細胞工程-第五章 細胞融合與單克隆抗體10.25課件

第五章

細胞融合與單克隆抗體1本章主要內容：細胞融合的基本概念人工誘導細胞融合技術雜種細胞的篩選細胞雜交瘤技術與單克隆抗體人源單克隆抗體2細胞融合（cellfusion)，是指在離體條件下將不同種生物或同種生物不同類型的單細胞通過無性方式融合成一個雜合細胞的技術。細胞融合技術的出現(xiàn)標志著細胞工程的誕生！一、細胞融合3自發(fā)細胞融合（一）細胞膜融合

受精過程（二）體內細胞的自發(fā)融合

1、肌管的形成2、胚胎著床3、巨細胞和破骨細胞的形成4、腫瘤細胞的融合破骨細胞受精56細胞融合的意義理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質交換提供了有效途徑。體細胞雜交產生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。7二、人工誘導細胞融合

誘導細胞融合的主要方法有：病毒誘導融合化學融合劑誘導融合物理方法（電融合）

8滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接細胞融合，形成雜種細胞（細胞膜具有一定的流動性）生物法：滅活的病毒（喪失感染性、保留抗原結構）10（三）物理方法誘導細胞融合電融合法是80年代出現(xiàn)的細胞融合技術，在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質膜瞬間破裂，進而質膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點：融合率高、重復性強、對細胞傷害??；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控性強。12三、雜種細胞的篩選根據(jù)已經發(fā)生融合的細胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：異核細胞：非同源細胞的融合體。同核細胞：兩個相同細胞的融合體。多核細胞：含有雙親不同比例核物質的融合體。14基于酶缺陷型細胞和藥物抗性所建立的雜種篩選基于營養(yǎng)缺陷型細胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細胞組成的雜種細胞的篩選具有所需性狀雜種細胞的篩選常用的雜種細胞篩選方法15四、細胞雜交瘤技術與單克隆抗體16

免疫器官：免疫細胞生成、成熟或集中分布的場所，包括骨髓、胸腺、脾、淋巴結等

免疫細胞（發(fā)揮免疫作用的細胞）：1．吞噬細胞2．淋巴細胞（起源骨髓中的造血干細胞）T細胞（在胸腺中成熟）B細胞（在骨髓中成熟）

免疫活性物質：由免疫細胞或其他細胞產生的發(fā)揮免疫作用的物質，包括抗體、淋巴因子、溶菌酶等1718抗原（antigen，Ag），是指一種能刺激人或動物機體產生抗體或致敏淋巴細胞，并能與這些產物在體內或體外發(fā)生特異性反應的物質?？乖幕拘再|具有異物性、大分子性和特異性。異物性是指進入機體組織內的抗原物質，必須與該機體組織細胞的成分不相同。大分子性是指構成抗原的物質通常是相對分子質量大于10000的大分子物質，分子量越大，抗原性越強。特異性是指一種抗原只能與相應的抗體或效應T細胞發(fā)生特異性結合。20抗體（antibody,Ab)是機體免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B細胞或記憶細胞增殖分裂成漿細胞所產生的可與相應抗原發(fā)生特異性結合的免疫球蛋白。主要存在于血清等體液中，能與相應抗原特異性地結合，具有免疫功能。21抗原決定簇（Antigenicdeterminant）是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，又稱表位(epitope).抗原以抗原決定簇與相應淋巴細胞的抗原受體結合而激活淋巴細胞引起免疫應答。淋巴細胞表面的抗原識別受體通過識別抗原決定簇而區(qū)分“自身”與“異己”。抗原也是以抗原決定簇與相應抗體特異性結合而發(fā)生反應的。23細胞克?。河梢粋€細胞增殖而成的細胞集團24多克隆抗體（Polyclonalantibody,PcAb）：針對多種抗原決定簇的混合抗體26單克隆抗體（Monoclonalantibody,McAb）由單個B細胞克隆產生的針對單一抗原決定簇的同源抗體27

28一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細胞（癌細胞）能無限增殖雜種細胞動物細胞培養(yǎng)技術設計方案：動物細胞融合創(chuàng)始人：米爾斯坦單克隆抗體既能產生特異性抗體，又能大量繁殖30

單克隆和多克隆抗體的比較和用途特異性敏感性均一性McAbPcAb低差無高強有1、用于免疫學檢測，輔助臨床診斷2、McAb用于親和層析，分離微量可溶性抗原3、標記的McAb用于基礎研究，了解細胞分化等4、制備生物導彈用于腫瘤、移植等的臨床治療。31單克隆抗體在醫(yī)學中的應用檢驗醫(yī)學診斷試劑（1）病原微生物抗原抗體的檢測（2）腫瘤抗原的檢測（3）免疫細胞及其亞群的檢測（4）激素測定（5）細胞因子的測定蛋白質的提純腫瘤的導向治療和放射免疫顯像技術酶標儀32動物細胞融合技術B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細胞才能活動物細胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產生相應抗體的B淋巴細胞篩選陽性雜交細胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測33動物細胞融合技術B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細胞才能活動物細胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產生相應抗體的B淋巴細胞篩選陽性雜交細胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測34B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有目的雜種細胞才能活HAT培養(yǎng)基35HAT選擇培養(yǎng)基HAT選擇培養(yǎng)基組分

