微生物工程菌種與種子擴大培養(yǎng)課件

第一章：菌種與種子擴大培養(yǎng)

微生物工業(yè)用菌種

種子擴大培養(yǎng)

影響種子質量的主要因素第一章：菌種與種子擴大培養(yǎng)第一節(jié)微生物工業(yè)用菌種一、微生物的特性

有些微生物能在厭氧的條件下生長

有些微生物能夠利用簡單的有機物和無機物滿足自身的生長

有些微生物能進行復雜的代謝

有些微生物能利用較復雜的化合物

有些微生物能在極端的環(huán)境下生長第一節(jié)微生物工業(yè)用菌種有些微生物能在厭氧的條件下生長有二、工業(yè)化菌種的要求

能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產物

有關合成產物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強

遺傳性能要相對穩(wěn)定

不易感染它種微生物或噬菌體

產生菌及其產物的毒性必須考慮（在分類學上最好與致病菌無關）

生產特性要符合工藝要求二、工業(yè)化菌種的要求能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產芽孢的細菌植物或動物來源1、抗生素生產有關的微生物抗生素是次級代謝產物，需要生物體進行復雜的代謝，目前發(fā)現的生物來源如下：三、已工業(yè)化產品生產菌的介紹放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些2、氨基酸生產有關的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產物，這種發(fā)酵形象地稱為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應用。50,60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個轉折點：2、氨基酸生產有關的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調節(jié)機制

HT:高絲氨酸轉乙酰酶AK:天冬氨酸激酶HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨基酸生產菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它氨基酸生產菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細菌常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌氨基酸生產菌的要求：代謝途徑比較清楚，谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它3、食品酶制劑生產有關的微生物開發(fā)一個新酶，都要經過一系列研究的毒理試驗。關于食品用酶，美國需要得到FDA的批準。目前已同意使用的僅僅少數微生物能用于生產食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌3、食品酶制劑生產有關的微生物開發(fā)一個新酶，都要經過一系列研四、菌種分離與保藏1、菌種分離的一般過程土樣的采取→預處理→培養(yǎng)→菌落的選擇→產品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現目的：高效地獲取一株高產目的產物的微生物問題：四、菌種分離與保藏1、菌種分離的一般過程土樣的采取→預處理2、采樣時要注意的問題

氣候、水分、空氣

來源要廣

結合產品的特點

標簽：地點、時間、氣候等2、采樣時要注意的問題氣候、水分、空氣來源要廣結合產品富集的三種方案：

定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進行培養(yǎng)。3、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。

當不可能采用定向培養(yǎng)時，則可設計在一個分類學中考慮，

不能提供任何有助于篩選產生菌的信息，這時只能通過隨機分離的辦法富集的三種方案：定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過濾等，表2-2（P31）但主要是通過培養(yǎng)的方法定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過濾等，表2-2（P31）定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫4、菌落的選出

從產物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產物的形成有目的的設計培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素（P35）

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產生菌在適當的培養(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。4、菌落的選出從產物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產物的形成有目的的設實例：堿性纖維素酶產生菌的篩選（國家七五攻關項目）采樣（造紙廠）→80度30分鐘處理文獻:產生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿牙孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍＋1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養(yǎng)3～4天，選擇有凹陷圈的菌落從285個土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導型↓實例：堿性纖維素酶產生菌的篩選（國家七五攻關項目）采樣（造紙例：醛肟水解酶的篩選

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培養(yǎng)基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物，補充新鮮培養(yǎng)基不斷分析樣品，2-3個月后Z-PAOx降低后，稀釋分離條菌落例：醛肟水解酶的篩選--Journalofbiotech5、目的微生物富集方法的研究進展

分子生物學的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標產物的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術等

目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數的1%。微生物的多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后若干年的研究重點。

2002,陳文新（科學院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～815、目的微生物富集方法的研究進展分子生物學的實驗手段，在微六、菌株選育與分子改造目的

