離。3)離子交換色譜法(IC)分離機制:離子交換樹脂上可交換的離子基團與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換,依據(jù)其對離子交換樹脂上的固定離子基團親和力的不同而將溶質(zhì)分子分離。離子對試劑:烷基磺酸鈉→分析堿;四丁基季胺鹽→分析酸4)空間排阻(凝膠)色譜法以凝膠為固定相的色譜法。分離機制:溶質(zhì)自身體積大小不同,透過凝膠的速率不等。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系2)液-固吸附色譜法(LSC)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別,它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相,適于分析高沸點不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。
高效液相色譜也叫高壓液相色譜(highpressureliquidchromatography)、高速液相色譜(highspeedliquidchromatography)、高分離度液相色譜(highresolutionliquidchromatography)等。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,但會引起高阻力,需用高壓輸送流動相,故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。二、高效液相色譜分析法的特點閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)1、高效液相色譜的特點高壓——壓力可達150~300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。高速——流速為0.1~10.0mL/min。高效——塔板數(shù)可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系1、高效液相色譜的特點閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系2、HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點速度快——通常分析一個樣品在15~30min,有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng,熒光和電化學檢測器可達0.1pg。色譜柱可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少,容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞,可以收集單一組分或做制備。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系2、HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點閩北職業(yè)技術學院食品三、HPLC的實際應用未知物質(zhì)的鑒定與確認多成分的同時定量混合物的精制和分離測定物理化學常數(shù)HPLC應用非常廣泛,幾乎遍及定量定性分析的各個領域。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系三、HPLC的實際應用未知物質(zhì)的鑒定與確認HPLC應用非常廣第二節(jié)高效液相色譜儀的基本構造閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系第二節(jié)高效液相色譜儀的基本構造閩北職業(yè)技術學院高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成,其整體組成類似于氣相色譜,但是針對其流動相為液體的特點作出很多調(diào)整。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系高壓輸液系統(tǒng)高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶一、高壓輸液系統(tǒng)1、貯液裝置2、高壓泵(輸液泵)3、過濾器4、洗脫裝置5、阻尼器閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系一、高壓輸液系統(tǒng)1、貯液裝置閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系馬達往復式拉動密封溶劑球閥脈動阻尼器到色譜柱機械往復柱塞泵示意圖閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系馬達往復式拉動密封溶劑球閥脈動阻到色譜柱機械往復柱塞泵示意圖1、貯液裝置----提供足夠數(shù)量、符合要求的流動相,以完成分離分析任務。流動相須經(jīng)過脫氣處理(加熱、減壓、超聲波、惰性氣體置換)。脫氣指驅(qū)除溶解在溶劑當中的氣體。(1)脫氣是為了防止流動相從高壓柱內(nèi)流出時,釋放出氣泡。這些氣泡進入檢測器后會使噪聲劇增,甚至不能正常檢測。(2)溶解氧會與某些流動相與固定相作用,破壞它們的正常功能。對水及極性溶劑的脫氣尤為重要,因為氧在其中的溶解度較大。2、高壓泵----輸出流動相要求較高的輸出壓力且壓力平穩(wěn)、流速恒定、流量可調(diào)。當高壓流動相通過分離柱時,可降低樣品在柱中的擴散效應,可加快其在柱中的移動速度,這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。恒壓泵:流量精度不穩(wěn)恒流泵:常用閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系1、貯液裝置----提供足夠數(shù)量、符合要求的流動相,以完成分3、過濾器----對流動相進行過濾,以消除微小的機械雜質(zhì)。4、洗脫裝置梯度儀,可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變,包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值,或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個基團的差別或是同分異構體)都能獲得有效分離。低壓梯度洗脫高壓梯度洗脫5、阻尼器----減少流動相流量的波動,亦稱緩沖器。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系3、過濾器----對流動相進行過濾,以消除微小的機械雜質(zhì)。二、進樣系統(tǒng)1、注射器(隔膜)進樣微量注射器刺穿高分子有機硅膠墊→進樣室由于GC系統(tǒng)壓力較小,可以直接使用;HPLC系統(tǒng)壓力太大,必須停泵進樣(早期)。2、六通閥進樣進樣準確、方便,進樣過程不必停泵。3、自動進樣器智能軟件控制,自動操作。