連續(xù)培養(yǎng)的基本原理

第六章連續(xù)培養(yǎng)的基本原理

第1頁，共79頁。第一節(jié)微生物生長動(dòng)力學(xué)微生物生長動(dòng)力學(xué)是研究微生物生長過程的速率及其影響速率的因素，從而獲得相關(guān)信息。

第2頁，共79頁。一、生長現(xiàn)象與繁殖方式

根據(jù)微生物的個(gè)體形態(tài)、群體形態(tài)、生理特征、生化反應(yīng)等生物學(xué)特征，微生物可分為三大類：Ⅰ、非細(xì)胞型微生物（病毒）；Ⅱ、原核細(xì)胞型微生物，僅有原始細(xì)胞核，如細(xì)菌、放線菌等；Ⅲ、真核細(xì)胞型微生物，霉菌、酵母菌和單細(xì)胞藻類，原生動(dòng)物。

第3頁，共79頁。表1微生物的生長現(xiàn)象與繁殖方式類別生長特征繁殖方式細(xì)菌個(gè)體增重和增大

分裂繁殖放線菌、霉菌菌絲伸長和分支霉菌----無性孢子、有性孢子酵母菌個(gè)體增重和增大

出芽生殖放線菌----無性孢子第4頁，共79頁。二、微生物生長的測定

微生物的生長和產(chǎn)物的生成有著密切的關(guān)系，因此生長的測定對發(fā)酵的控制很重要。微生物生長的測定，通常是測群體的重量或細(xì)胞數(shù)，而不是測細(xì)胞個(gè)體的重量或大小。生長測定常用理化方法，分為測定細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞重量兩類。第5頁，共79頁。1、計(jì)數(shù)法

濁度計(jì)比濁法測定稀的細(xì)胞懸液的透光量，間接測出細(xì)胞數(shù)量的生長。計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)器直接數(shù)出酵母菌或霉菌孢子數(shù)目，以及用細(xì)菌計(jì)數(shù)片直接測出細(xì)菌數(shù)的生長。第6頁，共79頁。2、測定細(xì)胞重量

細(xì)胞干重稱量法直接測定單位體積培養(yǎng)物的細(xì)胞干重，由此代表菌體細(xì)胞物質(zhì)總量。細(xì)胞堆積容積測量法

（離心壓縮細(xì)胞體積法）用刻度錐形管測量經(jīng)離心的細(xì)胞沉淀物的容積，由此間接表示細(xì)胞重量。細(xì)胞組成分析法測定一種大分子的細(xì)胞組成(如蛋白質(zhì)、RNA、DNA等)，間接算出細(xì)胞的重量。

第7頁，共79頁。營養(yǎng)物消耗分析法測定培養(yǎng)基中不用于合成代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)物（磷酸鹽、硫酸鹽等）的消耗，由此間接表示生長的細(xì)胞重量。產(chǎn)物重量分析法測定培養(yǎng)中間形成的二氧化碳，氫，ATP等產(chǎn)物，由此間接換算出生長的細(xì)胞重量。第8頁，共79頁。三、微生物生長動(dòng)力學(xué)微生物不能調(diào)節(jié)自身的溫度，每種微生物都有它的生長最適溫度，以及最適pH、無機(jī)鹽濃度和糖濃度等。第9頁，共79頁。1、微生物生長曲線

細(xì)胞的生長過程可以用細(xì)胞濃度的變化來描述和表達(dá)。若取細(xì)胞濃度的對數(shù)值與細(xì)胞生長時(shí)間對應(yīng)作圖，可得到分批培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞濃度變化曲線。第10頁，共79頁。