提高生產能力

提高產品質量

開發(fā)新產品

解決生產實際問題

防止菌種退化六、菌株選育與分子改造目的提高生產能力提高產品質量方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質體融合、基因工程基因的直接進化：點突變、易錯PCR、同序法DNAShuffling等方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質體融合自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產上所不希望看到的，表現為菌株的衰退和生產質量的下降，這種突變成為負突變。另一種是我們生產上希望看到的，對生產有利，這種突變成為正突變。1、自然選育自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-8～10-9自然自然選育在工業(yè)生產上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產高產的重要措施?；貜屯蛔儯焊弋a菌株在傳代的過程中，由于自然突變導致高產性狀的丟失，生產性能下降，這種情況我們稱為回復突變問題：高產菌株是正突變高，還是負突變高？自然選育在工業(yè)生產上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠自然選育操作步驟：一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗自然選育操作步驟：一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。2、誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選，稱為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑誘變劑物理在：紫外，快中子化學：硫酸二乙酯，亞硝基胍{2、誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選（2）、誘變劑處理過程中幾個有關的問題

化學誘變劑使用過程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發(fā)菌株的選擇（1）、誘變劑的作用原理（略）壓硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH（2）、誘變劑處理過程中幾個有關的問題化學誘變劑使用過程的（3）、誘變育種的一般步驟(p83)（4）、篩選的方法

隨機篩選

形態(tài)

理性化篩選從產物形成的生理生化途徑著手，進行有的放矢的篩選。如結構類似物抗性、營養(yǎng)缺陷型等，篩選而產生的這些特性，稱為遺傳標記。結構類似物：在化學和空間結構上和代謝的中間物（終產物）相似，因而在代謝調節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產物）的功能，但細胞不能以其作為自身的營養(yǎng)物質。（3）、誘變育種的一般步驟(p83)（4）、篩選的方法隨HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節(jié)機制

HT:高絲氨酸轉乙酰酶AK:天冬氨酸激酶結構類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV營養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節(jié)機制HT:黃色短桿菌F9-50的誘變譜系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l黃色短桿菌F9-50的誘變譜系Bervibacter3、基因的直接進化(directedevolution)

突變基因突變庫的建立篩選基因突變庫的篩選基因復制與遺傳步驟：

在分子水平上，對目標基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標蛋白的性能。3、基因的直接進化(directedevolution)七、生產用菌種的保藏與復壯（一）、菌種保藏1、概念：根據菌種的生理生化特點，人工地創(chuàng)造條件，使其代謝活動處于不活潑狀態(tài)。2、不同情況、不同菌種采用不同方法。斜面低溫保藏法（如酵母菌）石蠟油封保藏法（如酵母菌）砂土保藏法（如放線菌）硅膠保藏法冷凍干燥保藏法（如一般細菌）液氮超低溫凍結法（如真菌）七、生產用菌種的保藏與復壯（二）、防止菌種衰退的措施（1）、菌種的衰退發(fā)酵力的下降繁殖力的下降發(fā)酵產品的得率降低（2）、衰退的原因菌種保藏不妥菌種生長的要求沒有得到滿足

遇到不利的條件失去某些必要的條件發(fā)生回復突變

（二）、防止菌種衰退的措施（3）、防止衰退的方法做好菌種的保藏工作盡可能滿足生長條件盡量減少傳代次數（4）、菌種的分離復壯普通方法：稀釋平板法或平板劃線法分離單細胞菌落芽孢桿菌：先將菌液沸水處理數分鐘，再用平板進行分離改變培養(yǎng)條件：如單細胞分離仍效果不佳，可考慮改變培養(yǎng)溫度條件，以利高產菌株生長而不利低產菌株生長返回（3）、防止衰退的方法第二節(jié)種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型種子制備的技術概要及種子制備實例影響種子質量的因素第二節(jié)種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求工業(yè)微生物的培

種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產菌種接入試管斜面活化后，再經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數量和質量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。一、種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子擴大培養(yǎng)的概念:種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中種子擴培的目的