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系二、進樣系統(tǒng)1、注射器(隔膜)進樣閩北職業(yè)技術學院食品與生物該系統(tǒng)包括色譜柱(柱管、固定相填料、密封墊)、連接管和恒溫器等。1、色譜柱一般長度為15~50cm(需要兩根連用時,可在二者之間加一連接管),內(nèi)徑為2~5mm,由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,柱內(nèi)裝有直徑為5~10μm粒度的固定相柱效的理論值達5000-16000/m。2、色譜柱恒溫裝置水浴式、電熱式、恒溫箱式三、分離系統(tǒng)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系該系統(tǒng)包括色譜柱(柱管、固定相填料、密封墊高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。1、紫外檢測器(UVD)該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。
其特點:1)使用面廣(如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);2)靈敏度高(檢測下限為10-10g/ml);3)線性范圍寬;4)對溫度和流速變化不敏感;5)可檢測梯度溶液洗脫的樣品。四、檢測系統(tǒng)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折2、示差折光檢測器(RID)凡具有與流動相折光率不同的樣品組分,均可使用示差折光檢測器檢測。糖類化合物的檢測常使用此檢測系統(tǒng)。
特點:通用性強、操作簡單,但靈敏度低(檢測下限為10-7g/mL),流動相的變化會引起折光率的變化,因此,它既不適用于痕量分析,也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。3、熒光檢測器(FD)凡具有熒光的物質(zhì),在一定條件下,其發(fā)射光的熒光強度與物質(zhì)的濃度成正比。因此,這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物(如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等)的測定。
特點:其靈敏度很高(檢測下限為10-12~10-14g/mL),痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系2、示差折光檢測器(RID)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程五、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)又稱工作站(專家系統(tǒng)),該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作,使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系五、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)又稱工作站(專家系統(tǒng)),該系一、溶劑萃取第三節(jié)高效液相色譜分析的樣品處理方法二、微波溶劑萃取三、衍生化技術閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系一、溶劑萃取第三節(jié)高效液相色譜分析的樣品處理方法二、微第四節(jié)固定相和流動相及分離方法的選擇極性固定相------硅膠、氧化鋁等非極性固定相-----活性炭、分子篩等固定相粒徑<10μm。2、液-液分配色譜固定相將固定液涂漬在(擔體)表面,形成液-液色譜的固定相。固定液與流動相不能互溶,一般是有機液體,如聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇4000等。1、液-固吸附色譜固定相一、液相色譜固定相閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系第四節(jié)固定相和流動相及分離方法的選擇極性固定相-3、離子交換色譜固定相4、凝膠色譜固定相(1)薄膜型離子交換樹脂(2)離子交換鍵合固定相具有立體多孔網(wǎng)狀結構的多聚體。分為軟質(zhì)、半硬質(zhì)、硬質(zhì)三種。軟質(zhì)---葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠;半硬質(zhì)---交聯(lián)聚苯乙烯凝膠;硬質(zhì)---多孔硅膠、多孔玻璃球等。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系3、離子交換色譜固定相4、凝膠色譜固定相(1)薄膜型離子交換二、液相色譜流動相(洗脫劑)液相色譜流動相(洗脫劑)是指各種極性、非極性液態(tài)溶劑。理想的溶劑應有下列特性:1、所選用的流動相溶劑要有一定的化學穩(wěn)定性,不與固定相和樣品組分起反應,其純度和化學特性必須滿足色譜過程的穩(wěn)定性和重復性的要求。2、溶劑應當不干擾檢測器的工作,溶劑應與檢測器匹配,選擇不影響檢測器正常工作應選擇在測定波長范圍內(nèi)無吸收的流動相。3、在制備分離中,溶劑應當易于除去,不干擾對分離組分的回收。4、溶劑的粘度要小,保證合適的柱壓降。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系二、液相色譜流動相(洗脫劑)液相色譜流動相(5、從實用角度考慮,溶劑應當價格低廉,容易購得,使用安全,純度要高。
氣相色譜的流動相不參加色譜分離過程,而液相色譜的流動相不僅參加分離過程,而且起著重要的調(diào)節(jié)作用,是分離分析的一個極為重要的因素。流動相極性大小順序如下:水、甲酰胺、乙腈、乙醇、丙醇……烷烴閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系5、從實用角度考慮,溶劑應當價格低廉,容易購得,使用安全,純二、HPLC分離方法的選擇閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系二、HPLC分離方法的選擇閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系第六節(jié)高效液相色譜儀的維護與保養(yǎng)一、高效液相色譜儀的日常維護日常工作中,液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要1、注意不要讓空氣進入輸液系統(tǒng)和高壓泵中;2、儲液器內(nèi)的溶液如長時間未用應清洗儲液器并更換溶液,每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈,防止無機鹽析出或沉積;3、樣品的前處理也很重要,任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì),完全溶解,盡量減少對色譜柱的污染,以延長色譜柱的使用壽命;4、同時避免注射過濃的樣品溶液,以免殘留液在進樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞;色譜柱作好標記,用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系第六節(jié)高效液相色譜儀的維護與保養(yǎng)一、高效液相色三、常見故障判斷與排除方法故障1流動相內(nèi)有氣泡無法清除原因-----過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi),過濾器內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖,形成菌團,阻塞了過濾器,緩沖液難以流暢地通過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進入流動相。