體外診斷試劑臨床研究講義

體外診斷試劑的臨床研究

第1頁(yè)，共32頁(yè)。體外診斷試劑的種類化學(xué)或生化檢測(cè)試劑免疫學(xué)檢測(cè)試劑抗原檢測(cè)抗體檢測(cè)核酸檢測(cè)試劑核酸雜交技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)其他試劑第2頁(yè)，共32頁(yè)。核酸擴(kuò)增技術(shù)目的片段的擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)（TAS）鏈取代的擴(kuò)增技術(shù)（SDA）探針的擴(kuò)增連接擴(kuò)增反應(yīng)（LAR）以FEN-1DNA聚合酶為基礎(chǔ)的擴(kuò)增循環(huán)探針信號(hào)擴(kuò)增第3頁(yè)，共32頁(yè)。免疫檢測(cè)的原理直接法間接法第4頁(yè)，共32頁(yè)。免疫反應(yīng)中按標(biāo)記物分類同位素標(biāo)記的放射免疫法酶標(biāo)記的酶聯(lián)免疫法生物素標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光法熒光素標(biāo)記時(shí)間分辨法其他標(biāo)記物第5頁(yè)，共32頁(yè)。臨床研究的意義以及目的臨床前樣品雖有代表性，但數(shù)量畢竟有限并不能完全代表臨床情況通過臨床試驗(yàn)對(duì)臨床前制定的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行修正可以發(fā)現(xiàn)或預(yù)測(cè)在實(shí)際應(yīng)用中遇到的問題，在說(shuō)明書中提醒用戶注意第6頁(yè)，共32頁(yè)。臨床研究的基本要求倫理考慮一般樣品特殊樣品對(duì)研究對(duì)象保密臨床前研究結(jié)果第7頁(yè)，共32頁(yè)。對(duì)臨床研究單位以及人員的要求從事相應(yīng)的工作具有相應(yīng)的技術(shù)人員有相應(yīng)的儀器設(shè)備如果試劑對(duì)儀器無(wú)特殊要求，則應(yīng)選擇不同品牌或不同型號(hào)有不同專業(yè)人員參加至少兩家省級(jí)單位對(duì)實(shí)施實(shí)驗(yàn)單位的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)指綜合能力包括檢測(cè)能力、儀器設(shè)備和人員等,主要檢測(cè)盲樣，符合要求這方能參與第8頁(yè)，共32頁(yè)。對(duì)照方法或試劑的要求新診斷試劑疾病癥狀以及臨床診斷相關(guān)試劑研究對(duì)象的追蹤隨訪疾病的判斷標(biāo)準(zhǔn)已有同類產(chǎn)品的試劑可選擇同類試劑;若評(píng)價(jià)試劑所用的原料為基因工程產(chǎn)品，應(yīng)用非基因工程原料制備的試劑進(jìn)行評(píng)價(jià)；對(duì)結(jié)果不一致樣品的處理

第9頁(yè)，共32頁(yè)。臨床樣品的選擇人群:根據(jù)試劑的適應(yīng)癥選擇不同的人群樣品:應(yīng)為自然人群，尚未用同類試劑進(jìn)行篩查過選擇不同地區(qū):代表被測(cè)物的不同流行率，代表被測(cè)物的不同基因型或血清型疾病的時(shí)期:樣品的數(shù)量:

第10頁(yè)，共32頁(yè)。檢測(cè)方法盲法平行檢測(cè)結(jié)果不一致樣品的進(jìn)一步分析第11頁(yè)，共32頁(yè)。診斷試劑的臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)

靈敏度（Sensitivity）：在陽(yáng)性樣品中檢出陽(yáng)性樣品的百分比特異性（Specificity）：在陰性樣品中檢出陰性樣品的百分比樣品分布(eg.STDEV;)

Suitabilityofcut-off陰性預(yù)期值(NPV)：若樣品沒有反應(yīng)，則不含檢測(cè)物的可能性陽(yáng)性預(yù)期值(PPV)：若樣品有反應(yīng)，則含檢測(cè)物體的可能性重復(fù)性（Reproducibility）準(zhǔn)確性（Accuracy)

精確性(Precision）第12頁(yè)，共32頁(yè)。靈敏度定義：試劑的檢測(cè)限度方法：檢測(cè)一定數(shù)量的陰性樣品，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差均值和標(biāo)準(zhǔn)差，臨界值等于均值加上2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差意義：在臨界值以上的樣品有95%為真陽(yáng)性

臨界值的評(píng)估：檢測(cè)一系列正常人群、非正常人群和特殊人群對(duì)臨界值進(jìn)行核對(duì)表示方法：以量值表示（如ng，單位，CFU/ml，PFU/ml，拷貝數(shù)等）；以稀釋度表示第13頁(yè)，共32頁(yè)。影響靈敏度的因素特殊疾病