接種量的需要

菌種的馴化

縮短發(fā)酵時間、保證生產水平種子的要求：

總量及濃度能滿足要求

生理狀況穩(wěn)定，個體與群體

活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長

無雜菌污染種子擴培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間二、工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型培養(yǎng)類型靜置培養(yǎng)通氣培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)液體培養(yǎng)表層培養(yǎng)固態(tài)培養(yǎng)大規(guī)模工業(yè)生產嫌氣性發(fā)酵好氣性發(fā)酵酒精、丙酮、丁醇、乳酸等固體培養(yǎng)液體深層培養(yǎng)載體培養(yǎng)兩步法液體深層培養(yǎng)返回二、工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型培養(yǎng)類型靜置培養(yǎng)通氣培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)三、影響種子質量的因素（一）、種子制備的過程三、影響種子質量的因素（一）、種子制備的過程（一）、種子制備的過程實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。生產車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產車間階段。（一）、種子制備的過程實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培（二）、實驗室階段1、培養(yǎng)物選擇的原則目的：種子擴培到一定的量和質，根據菌種的特點最終的培養(yǎng)物可分為兩類：

對于不產孢子和芽胞的微生物

——獲得一定數量和質量的菌體對于不產芽孢和孢子的微生物，實驗室階段的種子擴培最終是獲得一定數量和質量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。（二）、實驗室階段1、培養(yǎng)物選擇的原則目的：種子擴培到一定的

獲得一定數量和質量的孢子菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得量和質穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。

對于產孢子的微生物

獲得一定數量和質量的菌絲體便于操作，但需要更仔細的控制。獲得一定數量和質量的孢子菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得2、培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應該是有利于孢子的生長。在原料方面，實驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細。2、培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應該是有利于菌體的生長，對孢3、起始接種物的傳代問題

細菌保藏斜面→活化斜面

產孢子保藏→母斜面→子斜面目的：使菌種的傳代次數盡可能的少。3、起始接種物的傳代問題細菌保藏斜面→活化斜面

母瓶：活化、純化，使保藏菌種生長，并去處變異株。所以接種時要稀一點、便于純化生長到單菌落。

子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接種：①從母斜面上點接種，選取生長好的單菌落②接種時密一點，得到大量的孢子。孢子培養(yǎng)時注意濕度，子斜面使用一般不超過1個月。孢子培養(yǎng)不產孢子的細菌如谷氨酸棒桿菌和短桿菌，采用斜面營養(yǎng)細胞保藏法，2~3月移種1次產孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種如灰色鏈霉菌和卡那霉菌，可將孢子接入液體培養(yǎng)基中形成菌絲體種子。母瓶：活化、純化，使保藏菌種生長，并去處變異株。子（三）、生產車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原則在生產車間階段，最終一般都是獲得一定數量的菌絲體。

縮短發(fā)酵時間

有利于獲得好的發(fā)酵結果菌絲體比孢子要有利：（三）、生產車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原則在生產車間階段，最終2、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數量和質量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實驗室階段那么精細，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個方面的原因:

一是成本二是馴化2、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數量和質量的菌體，因此培養(yǎng)例：檸檬酸發(fā)酵

以蔗糖為原料成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%瓊脂2%例：檸檬酸發(fā)酵以蔗糖為原料成分

薯干粉成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁薯干粉10%22-28%(NH4)2SO40.5%瓊脂2%薯干粉成分斜面3、發(fā)酵級數的確定谷氨酸：二級發(fā)酵搖瓶→一級種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵一級種子（發(fā)芽罐）→二級種子（繁殖罐）→發(fā)酵

一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數鏈霉素：四級發(fā)酵一級種子→二級種子→三級種子→發(fā)酵3、發(fā)酵級數的確定谷氨酸：二級發(fā)酵搖瓶→一級種子（小罐）→發(fā)酵級數確定的依據

級數受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響

級數大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。

在發(fā)酵產品的放大中，反應級數的確定是非常重要的一個方面發(fā)酵級數確定的依據級數受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的4、接種量的確定

移入種子的體積接種量＝—————————

接種后培養(yǎng)液的體積過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數抗生素為7-15%。但是一般認為大一點好。雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。

