抗體工程制藥課件

19.1概述19.2鼠源單克隆抗體的制備19.3基因工程抗體第十九章抗體藥物制備工藝19.1概述第十九章抗體藥物制備工藝19.1概述19.1.1抗體與抗原抗體（antibody，Ab）：指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白IgAb化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念生物學(xué)功能上的概念19.1概述19.1.1抗體與抗原抗體（anti抗體的發(fā)現(xiàn)德國學(xué)者Behring和日本學(xué)者北里于1890年在Koch研究所應(yīng)用白喉外毒素給動物免疫，發(fā)現(xiàn)在其血清中有一種能中和外毒素的物質(zhì)，稱為抗毒素。將這種免疫血清轉(zhuǎn)移給正常動物也有中和外毒素的作用。這種被動免疫法很快應(yīng)用于臨床治療。Behring于1891年應(yīng)用來自動物的免疫血清成功地治療了一個白喉患者，這是第一個被動免疫治療的病例?？贵w的發(fā)現(xiàn)德國學(xué)者Behring和日本學(xué)者北里于1890年在諾貝爾獎得主：德國科學(xué)家貝林德國的細(xì)菌學(xué)家埃米爾·馮·貝林(EmilvonBehring1854-1917)。1901年因其研究抗毒素血清，尤其在運(yùn)用血清治療防治白喉和破傷風(fēng)等病癥方面的貢獻(xiàn)被授予諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。諾貝爾獎得主：德國科學(xué)家貝林德國的細(xì)菌學(xué)家埃米爾·馮·貝林抗原決定基●