次黃嘌呤核苷酸（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A)（二氫葉酸還原酶抑制劑）胸腺嘧啶核苷酸（thymidine,T)36細胞DNA合成途徑1.主要途徑：

氨基酸谷氨酰胺尿核苷單磷酸

葉酸及其衍生物（必不可少的媒介）2.補救途徑：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT）

胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）原料：次黃嘌呤核苷酸（H）、胸腺嘧啶核苷酸（T）37B、B×B、B×瘤

—、瘤—×瘤—、瘤—只有目的雜種細胞才能活HAT培養(yǎng)基××××HGPRT—/TK—√388-雜氮鳥嘌呤Br-脫氧嘧啶核苷HGPRT—TK—39篩選陽性雜交細胞酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA4041免疫標記技術放射物標記技術酶標技術免疫熒光技術其他標記技術酶聯(lián)免疫吸附技術酶免疫組化技術雙抗體夾心法競爭法雙抗原夾心法間接法雙位一點法4243ELISA原理使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關44ELISA基本的實驗過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應：先后加入被檢標本和酶結合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應而被結合固定酶促反應：在反應體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應而顯色4546封閉474849505152535455動物細胞融合技術B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細胞才能活動物細胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產生相應抗體的B淋巴細胞篩選陽性雜交細胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測5657585960616263視頻：單克隆抗體的制備64動物細胞融合技術B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有雜種細胞才能活動物細胞培養(yǎng)五、單克隆抗體制備過程獲得產生相應抗體的B淋巴細胞篩選陽性雜交細胞HAT培養(yǎng)基單抗的純化、檢測65單抗純化方法：鹽析凝膠過濾離子交換層析親和層析法66用中性鹽使蛋白質沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化力，可奪取蛋白質的水化層，使蛋白質膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出。

血清50%飽和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%飽和度硫酸胺上清沉淀擬球蛋白r球蛋白（1）鹽析法67（2）凝膠過濾法干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋白質溶液加在凝膠柱上進行洗脫時，大分子蛋白不能穿過凝膠網孔進入膠粒內，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子蛋白可穿過凝膠網孔進入膠粒內，受到凝膠的阻留，向下移動較慢洗脫出來較慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質分離出來。交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)瓊脂糖凝膠(Sepharose)68（3）離子交換層析法DEAE纖維素：結合溶液中帶負電荷的蛋白質，又稱陰離子交換劑CM纖維素：結合溶液中帶正電荷的蛋白質，又稱陽離子交換劑69（4）親和層析法將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成抗原抗體復合物，然后改變條件，使抗原抗體復合物解離洗脫出純化的抗體（或抗原）70單克隆抗體特性理化性狀高度均一，生物活性專一，只與一種抗原表位發(fā)生反應，特異性強，純度高，易于實驗標準化和大量制備71單抗鑒定方法：效價（凝集反應、Elisa、放免）特異性（免疫熒光、Elisa、間接血凝、免疫印跡）72原理：WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。73聚丙烯酰胺凝膠電泳74考馬斯亮藍染色蛋白電泳結果7576（2）免疫組織化學技術77第五節(jié)人源單克隆抗體主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細胞株作為融合親本?，F(xiàn)有的細胞株大多是融合率不高，雜交瘤抗體產生水平低，而且細胞不穩(wěn)定，易喪失抗體分泌能力；（2）獲得抗原特異的人B淋巴細胞十分困難，因為對人來說，高度免疫獲得抗原特異的B淋巴細胞的方法顯然是不可行的；（3）大量繁殖雜交瘤細胞以獲得所需量的抗體，鼠類雜交瘤可通過小鼠腹腔接種雜交瘤細胞誘生腹水達到這一目的，但是人雜交瘤細胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。78EB病毒轉化技術人鼠雜交瘤單克隆抗體人人雜交瘤單克隆抗體轉基因動物制備單克隆抗體嚴重免疫缺陷小鼠制備人單克隆抗體人源單克隆抗體制備7980全球單抗市場情況812008年單抗藥物銷售前5位名單

全球單抗市場情況排名藥品名稱公司銷售額/億美元適應癥1利妥兮單抗羅氏/基因泰克13.49非何杰淋巴瘤2英利昔單抗強生/先靈葆雅12.46類風濕等免疫性疾病3曲妥珠單抗 羅氏/基因泰克10.14乳腺癌4貝伐單抗羅氏/基因泰克8.9