P1474、接種量的確定移入種子的5、種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結果定。接種種齡對堿性蛋白酶產生的影響接種量對堿性蛋白酶產生的影響5、種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵6、溫度大多數微生物的最適生長溫度：25~37℃不同生長階段的微生物對溫度的反應不同。原則：延遲期處于最適生長溫度，對數生長期略低于最適生長溫度，后期主要決定于溶解氧。Q10:在生物學范圍內，溫度每升高10℃，生長速度加快1倍。6、溫度大多數微生物的最適生長溫度：25~37℃不同生長階段7、pH值pH值的作用：影響菌體本身的生命活動；影響酶合成方向。培養(yǎng)過程中發(fā)酵液的pH值會發(fā)生變化。高碳源培養(yǎng)基傾向于向酸性pH值轉移，高氮源培養(yǎng)基傾向于向堿性pH值轉移，變化總結果取決于碳氮比。7、pH值pH值的作用：影響菌體本身的生命活動；影響酶合成方8、通氣和攪拌通氣量與菌種、培養(yǎng)基的性質及培養(yǎng)階段有關。不同微生物要求通氣量不同，同一菌種在不同生理時期對通氣量要求不同培養(yǎng)罐深、攪拌轉速大，通氣管開孔小或多，培養(yǎng)基粘度小，氧的溶解度大，反之則小。8、通氣和攪拌通氣量與菌種、培養(yǎng)基的性質及培養(yǎng)階段有關。不同9、泡沫泡沫形成的原因：機械攪拌和通氣使液體分散和空氣竄入；代謝活動產生的氣泡。泡沫的危害：影響氧的吸收和二氧化碳的排出；降低發(fā)酵罐的有效容量；導致跑料和染菌。消泡措施：機械消泡，化學消泡。9、泡沫泡沫形成的原因：機械攪拌和通氣使液體分散和空氣竄入；10、染菌的控制種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結果定。10、染菌的控制種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子11、種子的質量要求：量：要求達到一定的濃度質:形態(tài)（生長處于某個階段、均勻等等）理化指標：C、N、P的含量，pH

酶活等無污染11、種子的質量要求：量：要求達到一定的濃度質:形態(tài)（四、種子制備過程舉例（一）、谷氨酸生產的種子制備制備過程斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵四、種子制備過程舉例（一）、谷氨酸生產的種子制備制備過程斜1、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5

瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過

3次1、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%2.一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，

K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基2.一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液3.二級種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%），

32℃培養(yǎng)7-10個小時培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基3.二級種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)種子的質量要求：108-109個/ml大小均勻，呈單個或八字排列PH7.0-7.2時結束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛種子的質量要求：108-109個/ml（二）、青霉素生產的種子制備制備過程安培管→斜面孢子→大米孢子→一級種子→二級種子→發(fā)酵（二）、青霉素生產的種子制備制備過程安培管→斜面孢子→1、斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基特點：有利于長孢子，用量少而精細培養(yǎng)條件：25℃、7天,注意濕度50%左右1、斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基特點：有2、大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）培養(yǎng)基的特點：成本低、米粒之間結構疏松提高比表面積和氧的傳質，營養(yǎng)適當（要求大米的白點?。┯欣阪咦拥纳L。培養(yǎng)條件：25℃、7天，控制濕度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106個孢子2、大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）培養(yǎng)基的特點：成本低3、一級種子培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿目的：長菌體培養(yǎng)條件：27℃，40小時接種量：200億孢子/噸4、二級種子培養(yǎng)基：同上培養(yǎng)條件：27℃、10-14小時接種量：10%3、一級種子培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿目的：長菌種子的質量要求菌絲長稠呈絲狀、菌絲團很少，有中小空孢，處于Ⅲ—Ⅳ期青霉素發(fā)酵菌絲體的生長共分為6個期，1-4為年青期，4-6期合成青霉素的能力最強種子的質量要求菌絲長稠呈絲狀、菌絲團很少，有中小空孢，處于Ⅲ第一章：菌種與種子擴大培養(yǎng)

微生物工業(yè)用菌種

種子擴大培養(yǎng)