一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定基●

每個

抗原決定基

至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性

抗原決定基

含有六個以上氨基酸抗原決定基●一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定基●每個抗19.1.2抗體分子的結(jié)構(gòu)與功能19.1.2抗體分子的結(jié)構(gòu)與功能免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)重鏈（heavychain，H）由450～550個氨基酸殘基組成，分子量50～75kDa根據(jù)其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結(jié)構(gòu)和抗原特異性的不同，分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，其重鏈分別為：γ、α、μ、δ、ε免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)輕鏈（lightchain，L）由214個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量約25kDa輕鏈有鏈和鏈兩種，一個天然Ig分子上兩條輕鏈的型別總是相同的，但同一個體內(nèi)可存在分別帶有鏈和鏈的抗體分子，其比例具有種屬特異性免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)可變區(qū)（variableregion，V區(qū)）輕鏈和重鏈中靠近N-端氨基酸序列變化較大的區(qū)域重鏈和輕鏈的V區(qū)分別稱為VH和VL分別占重鏈和輕鏈的1/4和1/2VH和VL各有3個區(qū)域的氨基酸組成和排列順序高度可變，稱為高變區(qū)（HVR）或互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），共同組成Ig的抗原結(jié)合部位在V區(qū)中CDR之外的區(qū)域氨基酸組成和序列相對不變，稱為骨架區(qū)（FR）可變區(qū)（variableregion，V區(qū)）恒定區(qū)（constantregion，C區(qū)）靠近C-端氨基酸序列相對穩(wěn)定的區(qū)域重鏈和輕鏈的C區(qū)分別稱為CH和CL分別占重鏈和輕鏈的3/4和1/2不同型Ig的CL長度基本一致，但不同類IgCH的長度不一恒定區(qū)（constantregion，C區(qū)）Ig的結(jié)構(gòu)域兩條重鏈和輕鏈均可折疊成數(shù)個球形結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域約由110個氨基酸殘基構(gòu)成二級結(jié)構(gòu)由反向平行的兩個-片層（-sheet）組成，兩個-片中心的兩個Cys由一個鏈內(nèi)二硫鍵垂直連接，形成“-桶狀（-barrel）”結(jié)構(gòu)，這種折疊方式稱為“免疫球蛋白折疊（immuno-globulinfolding）”Ig的結(jié)構(gòu)域鉸鏈區(qū)（hingeregion）位于CH1與CH2之間含有豐富的Pro易伸展、彎曲，能改變兩個結(jié)合抗原的Y形臂之間的距離，有利于兩臂同時結(jié)合兩個不同的抗原表位易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，產(chǎn)生不同的水解片段鉸鏈區(qū)（hingeregion）第六章抗體工程制藥課件第六章抗體工程制藥課件19.1.3抗體制備發(fā)展歷程（1）多克隆抗體1890年，Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素1937年，Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（α）球蛋白、乙種（β）球蛋白、丙種（γ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。獲取多抗的主要途徑是動物免疫血清、恢復(fù)期病人血清或免疫接種人群優(yōu)點(diǎn)：作用全面，具有抗體的各種功能；來源廣泛，制備容易缺點(diǎn)：特異性不高，易發(fā)生交叉反應(yīng)，從而限制了其應(yīng)用19.1.3抗體制備發(fā)展歷程（1）多克隆抗體第六章抗體工程制藥課件（2）單克隆抗體McAb是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。由于這種抗體是針對一個抗原決定族的抗體，又是單一的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，故稱為單克隆抗體。1975年，K?hlerandMilstein等首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出McAb.在臨床上主要用于診斷和治療。（2）單克隆抗體第六章抗體工程制藥課件木瓜蛋白酶水解片段水解部位是Ig鉸鏈區(qū)二硫鍵連接的兩條重鏈在近N-端，可將Ig裂解為兩個完全相同的Fab片段和一個Fc片段Fab片段即抗原結(jié)合片段（fragmentantigenbinding），由一條完整的輕鏈和重鏈的VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成，為單價抗體片段，可與抗體結(jié)合，但不凝集Fc片段即可結(jié)晶片段（fragmentcry-stallizable），相當(dāng)于IgG的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，無抗原結(jié)合活性，是Ig與效應(yīng)分子或細(xì)胞相互作用的部位木瓜蛋白酶水解片段胃蛋白酶水解片段作用于鉸鏈區(qū)二硫鍵所連接的兩條重鏈的近C-端，水解后可獲得一個F(ab')2片段和一些小片段pFc'F(ab')2片段由兩個Fab及鉸鏈區(qū)組成，是雙價抗體片段，可同時結(jié)合兩個抗原表位，可發(fā)生凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)F(ab')2片段保留了結(jié)合相應(yīng)抗原的生物學(xué)活性，又避免了Fc片段免疫原性可能引起的副作用，廣泛用作生物制品胃蛋白酶水解片段（3）基因工程抗體利用基因工程方法對鼠源全抗體的基因進(jìn)行重組缺失修飾改型等，在原核微生物昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，獲得抗體。包括鼠源抗體的人源化，人鼠嵌合抗體，改型抗體，小分子抗體和完全人源抗體。（3）基因工程抗體19.2單克隆抗體制備過程19.2單克隆抗體制備過程雜交瘤細(xì)胞的制備

——骨髓瘤細(xì)胞的選擇在雜交瘤細(xì)胞技術(shù)中，主要使用多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞作為親本細(xì)胞，這種細(xì)胞是由抗體合成細(xì)胞克隆衰變而成的腫瘤細(xì)胞盡可能選擇自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段的骨髓瘤細(xì)胞作為親本細(xì)胞細(xì)胞必須處于良好的生長狀態(tài)，對數(shù)生長期最好融合時，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)至少大于90%雜交瘤細(xì)胞的制備常用骨髓瘤細(xì)胞系全名

簡稱

來源

耐受

表達(dá)自身Ig分子

P3-X63-Ag8

X63

BALB/c小鼠

8-Ag

Ig-1·

MOPC11-X45-6TG

X45

BALB/c小鼠6-TG

Ig-2

b

P3-NS1-Ag4.1

NS-1

BALB/c小鼠8-Ag

(非分泌型)