有一些特殊的病人，其代謝異?？赡苡绊憳?biāo)志物的檢測(cè)干擾物質(zhì)或抑制物質(zhì)可以來(lái)自與病人（藥物）；也可來(lái)自于樣品的處理過程（反復(fù)凍融，溶血等）；或樣品本身存在抑制物等樣品基因型和血清型的影響

有些被測(cè)物存在多種基因型或血清型，若原材料沒有廣譜性，則可影響靈敏度試劑的灰區(qū)：

對(duì)特殊的試劑要制定灰區(qū)，如FDA要求HCV抗體試劑臨界值以上均為灰區(qū)，對(duì)灰區(qū)樣品要加倍重試第14頁(yè)，共32頁(yè)。核酸檢測(cè)抑制物的作用原理核酸擴(kuò)增需要酶的參與酶發(fā)揮作用需要輔助因子以及特殊的條件輔助因子與酶的特殊部位物理結(jié)合后發(fā)生反應(yīng)任何結(jié)合輔助因子、改變環(huán)境或阻止酶與輔助因子特異結(jié)合的物質(zhì)均抑制反應(yīng)第15頁(yè)，共32頁(yè)。核酸擴(kuò)增常見的抑制物血紅素及其代謝物影響DNA聚合酶的反應(yīng)，不同來(lái)源的DNA聚合酶受影響程度不同痰中的酸性多聚糖或糖蛋白均影響DNA聚合酶的反應(yīng)腦脊液和尿中可能含有抑制物，但具體物質(zhì)不明確糞便中的膽汁鹽是PCR反應(yīng)的強(qiáng)抑制劑肝素可與DNA聚合酶結(jié)合，對(duì)不同的酶抑制程度不同核酸提取試劑中的某些物質(zhì)具有抑制作用：EDTA，SDS，鹽酸胍等第16頁(yè)，共32頁(yè)。內(nèi)標(biāo)的種類未修飾性的內(nèi)標(biāo)異源性內(nèi)標(biāo)修飾性的內(nèi)標(biāo)第17頁(yè)，共32頁(yè)。特異性定義：主要指假陽(yáng)性的檢出情況評(píng)價(jià)方法：主要是通過檢測(cè)部分樣品，或特殊樣品尤其是性質(zhì)相近的標(biāo)志物（如不同基因型或血清型樣品），分析出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況；而且分析時(shí)要注意在不同量時(shí)的特異性第18頁(yè)，共32頁(yè)。造成非特異性的因素原料：主要純度不夠，原料本身存在非特異反應(yīng)物質(zhì)反應(yīng)模式：如孵育時(shí)間縮短非特異反應(yīng)可提高3-4倍，非常短時(shí)可高達(dá)10倍樣品中的干擾物質(zhì)：病人本身：如自身免疫性疾?。ǜ呙庖咔虻鞍籽Y等），黃疸類、溶血類和高脂類病人病人使用特殊藥物樣品處理過程：如不同抗凝劑，不同試管，某些化學(xué)或去污劑以及樣品反復(fù)凍融等因素第19頁(yè)，共32頁(yè)。核酸檢測(cè)中造成非特異性的因素交叉反應(yīng)：主要是引物序列與被測(cè)物中序列存在一定程度的同源性樣品之間的污染：氣溶膠中含有目的微生物，對(duì)照的污染等擴(kuò)增產(chǎn)物的污染：擴(kuò)增產(chǎn)物聚集在器皿、臺(tái)面、設(shè)備以及通風(fēng)設(shè)施上等造成污染第20頁(yè)，共32頁(yè)。污染的處理酶的滅活（UNG）主要用于滅活產(chǎn)物光化學(xué)處理用可溶性psoralen的衍生物處理，在用長(zhǎng)紫外照射即可滅活產(chǎn)物、也可減少樣品的污染化學(xué)處理方法用于表面的處理

10%次氯酸鈉紫外照射物理的:

專用移液器、一次性試管架、紫外燈、PCR工作罩、濾芯吸嘴。第21頁(yè)，共32頁(yè)。樣品典型的正態(tài)分布NegativepopulationPositivepopulationFrequencyofobservations0100110Percentageofmaximumsignal(log)Cut-off第22頁(yè)，共32頁(yè)。特異性與值關(guān)系的分析企業(yè)假陽(yáng)性特異性（%）值金豪萬(wàn)泰GBI耀華科華麗珠華美新創(chuàng)普生綠科中山理利Murex梅里埃32510327151822114