處理過濾器的方法:將其浸泡于5%硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12~36小時,輕輕震蕩幾次,再將過濾器用純水清洗幾次,即可將過濾器清洗干凈。二、色譜柱的日常維護與保養(yǎng)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系三、常見故障判斷與排除方法故障1流動相內(nèi)有氣泡無法清除二、故障2柱壓高原因(1)緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi);(2)樣品污染沉積。處理對于第一種情況先用40~50℃的純水,低速正向沖洗柱子,待柱壓逐漸下降后,相應提高流速沖洗,柱壓大幅度下降后,用常溫純水沖洗,之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對于第二種情況,用純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再用換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇正向沖洗柱子30分鐘以上。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系故障2柱壓高閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系故障3既無壓力指示,又無液體流過。
原因(1)泵密封墊圈磨損(2)大量氣泡進入泵體。
處理對于第一種情況,更換密封墊圈;對于第二種情況,在泵作用的同時,用一個50mL的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系故障3既無壓力指示,又無液體流過。
閩北職業(yè)技術學院食品與故障4壓力波動大,流量不穩(wěn)定。原因----系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。
處理工作中注意觀察流動相的量,保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底,避免吸入空氣,流動相要充分。如為單向閥和閥座之間夾有異物,拆下單向閥,放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系故障4壓力波動大,流量不穩(wěn)定。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工故障5出峰不佳,峰分叉。原因(1)色譜柱被污染;(2)柱頭填料塌陷。
處理對于第一種情況,先用純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳,則考慮第二種情況。對于第二種情況,擰開柱頭,檢查柱填料是否硬結或塌陷。去除硬結部分(污染的填料),裝入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊,再填平,滴甲醇,再壓緊反復幾次,直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈,擦凈柱外壁的填料,擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30分鐘以上。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系故障5出峰不佳,峰分叉。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系故障6峰面積重復性不佳。原因(1)進樣閥漏液(2)加樣針不到位。處理對于第一種情況更換進樣閥墊圈;對于第二種情況保證加樣針插到底,注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài),以保證進樣量的準確。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系故障6峰面積重復性不佳。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系第七節(jié)液相色譜法的發(fā)展史1960年代,由于氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性,為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì),氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀,開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱,提高色譜柱的塔板數(shù),以高壓驅(qū)動流動相,使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內(nèi)完成。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系第七節(jié)液相色譜法的發(fā)展史1960年代1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實踐》一書,標志著高效液相色譜法(HPLC)正式建立。在此后的時間里,高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段,在有機化學、生物化學、醫(yī)學、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術、數(shù)據(jù)處理技術以及色譜理論的發(fā)展。
閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實踐》一書,標志著1960年代前,使用的填充粒大于100μm,提高柱效面臨著困境,后來的研究人員便采用微粒固定相來突破著一瓶頸??瓶颂m、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相,這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼,實現(xiàn)了高速傳質(zhì),為高效液相色譜技術的發(fā)展奠定了穩(wěn)固的基礎。隨著填料粒徑的降低,更高的柱效也得以實現(xiàn)。1960年代研制出氣動放大泵、注射泵及低流量往復式柱塞泵,但后者的脈沖信號很大,難以滿足高效液相色譜的要求。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系1960年代前,使用的填充粒大于100μm,提高柱效面臨著困1970年代,往復式雙柱塞恒流泵,解決了這一問題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠,平均粒徑只有7μm,具有極好的柱效,并逐漸取代了無定形微粒硅膠。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩(wěn)定性大為提高,多次使用成為可能。1970年后,適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點。1980年后,改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題,人們越來越認識到改變流動相的組成事提高選擇性的關鍵。
閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系1970年代,往復式雙柱塞恒流泵,解決了這一問題。1970年學習目標1、掌握HPLC的分離原理、高效液相色譜分析的樣品處理方法、分離方式的選擇和定量分析方法及HPLC實驗技術。2、了解高效液相色譜儀的構造、儀器各部分的功用及儀器的維護和保養(yǎng),熟悉其工作過程及常用固定相及流動相的特性及選用原則。HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜分析法閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系學習目標HighPerformanceLiquid一、液相色譜分離原理
特指一種用液體為流動相的色譜分離分析方法。液體待檢測物被注入色譜柱,通過流動相推動,在固定相中移動,由于被測物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同,不同的物質(zhì)以不同的順序離開色譜柱,通過檢測器得到不同的峰信號,最后通過分析比對這些信號來判斷待側物所含有的物質(zhì)。第一節(jié)高效液相色譜分離的原理1、液相色譜分析法閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系一、液相色譜分離原理特指一種用液體為流動相的2、液相色譜法分類1)液-液分配色譜法(LLC)2)液-固吸附色譜法(LSC)3)離子交換色譜法(IC)4)空間排阻(凝膠)色譜法閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系2、液相色譜法分類1)液-液分配色譜法(LLC)閩北職業(yè)技術1)液-液分配色譜法(LLC)分離機制:利用組分在兩相中溶解度的差異實現(xiàn)分離。固定相:載體+固定液(物理或機械涂漬法)。缺點:系統(tǒng)內(nèi)部壓力大,易流失,不實用。
極性固定液→NLLC,非極性固定液→RLLC正相色譜——固定液極性>流動相極性(NLLC),極性小的組分先出柱,極性大的組分后出柱,適于分離極性組分。反相色譜——固定液極性<流動相極性(RLLC),極性大的組分先出柱,極性小的組分后出柱,適于分離非極性組分。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系1)液-液分配色譜法(LLC)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程2)液-固吸附色譜法(LSC)流動相為液體,固定相為固體吸附劑。分離機制:利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異實現(xiàn)分離。3)離子交換色譜法(IC)分離機制:離子交換樹脂上可交換的離子基團與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換,依據(jù)其對離子交換樹脂上的固定離子基團親和力的不同而將溶質(zhì)分子分離。離子對試劑:烷基磺酸鈉→分析堿;四丁基季胺鹽→分析酸4)空間排阻(凝膠)色譜法以凝膠為固定相的色譜法。分離機制:溶質(zhì)自身體積大小不同,透過凝膠的速率不等。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系2)液-固吸附色譜法(LSC)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別,它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相,適于分析高沸點不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。
高效液相色譜也叫高壓液相色譜(highpressureliquidchromatography)、高速液相色譜(highspeedliquidchromatography)、高分離度液相色譜(highresolutionliquidchromatography)等。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,但會引起高阻力,需用高壓輸送流動相,故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。二、高效液相色譜分析法的特點閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)1、高效液相色譜的特點高壓——壓力可達150~300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。高速——流速為0.1~10.0mL/min。高效——塔板數(shù)可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系1、高效液相色譜的特點閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系2、HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點速度快——通常分析一個樣品在15~30min,有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng,熒光和電化學檢測器可達0.1pg。色譜柱可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少,容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞,可以收集單一組分或做制備。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系2、HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點閩北職業(yè)技術學院食品三、HPLC的實際應用未知物質(zhì)的鑒定與確認多成分的同時定量混合物的精制和分離測定物理化學常數(shù)HPLC應用非常廣泛,幾乎遍及定量定性分析的各個領域。