影響種子質量的主要因素第一章：菌種與種子擴大培養(yǎng)第一節(jié)微生物工業(yè)用菌種一、微生物的特性

有些微生物能在厭氧的條件下生長

有些微生物能夠利用簡單的有機物和無機物滿足自身的生長

有些微生物能進行復雜的代謝

有些微生物能利用較復雜的化合物

有些微生物能在極端的環(huán)境下生長第一節(jié)微生物工業(yè)用菌種有些微生物能在厭氧的條件下生長有二、工業(yè)化菌種的要求

能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產物

有關合成產物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強

遺傳性能要相對穩(wěn)定

不易感染它種微生物或噬菌體

產生菌及其產物的毒性必須考慮（在分類學上最好與致病菌無關）

生產特性要符合工藝要求二、工業(yè)化菌種的要求能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產芽孢的細菌植物或動物來源1、抗生素生產有關的微生物抗生素是次級代謝產物，需要生物體進行復雜的代謝，目前發(fā)現的生物來源如下：三、已工業(yè)化產品生產菌的介紹放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些2、氨基酸生產有關的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有意識地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產物，這種發(fā)酵形象地稱為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應用。50,60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個轉折點：2、氨基酸生產有關的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調節(jié)機制

HT:高絲氨酸轉乙酰酶AK:天冬氨酸激酶HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨基酸生產菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它氨基酸生產菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細菌常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌氨基酸生產菌的要求：代謝途徑比較清楚，谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它3、食品酶制劑生產有關的微生物開發(fā)一個新酶，都要經過一系列研究的毒理試驗。關于食品用酶，美國需要得到FDA的批準。目前已同意使用的僅僅少數微生物能用于生產食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌3、食品酶制劑生產有關的微生物開發(fā)一個新酶，都要經過一系列研四、菌種分離與保藏1、菌種分離的一般過程土樣的采取→預處理→培養(yǎng)→菌落的選擇→產品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現目的：高效地獲取一株高產目的產物的微生物問題：四、菌種分離與保藏1、菌種分離的一般過程土樣的采取→預處理2、采樣時要注意的問題

氣候、水分、空氣

來源要廣

結合產品的特點

標簽：地點、時間、氣候等2、采樣時要注意的問題氣候、水分、空氣來源要廣結合產品富集的三種方案：

定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進行培養(yǎng)。3、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。

當不可能采用定向培養(yǎng)時，則可設計在一個分類學中考慮，

不能提供任何有助于篩選產生菌的信息，這時只能通過隨機分離的辦法富集的三種方案：定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過濾等，表2-2（P31）但主要是通過培養(yǎng)的方法定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過濾等，表2-2（P31）定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫4、菌落的選出

從產物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產物的形成有目的的設計培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素（P35）

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產生菌在適當的培養(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。4、菌落的選出從產物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產物的形成有目的的設實例：堿性纖維素酶產生菌的篩選（國家七五攻關項目）采樣（造紙廠）→80度30分鐘處理文獻:產生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿牙孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍＋1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養(yǎng)3～4天，選擇有凹陷圈的菌落從285個土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導型↓實例：堿性纖維素酶產生菌的篩選（國家七五攻關項目）采樣（造紙例：醛肟水解酶的篩選

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培養(yǎng)基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物，補充新鮮培養(yǎng)基不斷分析樣品，2-3個月后Z-PAOx降低后，稀釋分離條菌落例：醛肟水解酶的篩選--Journalofbiotech5、目的微生物富集方法的研究進展

分子生物學的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標產物的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術等

目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數的1%。微生物的多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后若干年的研究重點。

2002,陳文新（科學院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～815、目的微生物富集方法的研究進展分子生物學的實驗手段，在微六、菌株選育與分子改造目的