在培養(yǎng)成分一定時(shí)，微生物的生長一般分五個(gè)階段

遲緩期（適應(yīng)期）對數(shù)生長期減速期靜止期（平衡期）衰退期（死亡期）第11頁，共79頁。（1）遲緩期延遲期系指培養(yǎng)基接種后，細(xì)胞濃度在一段時(shí)間內(nèi)無明顯增加的這一階段。它是細(xì)胞在環(huán)境改變后表現(xiàn)出來的一個(gè)適應(yīng)階段。如果新培養(yǎng)基中含有較豐富的某種營養(yǎng)物質(zhì)，而在老環(huán)境中則缺乏這種物質(zhì)，細(xì)胞在新環(huán)境中就必須合成有關(guān)的酶來利用該物質(zhì)，從而表現(xiàn)出延遲期。第12頁，共79頁。（2）對數(shù)生長期在此階段中，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)較充分，細(xì)胞的生長不受限制，細(xì)胞濃度隨時(shí)間呈指數(shù)生長。由于在此階段，細(xì)胞分裂繁殖最為旺盛，生理活性最高。因此在工業(yè)微生物反應(yīng)中，常轉(zhuǎn)接處于指數(shù)生長期中期的細(xì)胞，以保證轉(zhuǎn)接后細(xì)胞能迅速生長，微生物反應(yīng)能快速進(jìn)行。第13頁，共79頁。（3）減速期減速期的存在是由于當(dāng)細(xì)胞大量生長后，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，加上有害代謝物質(zhì)的積累，細(xì)胞的生長速率開始減緩，從而進(jìn)入減速期。

第14頁，共79頁。（4）平衡期平衡期是由于營養(yǎng)物質(zhì)已耗盡或有害物質(zhì)的大量積累，使細(xì)胞濃度不再增加。平衡期內(nèi)的細(xì)胞濃度為最大濃度。

第15頁，共79頁。（5）衰退期衰亡期是由于環(huán)境惡化，細(xì)胞開始死亡，活細(xì)胞濃度下降，細(xì)胞生長速率為負(fù)值。

第16頁，共79頁。2、微生物生長動(dòng)力學(xué)

微生物生長動(dòng)力學(xué)可反映出細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境變化的能力。這也是我們學(xué)習(xí)研究生長動(dòng)力學(xué)的原因。

第17頁，共79頁。(1)比生長速率微生物生長的特點(diǎn)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目或細(xì)胞物質(zhì)（量）增加一倍所需要的時(shí)間。如果細(xì)胞物質(zhì)或細(xì)胞數(shù)增長一倍的時(shí)間間隔是常數(shù)，則微生物是以指數(shù)速度增長，可用數(shù)學(xué)模型來描述。

：比生長速率

：比生長速率X：細(xì)胞濃度(g/L)

N：每升細(xì)胞數(shù)第18頁，共79頁。上式表明細(xì)胞物質(zhì)隨時(shí)間而增加或細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間增加而增加。大多數(shù)情況下生長是以物質(zhì)的增加來衡量的，因而符號μ得到應(yīng)用。μX為單位體積生長速率。

第19頁，共79頁。

若μ為常數(shù)，則：此式可在△t=td時(shí)求得，td即在X2=2X1時(shí)所需時(shí)間，

于是td=ln2/μ=0.693/μ

對上式積分得：

第20頁，共79頁。例5-1某微生物的μ＝0.125h-1

，求td。解：td=ln2/μ=0.693/0.125=5.544h

第21頁，共79頁。在微生物培養(yǎng)過程中，菌體濃度的生長速率是菌體濃度、基質(zhì)濃度和抑制劑濃度的函數(shù)，即dx/dt=f(X.S.I)以上兩式表明菌體濃度的增長速率與培養(yǎng)液中菌體濃度成正比。

第22頁，共79頁。比生長速率的意義：比生長速率就是菌體生長速率與培養(yǎng)基中菌體濃度之比，它與微生物的生命活動(dòng)有聯(lián)系。

在對數(shù)生長期，μ是一個(gè)常數(shù)，這時(shí)第23頁，共79頁。

（2）無抑制的細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)