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系三、HPLC的實際應用未知物質(zhì)的鑒定與確認HPLC應用非常廣第二節(jié)高效液相色譜儀的基本構造閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系第二節(jié)高效液相色譜儀的基本構造閩北職業(yè)技術學院高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成,其整體組成類似于氣相色譜,但是針對其流動相為液體的特點作出很多調(diào)整。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系高壓輸液系統(tǒng)高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶一、高壓輸液系統(tǒng)1、貯液裝置2、高壓泵(輸液泵)3、過濾器4、洗脫裝置5、阻尼器閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系一、高壓輸液系統(tǒng)1、貯液裝置閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系馬達往復式拉動密封溶劑球閥脈動阻尼器到色譜柱機械往復柱塞泵示意圖閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系馬達往復式拉動密封溶劑球閥脈動阻到色譜柱機械往復柱塞泵示意圖1、貯液裝置----提供足夠數(shù)量、符合要求的流動相,以完成分離分析任務。流動相須經(jīng)過脫氣處理(加熱、減壓、超聲波、惰性氣體置換)。脫氣指驅(qū)除溶解在溶劑當中的氣體。(1)脫氣是為了防止流動相從高壓柱內(nèi)流出時,釋放出氣泡。這些氣泡進入檢測器后會使噪聲劇增,甚至不能正常檢測。(2)溶解氧會與某些流動相與固定相作用,破壞它們的正常功能。對水及極性溶劑的脫氣尤為重要,因為氧在其中的溶解度較大。2、高壓泵----輸出流動相要求較高的輸出壓力且壓力平穩(wěn)、流速恒定、流量可調(diào)。當高壓流動相通過分離柱時,可降低樣品在柱中的擴散效應,可加快其在柱中的移動速度,這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。恒壓泵:流量精度不穩(wěn)恒流泵:常用閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系1、貯液裝置----提供足夠數(shù)量、符合要求的流動相,以完成分3、過濾器----對流動相進行過濾,以消除微小的機械雜質(zhì)。4、洗脫裝置梯度儀,可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變,包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值,或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個基團的差別或是同分異構體)都能獲得有效分離。低壓梯度洗脫高壓梯度洗脫5、阻尼器----減少流動相流量的波動,亦稱緩沖器。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系3、過濾器----對流動相進行過濾,以消除微小的機械雜質(zhì)。二、進樣系統(tǒng)1、注射器(隔膜)進樣微量注射器刺穿高分子有機硅膠墊→進樣室由于GC系統(tǒng)壓力較小,可以直接使用;HPLC系統(tǒng)壓力太大,必須停泵進樣(早期)。2、六通閥進樣進樣準確、方便,進樣過程不必停泵。3、自動進樣器智能軟件控制,自動操作。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系二、進樣系統(tǒng)1、注射器(隔膜)進樣閩北職業(yè)技術學院食品與生物該系統(tǒng)包括色譜柱(柱管、固定相填料、密封墊)、連接管和恒溫器等。1、色譜柱一般長度為15~50cm(需要兩根連用時,可在二者之間加一連接管),內(nèi)徑為2~5mm,由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,柱內(nèi)裝有直徑為5~10μm粒度的固定相柱效的理論值達5000-16000/m。2、色譜柱恒溫裝置水浴式、電熱式、恒溫箱式三、分離系統(tǒng)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系該系統(tǒng)包括色譜柱(柱管、固定相填料、密封墊高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。1、紫外檢測器(UVD)該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。
其特點:1)使用面廣(如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);2)靈敏度高(檢測下限為10-10g/ml);3)線性范圍寬;4)對溫度和流速變化不敏感;5)可檢測梯度溶液洗脫的樣品。四、檢測系統(tǒng)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折2、示差折光檢測器(RID)凡具有與流動相折光率不同的樣品組分,均可使用示差折光檢測器檢測。糖類化合物的檢測常使用此檢測系統(tǒng)。
特點:通用性強、操作簡單,但靈敏度低(檢測下限為10-7g/mL),流動相的變化會引起折光率的變化,因此,它既不適用于痕量分析,也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。3、熒光檢測器(FD)凡具有熒光的物質(zhì),在一定條件下,其發(fā)射光的熒光強度與物質(zhì)的濃度成正比。因此,這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物(如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等)的測定。