P3-X63-Ag8.653

P3.653

BALB/c小鼠8-Ag

—

SP2/0-Ag14

SP2/0

BALB/c小鼠8-Ag

—

Fast-Zero

FO

BALB/c小鼠8-Ag

—

Y3-Ag1,2,3

Y3

Lou

大鼠

8-Ag

鏈

YB2-3.0-Ag20

YB2

(Lou×AO)F1

8-Ag

—

8-Ag：8-氮雜鳥嘌呤；6-TG：6-巰基嘌呤全名簡稱來源耐受表達(dá)自身Ig分子P3-X63-雜交瘤細(xì)胞的制備——免疫脾細(xì)胞懸液的制備取經(jīng)免疫的小鼠，摘除眼球放血，將小鼠處死，無菌摘取脾臟，研磨制取脾淋巴細(xì)胞懸液，用NH4Cl破碎紅細(xì)胞，洗滌，調(diào)整細(xì)胞至所需濃度，備用雜交瘤細(xì)胞的制備——骨髓瘤細(xì)胞懸液制備收集經(jīng)傳代生長24h的骨髓瘤細(xì)胞，洗滌后，計(jì)數(shù)，備用第六章抗體工程制藥課件雜交瘤細(xì)胞的制備——細(xì)胞融合脾細(xì)胞（1×108）與骨髓瘤細(xì)胞（2～3×107）混合加入PEG誘導(dǎo)融合，時間控制在2min以內(nèi)用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋細(xì)胞融合的注意點(diǎn)脾B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的比例一般為(5～10)：1PEG的分子量：一般選擇4000～6000，濃度40～50%在PEG溶液中加入DMSO，可以提高細(xì)胞接觸的緊密性，提高融合率應(yīng)嚴(yán)格限制PEG、DMSO和細(xì)胞接觸的時間雜交瘤細(xì)胞的制備——細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞的篩選篩選之前的細(xì)胞混合液中含有多種細(xì)胞未融合的細(xì)胞：脾細(xì)胞、瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞：脾—脾、瘤—瘤、脾—瘤篩選：HAT選擇性培養(yǎng)基含次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）氨基喋呤阻斷DNA合成途徑，瘤—瘤細(xì)胞不能合成DNA而死亡脾細(xì)胞在一般條件下不能連續(xù)培養(yǎng)，亦很快死亡骨髓瘤細(xì)胞是HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）缺乏細(xì)胞株，而脾細(xì)胞內(nèi)含有HGPRT，因此雜交瘤細(xì)胞可利用H、A和T合成DNA而得以生長雜交瘤細(xì)胞的篩選

用于細(xì)胞融和的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備融和率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定等特點(diǎn)。PEG的相對分子質(zhì)量和濃度越大，其促融和率越高。但其黏度和對細(xì)胞的毒性也隨之增大。常用濃度為40%~50%，相對分子質(zhì)量4000為佳。相對分子質(zhì)量在400~6000，濃度在10%~60%范圍內(nèi)的PEG都能使細(xì)胞發(fā)生融合。為了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO，以提高細(xì)胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴(yán)格限制接觸時間。用于細(xì)胞融和的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備融和率高，自身不雜交瘤細(xì)胞的篩選——選擇性培養(yǎng)方法將融合細(xì)胞懸浮于HAT培養(yǎng)液中，加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞（如小鼠腹腔巨噬細(xì)胞）的96孔板內(nèi)，每2～3天換液一次換液時取出1/2～2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液細(xì)胞融合后一周內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，殺死雜細(xì)胞后，第二周改用HT培養(yǎng)液（不含A）從第三周起改用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液從細(xì)胞融合后8～9天起可對上清進(jìn)行抗體檢測，篩選陽性克隆雜交瘤細(xì)胞的篩選——選擇性培養(yǎng)方法雜交瘤細(xì)胞的篩選——篩選陽性克隆篩選要求：微量、快速、特異、敏感、簡便，可一次性檢測大批標(biāo)本常用方法：免疫分析法，如ELISA