提高生產能力

提高產品質量

開發(fā)新產品

解決生產實際問題

防止菌種退化六、菌株選育與分子改造目的提高生產能力提高產品質量方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質體融合、基因工程基因的直接進化：點突變、易錯PCR、同序法DNAShuffling等方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質體融合自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產上所不希望看到的，表現為菌株的衰退和生產質量的下降，這種突變成為負突變。另一種是我們生產上希望看到的，對生產有利，這種突變成為正突變。1、自然選育自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-8～10-9自然自然選育在工業(yè)生產上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產高產的重要措施。回復突變：高產菌株在傳代的過程中，由于自然突變導致高產性狀的丟失，生產性能下降，這種情況我們稱為回復突變問題：高產菌株是正突變高，還是負突變高？自然選育在工業(yè)生產上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠自然選育操作步驟：一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗自然選育操作步驟：一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。2、誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選，稱為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑誘變劑物理在：紫外，快中子化學：硫酸二乙酯，亞硝基胍{2、誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選（2）、誘變劑處理過程中幾個有關的問題

化學誘變劑使用過程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發(fā)菌株的選擇（1）、誘變劑的作用原理（略）壓硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH（2）、誘變劑處理過程中幾個有關的問題化學誘變劑使用過程的（3）、誘變育種的一般步驟(p83)（4）、篩選的方法

隨機篩選

形態(tài)

理性化篩選從產物形成的生理生化途徑著手，進行有的放矢的篩選。如結構類似物抗性、營養(yǎng)缺陷型等，篩選而產生的這些特性，稱為遺傳標記。結構類似物：在化學和空間結構上和代謝的中間物（終產物）相似，因而在代謝調節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產物）的功能，但細胞不能以其作為自身的營養(yǎng)物質。（3）、誘變育種的一般步驟(p83)（4）、篩選的方法隨HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節(jié)機制

HT:高絲氨酸轉乙酰酶AK:天冬氨酸激酶結構類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV營養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調節(jié)機制HT:黃色短桿菌F9-50的誘變譜系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l黃色短桿菌F9-50的誘變譜系Bervibacter3、基因的直接進化(directedevolution)

突變基因突變庫的建立篩選基因突變庫的篩選基因復制與遺傳步驟：

在分子水平上，對目標基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標蛋白的性能。3、基因的直接進化(directedevolution)七、生產用菌種的保藏與復壯（一）、菌種保藏1、概念：根據菌種的生理生化特點，人工地創(chuàng)造條件，使其代謝活動處于不活潑狀態(tài)。2、不同情況、不同菌種采用不同方法。斜面低溫保藏法（如酵母菌）石蠟油封保藏法（如酵母菌）砂土保藏法（如放線菌）硅膠保藏法冷凍干燥保藏法（如一般細菌）液氮超低溫凍結法（如真菌）七、生產用菌種的保藏與復壯（二）、防止菌種衰退的措施（1）、菌種的衰退發(fā)酵力的下降繁殖力的下降發(fā)酵產品的得率降低（2）、衰退的原因菌種保藏不妥菌種生長的要求沒有得到滿足

遇到不利的條件失去某些必要的條件發(fā)生回復突變

（二）、防止菌種衰退的措施（3）、防止衰退的方法做好菌種的保藏工作盡可能滿足生長條件盡量減少傳代次數（4）、菌種的分離復壯普通方法：稀釋平板法或平板劃線法分離單細胞菌落芽孢桿菌：先將菌液沸水處理數分鐘，再用平板進行分離改變培養(yǎng)條件：如單細胞分離仍效果不佳，可考慮改變培養(yǎng)溫度條件，以利高產菌株生長而不利低產菌株生長返回（3）、防止衰退的方法第二節(jié)種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型種子制備的技術概要及種子制備實例影響種子質量的因素第二節(jié)種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求工業(yè)微生物的培

種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產菌種接入試管斜面活化后，再經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數量和質量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。一、種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子擴大培養(yǎng)的概念:種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中種子擴培的目的

接種量的需要

菌種的馴化

縮短發(fā)酵時間、保證生產水平種子的要求：

總量及濃度能滿足要求

生理狀況穩(wěn)定，個體與群體

活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長

無雜菌污染種子擴培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間二、工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型培養(yǎng)類型靜置培養(yǎng)通氣培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)液體培養(yǎng)表層培養(yǎng)固態(tài)培養(yǎng)大規(guī)模工業(yè)生產嫌氣性發(fā)酵好氣性發(fā)酵酒精、丙酮、丁醇、乳酸等固體培養(yǎng)液體深層培養(yǎng)載體培養(yǎng)兩步法液體深層培養(yǎng)返回二、工業(yè)微生物的培養(yǎng)類型培養(yǎng)類型靜置培養(yǎng)通氣培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)三、影響種子質量的因素（一）、種子制備的過程三、影響種子質量的因素（一）、種子制備的過程（一）、種子制備的過程實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。生產車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產車間階段。（一）、種子制備的過程實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培（二）、實驗室階段1、培養(yǎng)物選擇的原則目的：種子擴培到一定的量和質，根據菌種的特點最終的培養(yǎng)物可分為兩類：