99.7099.8099.4999.9010099.7099.8099.2998.4899.9099.1997.7798.8899.59-3.985-3.688-3.423-3.364-3.687-2.741-4.337-3.636-2.261-3.060-2.778-1.774-3.551-4.311樣品庫(kù)有985份樣品。特異性與其“δ”值相關(guān)性系數(shù)為0.691,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004）

第23頁(yè)，共32頁(yè)。

d-d+

值的計(jì)算以及意義

delta=d/SDcut-offlog10[OD/CO]XX0FrequencyOD/COdatamustbetransformedtolog10valuesbeforetheanalysis第24頁(yè)，共32頁(yè)。數(shù)值的計(jì)算樣品的實(shí)際狀態(tài)

+--+檢測(cè)結(jié)果

--

ABCD

A+BC+D

A+CB+D靈敏度=A/（A+C);特異性=D/（B+D）陽(yáng)性預(yù)期值:1)簡(jiǎn)單的計(jì)算方法即：PPV=A/（A+B）可以給出一個(gè)大約的數(shù)值;

2)精確的計(jì)算方法即：PPV=流行率×敏感性/｛流行率×敏感性+（1-流行率）×（1-特異性)｝陰性預(yù)期值:1)．簡(jiǎn)單的計(jì)算方法即：NPV=D/（C+D）可以給出一個(gè)大約的數(shù)值

2)．精確的計(jì)算方法即：NPV=(1-流行率）×特異性/｛（1-流行率）×特異性+流行率×（1-敏感性)｝

第25頁(yè)，共32頁(yè)。精確性(Precision)作用：評(píng)價(jià)試劑的隨機(jī)誤差通過重復(fù)檢測(cè)某一或某些特定樣品并分析其一致性，通常以變異系數(shù)或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示樣品的要求：最好應(yīng)含有高、中、低三類每一類樣品至少檢測(cè)4次，實(shí)際上檢測(cè)10次或10次以上第26頁(yè)，共32頁(yè)。準(zhǔn)確性（accuracy)主要評(píng)價(jià)試劑的系統(tǒng)誤差，反映樣品的檢測(cè)值和真實(shí)值的一致性表示方法：偏差（%）=（檢測(cè)值-真實(shí)值）X100/真實(shí)值評(píng)價(jià)方法：

1.在某一樣品中加上已知量的檢測(cè)物重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算檢測(cè)值與預(yù)期值的偏差2.檢測(cè)已知量的參考品，計(jì)算檢測(cè)量與標(biāo)化量的偏差第27頁(yè)，共32頁(yè)。定量范圍定義：能夠給出準(zhǔn)確量值的范圍建立的方法：主要對(duì)系列稀釋樣品的反復(fù)檢測(cè)制定的定量曲線：線性或非線性要求：對(duì)定量范圍的上限和下限樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其精確性仍能符合要求第28頁(yè)，共32頁(yè)。重復(fù)性（Reproducibility）不同實(shí)驗(yàn)次數(shù)之間（Run-run）不同實(shí)驗(yàn)室之間（Site-site）不同實(shí)驗(yàn)人員之間（Operator-operator）不同時(shí)間之間（Day-day）特殊情況下的重復(fù)性第29頁(yè)，共32頁(yè)。定量試劑的特殊要求樣品所含被測(cè)物的量應(yīng)該分散應(yīng)含有在最高和最低檢測(cè)限的樣品與參比試劑的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算相關(guān)性，而且要統(tǒng)計(jì)兩種檢測(cè)結(jié)果的量值有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異第30頁(yè)，共32頁(yè)。謝謝第31頁(yè)，共32頁(yè)。內(nèi)容梗概體外診斷試劑的臨床研究。酶標(biāo)記的酶聯(lián)免疫法。臨床前樣品雖有代表性，但數(shù)量畢竟有限并不能完全代表臨床情況。可以發(fā)現(xiàn)或預(yù)測(cè)在實(shí)際應(yīng)用中遇到的問題，在說(shuō)明書中提醒用戶注意。如果試劑對(duì)儀器無(wú)特殊要求，則應(yīng)選擇不同品牌或不同型號(hào)。指綜合能力包括檢測(cè)能力、儀器設(shè)備和人員等,主要檢測(cè)盲樣，符合要求這方能參與。人群:根據(jù)試劑的適應(yīng)癥選擇不同的人群。均值和標(biāo)準(zhǔn)差，臨界值等于均值加上2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。臨界值的評(píng)估：檢測(cè)一系列正常人群、非正常人群和特殊人群對(duì)臨界值進(jìn)行核對(duì)。有一些特殊的病人，其代謝異常可能影響標(biāo)志物的檢測(cè)。干擾物質(zhì)或抑制物質(zhì)。任何結(jié)合輔助因子、改變環(huán)境或