將抗原固定在微孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)上清培育一定時間后，用酶標(biāo)的抗鼠二抗，通過酶促反應(yīng)底物顏色變化，了解是否含有針對該抗原的抗體存在。雜交瘤細(xì)胞的篩選——篩選陽性克隆將抗原固定雜交瘤細(xì)胞的克隆化克隆化：使單個細(xì)胞通過無性繁殖而獲得該細(xì)胞群體的整個培養(yǎng)過程，這種群體細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能完全相同原因：篩選出的陽性克隆中，大多數(shù)情況下產(chǎn)生抗體的雜交瘤集落不是來自單個細(xì)胞，其中可能混有不分泌抗體的細(xì)胞，這種細(xì)胞比分泌抗體的細(xì)胞生長快，容易占據(jù)優(yōu)勢；此外，剛?cè)诤系碾s交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體易丟失一般融合后的雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過三次左右的的克隆化，才能達(dá)到100%孔內(nèi)均為抗體陽性細(xì)胞克隆雜交瘤細(xì)胞的克隆化克隆化方法——有限稀釋法將雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋至一定濃度，加入到96孔培養(yǎng)板中，使每個孔中的細(xì)胞盡可能為單細(xì)胞，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)最終形成細(xì)胞克隆可在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞分裂，直至細(xì)胞集落形成克隆化方法——軟瓊脂培養(yǎng)法將一定濃度的待克隆細(xì)胞與2%瓊脂糖培養(yǎng)液混合，鋪于底部含有1%瓊脂糖培養(yǎng)液平皿的上部，待單細(xì)胞集落生長至1～2mm時，用毛細(xì)管吸取單集落，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)工作效率高，一次克隆化即可獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，但對操作熟練程度要求高克隆化方法——有限稀釋法雜交瘤細(xì)胞庫的建立第一次融合的細(xì)胞在每次克隆過程中，均應(yīng)對檢測陽性的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存一定量的細(xì)胞經(jīng)3～4次克隆，100%雜交瘤細(xì)胞孔為分泌抗體陽性細(xì)胞時，擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存較大量的細(xì)胞，建立較完整的原始細(xì)胞庫原始細(xì)胞庫中的細(xì)胞應(yīng)包括原始融合細(xì)胞、每次克隆的細(xì)胞及建株的細(xì)胞，且建株細(xì)胞的溯源應(yīng)明確原始細(xì)胞庫中的建株細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，再建立一個工作細(xì)胞庫，用于日常研究和生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞庫的建立可獲得10μg/ml的抗體。多采用RPMI1640培養(yǎng)液，添加10%~20%胎?；蛐∨Ｑ?。但由于培養(yǎng)液中含有血清成分，總蛋白量可達(dá)100μg/ml以上，給純化帶來困難。加入小牛血清又是發(fā)生支原體污染的原因，而且批間質(zhì)量差異太大，直接影響雜交瘤細(xì)胞的生長。改良的方法有：無血清培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法、微載體懸浮培養(yǎng)法。無血清培養(yǎng)法：利用白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法雖可減少污染，但產(chǎn)量不高。懸浮培養(yǎng)法：連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度可2*107/ml,收集的單克隆抗體可達(dá)400μg/ml。如在培養(yǎng)液中加入微載體，細(xì)胞密度可達(dá)108。19.2.2雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)工藝（1）體外培養(yǎng)法：可獲得10μg/ml的抗體。多采用RPMI1640培養(yǎng)液，基本程序：接種前1~2周，小鼠腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或用液體石蠟，然后注射1*106雜交瘤細(xì)胞，7~12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，離心去細(xì)胞沉淀，取上清液凍存。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，比較經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體量多且效價高，還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株。缺點(diǎn)：小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。（2）動物體內(nèi)誘生法可獲得10μm/ml的抗體。常用方法。基本程序：接種前1~2周，小鼠腹腔注射0.5mlPrist腹腔注射法腹腔注射法19.2.3單克隆抗體的純化工藝凝膠過濾用于IgG和IgM類McAb的分離純化，常用SephadexG200為分離介質(zhì)抗體回收率50～80%，純度可達(dá)95%以上，能去除微量雜蛋白陰離子交換層析用于IgG類McAb的純化，常用DEAE型弱陰離子交換劑pH=5.5時上柱，抗體與介質(zhì)結(jié)合，除去較多雜蛋白pH=7.4時IgG1和IgG2能結(jié)合在DEAE基團(tuán)上IgG2a可在低離子強(qiáng)度下洗脫，純度較高IgG2b和IgG3在提高離子強(qiáng)度時洗脫19.2.3單克隆抗體的純化工藝親和層析ProteinA層析法為最常用，特別適用于IgG類單抗的純化pH值決定IgG與ProteinA的結(jié)合程度，采用不同pH值的緩沖液可以選擇性洗脫不同亞類的IgG收獲抗體的純度很高ProteinA親和介質(zhì)價格較昂貴親和層析疏水性電荷誘導(dǎo)層析（HCIC）HCIC介質(zhì)配基中的硫原子對Trp和Phe等氨基酸有特殊的親和力，因此HCIC配基能與抗體的Fc片段特異性結(jié)合吡啶和咪唑等雜環(huán)在pH4～10范圍內(nèi)不帶電荷，減少了靜電對雜質(zhì)的吸附；當(dāng)pH值降到小于配基的pKa時，雜環(huán)質(zhì)子化，此時抗體也帶有正電荷，產(chǎn)生靜電排斥第六章抗體工程制藥課件A、McAb均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)的半衰期只有5~6h，維持有效藥物作用靶組織時間；B、完整的抗體分子的相對分子質(zhì)量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。