——Monod方程

現(xiàn)代細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)的奠基人Monod在1942年便指出，在培養(yǎng)基中無抑制劑存在的情況下，細(xì)胞的比生長速率與限制性基質(zhì)濃度的關(guān)系可用下式表示：第24頁，共79頁。該方程中為比生長速率(s-1)；為最大比生長速率(s-1，

min-1，h-1)，S為限制性基質(zhì)濃度(g/L)；Ks為飽和常數(shù)(g/L)，其值等于比生長速率為最大比生長速率一半時(shí)的限制性基質(zhì)濃度。

第25頁，共79頁。Monod方程是典型的均衡生長模型，其基本假設(shè)如下：①細(xì)胞的生長為均衡式生長，因此描述細(xì)胞生長的唯一變量是細(xì)胞的濃度；②培養(yǎng)基中只有一種基質(zhì)是生長限制性基質(zhì)，而其它組分為過量不影響細(xì)胞的生長；③細(xì)胞的生長視為簡單的單一反應(yīng)，細(xì)胞得率為一常數(shù)。第26頁，共79頁。細(xì)胞的比生長速率與限制性基質(zhì)濃度的關(guān)系S第27頁，共79頁。

當(dāng)限制性基質(zhì)濃度很低時(shí)，S<<

Ks，此時(shí)若提高限制性基質(zhì)濃度，可以明顯提高細(xì)胞的生長速率。此時(shí)有：細(xì)胞比生長速率與基質(zhì)濃度為一級動(dòng)力學(xué)關(guān)系。

第28頁，共79頁。

當(dāng)S>>Ks時(shí)，μ=μm，若繼續(xù)提高基質(zhì)濃度，細(xì)胞生長速率基本不變。此時(shí)細(xì)胞的比生長速率與基質(zhì)濃度無關(guān)，為零級動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。

第29頁，共79頁。將Monod方程式變?yōu)闉橹本€方程。不同的菌種，不同的培養(yǎng)基，Ks和是不同的。第30頁，共79頁。微生物限制生長基質(zhì)Ksμm（hr）大腸桿菌葡萄糖0.22/大腸桿菌乳糖0.58/啤酒酵母乳糖2.6~3.00.18啤酒酵母葡萄糖0.56/纖維素分解菌葡萄糖0.860.125固氮菌葡萄糖0.16~0.330.13青霉菌氧氣0.0070.35Ks和μm值隨菌種、限制性基質(zhì)種類的變化第31頁，共79頁。μm值基本接近，是同一個(gè)數(shù)量級。Ks和μm值不僅隨菌種而異，對不同的限制性基質(zhì)也不同。

Ks的意義：Ks越小，則S增加少許，μ增加很大，所以Ks越小，μ就越敏感。Ks可以表示菌體細(xì)胞與基質(zhì)親和力的關(guān)系。第32頁，共79頁。

Monod方程雖然表述簡單，但它不足以完整地說明復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，并且已發(fā)現(xiàn)它在某些情況下與實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符，因此人們又提出了另外一些方程。

第33頁，共79頁。（3）其他幾種生長速率方程式Tessier方程式（1942年）第34頁，共79頁。當(dāng)S很低時(shí)，

代入原式與Monod方程一樣。第35頁，共79頁。Contois方程式（1959年）：單位菌體消耗的基質(zhì)量。

此公式對污水處理很重要。第36頁，共79頁。Moser方程式（1958年）λ：經(jīng)驗(yàn)常數(shù)當(dāng)λ＝1時(shí)，上式就是Monod方程

第37頁，共79頁。單基質(zhì)限制的細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)模型第38頁，共79頁。3、營養(yǎng)物質(zhì)對生長的影響

所有營養(yǎng)物質(zhì)均存在一上限濃度，超過此限，反而會引起生長速率的下降。這種效應(yīng)稱為基質(zhì)抑制作用（高滲透壓作用）。另外，某些代謝產(chǎn)物也能抑制生長。其反應(yīng)方程式為：

Kp為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)；P為代謝產(chǎn)物濃度

第39頁，共79頁。

兩種或兩種以上的底物同時(shí)用于生長時(shí)，則可考慮用Monod式的形式表示各種底物與比生長速率的關(guān)系：第40頁，共79頁。帶有兩個(gè)生長期兩種碳源（S1和S2）的二次生長S1S2X第41頁，共79頁。第二節(jié)