對于不產孢子和芽胞的微生物

——獲得一定數量和質量的菌體對于不產芽孢和孢子的微生物，實驗室階段的種子擴培最終是獲得一定數量和質量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。（二）、實驗室階段1、培養(yǎng)物選擇的原則目的：種子擴培到一定的

獲得一定數量和質量的孢子菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得量和質穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。

對于產孢子的微生物

獲得一定數量和質量的菌絲體便于操作，但需要更仔細的控制。獲得一定數量和質量的孢子菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得2、培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應該是有利于孢子的生長。在原料方面，實驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細。2、培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應該是有利于菌體的生長，對孢3、起始接種物的傳代問題

細菌保藏斜面→活化斜面

產孢子保藏→母斜面→子斜面目的：使菌種的傳代次數盡可能的少。3、起始接種物的傳代問題細菌保藏斜面→活化斜面

母瓶：活化、純化，使保藏菌種生長，并去處變異株。所以接種時要稀一點、便于純化生長到單菌落。

子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接種：①從母斜面上點接種，選取生長好的單菌落②接種時密一點，得到大量的孢子。孢子培養(yǎng)時注意濕度，子斜面使用一般不超過1個月。孢子培養(yǎng)不產孢子的細菌如谷氨酸棒桿菌和短桿菌，采用斜面營養(yǎng)細胞保藏法，2~3月移種1次產孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種如灰色鏈霉菌和卡那霉菌，可將孢子接入液體培養(yǎng)基中形成菌絲體種子。母瓶：活化、純化，使保藏菌種生長，并去處變異株。子（三）、生產車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原則在生產車間階段，最終一般都是獲得一定數量的菌絲體。

縮短發(fā)酵時間

有利于獲得好的發(fā)酵結果菌絲體比孢子要有利：（三）、生產車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原則在生產車間階段，最終2、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數量和質量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實驗室階段那么精細，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個方面的原因:

一是成本二是馴化2、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數量和質量的菌體，因此培養(yǎng)例：檸檬酸發(fā)酵

以蔗糖為原料成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%瓊脂2%例：檸檬酸發(fā)酵以蔗糖為原料成分

薯干粉成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁薯干粉10%22-28%(NH4)2SO40.5%瓊脂2%薯干粉成分斜面3、發(fā)酵級數的確定谷氨酸：二級發(fā)酵搖瓶→一級種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵一級種子（發(fā)芽罐）→二級種子（繁殖罐）→發(fā)酵

一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數鏈霉素：四級發(fā)酵一級種子→二級種子→三級種子→發(fā)酵3、發(fā)酵級數的確定谷氨酸：二級發(fā)酵搖瓶→一級種子（小罐）→發(fā)酵級數確定的依據

級數受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響

級數大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。

在發(fā)酵產品的放大中，反應級數的確定是非常重要的一個方面發(fā)酵級數確定的依據級數受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的4、接種量的確定

移入種子的體積接種量＝—————————

接種后培養(yǎng)液的體積過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數抗生素為7-15%。但是一般認為大一點好。雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。

P1474、接種量的確定移入種子的5、種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結果定。接種種齡對堿性蛋白酶產生的影響接種量對堿性蛋白酶產生的影響5、種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵6、溫度大多數微生物的最適生長溫度：25~37℃不同生長階段的微生物對溫度的反應不同。原則：延遲期處于最適生長溫度，對數生長期略低于最適生長溫度，后期主要決定于溶解氧。Q10:在生物學范圍內，溫度每升高10℃，生長速度加快1倍。6、溫度