McAb在免疫導(dǎo)向療法中存在的問題（障礙）：A、McAb均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HA、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相對分子質(zhì)量需要解決的問題：解決問題的方法或途徑—基因工程技術(shù)1984年報(bào)道了人—鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1/80~1/3。

A、降低McAb的免疫源性；需要解決的問題：解決問題的方法或19.3基因工程抗體基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

指用基因工程方法，對抗體的基因進(jìn)行重組、缺失、修飾改型等，構(gòu)建載體，在受體細(xì)胞中表達(dá)，獲得抗體。19.3基因工程抗體基因工程抗體(Geneticengi將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體19.3.1人源化抗體將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人鼠源性單克隆抗體的改造目的和原理目的：一是降低免疫源性；

二是降低相對分子量，增加組織通透性原理：抗體同抗原結(jié)合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)（V），同種性免疫源性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。在基因水平上把鼠源性單克隆抗體的H和L鏈的V區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H鏈和L鏈的C區(qū)基因連接，即成為人—鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表達(dá)出完整的嵌合抗體.鼠源性單克隆抗體的改造目的和原理目的：一是降低免疫源性；

人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。方法：將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件(如啟動子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上，在哺乳動物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。

特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力（1）嵌合抗體人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合第六章抗體工程制藥課件盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術(shù)。CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。（2）改型抗體盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變結(jié)合半抗原及全抗原(如細(xì)胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報(bào)道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物，用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達(dá)出改型抗體。研究表明，在構(gòu)建改形抗體時，簡單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時還必需包括對影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進(jìn)行操作。定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDRFab：抗原結(jié)合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：單鏈可變區(qū)片段單域抗體最小識別單位19.3.2小分子抗體分子量較小但具有抗原結(jié)合功能的分子片段?；蚬こ绦》肿涌贵w僅表達(dá)鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段，其相對分子質(zhì)量僅為原抗體1/80-1/3。Fab：抗原結(jié)合片斷19.3.2小分子抗體分子量較小但具有抗FvScFv單區(qū)抗體最小識別單位FabFvScFv單區(qū)抗體最小識別單位Fab由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。把Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。(1)Fab由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。(1

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是(GGGGS)3。單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。(3)單域抗體VH即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。(4)最小識別單位CDR約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構(gòu)可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低;分子小，穿透力