特點:其靈敏度很高(檢測下限為10-12~10-14g/mL),痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系2、示差折光檢測器(RID)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程五、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)又稱工作站(專家系統(tǒng)),該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作,使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系五、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)又稱工作站(專家系統(tǒng)),該系一、溶劑萃取第三節(jié)高效液相色譜分析的樣品處理方法二、微波溶劑萃取三、衍生化技術閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系一、溶劑萃取第三節(jié)高效液相色譜分析的樣品處理方法二、微第四節(jié)固定相和流動相及分離方法的選擇極性固定相------硅膠、氧化鋁等非極性固定相-----活性炭、分子篩等固定相粒徑<10μm。2、液-液分配色譜固定相將固定液涂漬在(擔體)表面,形成液-液色譜的固定相。固定液與流動相不能互溶,一般是有機液體,如聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇4000等。1、液-固吸附色譜固定相一、液相色譜固定相閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系第四節(jié)固定相和流動相及分離方法的選擇極性固定相-3、離子交換色譜固定相4、凝膠色譜固定相(1)薄膜型離子交換樹脂(2)離子交換鍵合固定相具有立體多孔網(wǎng)狀結構的多聚體。分為軟質(zhì)、半硬質(zhì)、硬質(zhì)三種。軟質(zhì)---葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠;半硬質(zhì)---交聯(lián)聚苯乙烯凝膠;硬質(zhì)---多孔硅膠、多孔玻璃球等。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系3、離子交換色譜固定相4、凝膠色譜固定相(1)薄膜型離子交換二、液相色譜流動相(洗脫劑)液相色譜流動相(洗脫劑)是指各種極性、非極性液態(tài)溶劑。理想的溶劑應有下列特性:1、所選用的流動相溶劑要有一定的化學穩(wěn)定性,不與固定相和樣品組分起反應,其純度和化學特性必須滿足色譜過程的穩(wěn)定性和重復性的要求。2、溶劑應當不干擾檢測器的工作,溶劑應與檢測器匹配,選擇不影響檢測器正常工作應選擇在測定波長范圍內(nèi)無吸收的流動相。3、在制備分離中,溶劑應當易于除去,不干擾對分離組分的回收。4、溶劑的粘度要小,保證合適的柱壓降。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系二、液相色譜流動相(洗脫劑)液相色譜流動相(5、從實用角度考慮,溶劑應當價格低廉,容易購得,使用安全,純度要高。
氣相色譜的流動相不參加色譜分離過程,而液相色譜的流動相不僅參加分離過程,而且起著重要的調(diào)節(jié)作用,是分離分析的一個極為重要的因素。流動相極性大小順序如下:水、甲酰胺、乙腈、乙醇、丙醇……烷烴閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系5、從實用角度考慮,溶劑應當價格低廉,容易購得,使用安全,純二、HPLC分離方法的選擇閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系二、HPLC分離方法的選擇閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系第六節(jié)高效液相色譜儀的維護與保養(yǎng)一、高效液相色譜儀的日常維護日常工作中,液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要1、注意不要讓空氣進入輸液系統(tǒng)和高壓泵中;2、儲液器內(nèi)的溶液如長時間未用應清洗儲液器并更換溶液,每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈,防止無機鹽析出或沉積;3、樣品的前處理也很重要,任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì),完全溶解,盡量減少對色譜柱的污染,以延長色譜柱的使用壽命;4、同時避免注射過濃的樣品溶液,以免殘留液在進樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞;色譜柱作好標記,用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系第六節(jié)高效液相色譜儀的維護與保養(yǎng)一、高效液相色三、常見故障判斷與排除方法故障1流動相內(nèi)有氣泡無法清除原因-----過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi),過濾器內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖,形成菌團,阻塞了過濾器,緩沖液難以流暢地通過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進入流動相。處理過濾器的方法:將其浸泡于5%硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12~36小時,輕輕震蕩幾次,再將過濾器用純水清洗幾次,即可將過濾器清洗干凈。二、色譜柱的日常維護與保養(yǎng)閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系三、常見故障判斷與排除方法故障1流動相內(nèi)有氣泡無法清除二、故障2柱壓高原因(1)緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi);(2)樣品污染沉積。處理對于第一種情況先用40~50℃的純水,低速正向沖洗柱子,待柱壓逐漸下降后,相應提高流速沖洗,柱壓大幅度下降后,用常溫純水沖洗,之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對于第二種情況,用純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),再用換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇正向沖洗柱子30分鐘以上。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系故障2柱壓高閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系故障3既無壓力指示,又無液體流過。
原因(1)泵密封墊圈磨損(2)大量氣泡進入泵體。
處理對于第一種情況,更換密封墊圈;對于第二種情況,在泵作用的同時,用一個50mL的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。閩北職業(yè)技術學院食品與生物工程系故障3既無壓力指示,又無液體流過。
閩北職業(yè)技術學院食品與故障4壓力波動大,流量不穩(wěn)定。原因----系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。
處理工作中注意觀察流動相
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