連續(xù)培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)及

連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用第42頁，共79頁。一、連續(xù)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)按種類（設(shè)備）分：全混流反應(yīng)器活塞流反應(yīng)器全混流反應(yīng)器分為：恒化器恒濁器第43頁，共79頁。恒化器：

以某種必需營養(yǎng)作為生長限制基質(zhì)，通過控制流加速率造成適應(yīng)這種條件的細(xì)胞生長密度和生長速率，培養(yǎng)液中限制性底物濃度保持恒定。第44頁，共79頁。恒濁器：通過控制生長限制性基質(zhì)的流量維持恒定的菌體密度。第45頁，共79頁。1、單級恒化器的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)S：限制性底物濃度（g/L）X：菌體濃度（g/L）P：產(chǎn)物濃度（g/L）V：培養(yǎng)液體積（L）F：培養(yǎng)基體積流率（L/h）FFXSPXSPX0S0第46頁，共79頁。對菌體積累的細(xì)胞=(進(jìn)入-流出)的細(xì)胞+(生長-死亡)的細(xì)胞FFXSPXSPX0S0第47頁，共79頁。對限制性底物積累的底物=（進(jìn)入-流出）的底物-（生長+形成產(chǎn)物+維持代謝）消耗的底物FFXSPXSPX0S0第48頁，共79頁。對產(chǎn)物形成積累的產(chǎn)物=（生成-流出）的產(chǎn)物第49頁，共79頁。處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，由（）、（）和（）得：第50頁，共79頁。在只培養(yǎng)微生物的特定連續(xù)培養(yǎng)過程中，假定：無產(chǎn)物形成或形成很少，可忽略不計(jì)；維持代謝所消耗的的底物很少，可忽略不計(jì)。根據(jù)Monod方程第51頁，共79頁。當(dāng)D≧Dcrit時(shí)，X=0,P=0,恒化器內(nèi)無菌體與產(chǎn)物，這種現(xiàn)象稱為“洗出”，因此當(dāng)以生產(chǎn)菌體為目的時(shí)，不能在最高產(chǎn)率的稀釋率下操作，菌體容易洗出，應(yīng)降低D，操作也穩(wěn)定。第52頁，共79頁。rP,產(chǎn)物生產(chǎn)率QP,產(chǎn)物比生產(chǎn)率dP/dt=rP-DP穩(wěn)定狀態(tài)下，dP/dt=0rP=DP代謝產(chǎn)物濃度與產(chǎn)率第53頁，共79頁。若產(chǎn)物合成為非生長偶聯(lián)型，rP=QPX第54頁，共79頁。若產(chǎn)物合成為生長偶聯(lián)型第55頁，共79頁。若產(chǎn)物合成為部分生長偶聯(lián)型第56頁，共79頁。2、單級恒化器生產(chǎn)率與分批發(fā)酵生產(chǎn)率的比較連續(xù)培養(yǎng)的生產(chǎn)率為：P=DX（）將（）代入（），得第57頁，共79頁。連續(xù)培養(yǎng)的最大生產(chǎn)率對（）求一階導(dǎo)數(shù)并使其為零，計(jì)算出：第58頁，共79頁。連續(xù)培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞濃度、限制性基質(zhì)濃度、細(xì)胞生產(chǎn)率與稀釋率的關(guān)系第59頁，共79頁。Pc與Pb的比較（分批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)）第60頁，共79頁。實(shí)例以葡萄糖為限制性底物，連續(xù)培養(yǎng)大腸桿菌，在培養(yǎng)條件下測得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表：葡萄糖S（mg/L）稀釋率D（h-1）菌體X（mg/L）葡萄糖S（mg/L）稀釋率D（h-1）菌體X（mg/L）60.064271220.60434130.124341530.66422330.244171700.69430400.314382210.70390640.434222100.733521020.53427S0=0.968g/L第61頁，共79頁。由S/μ-S回歸方程，求得：μm=1.08h-1KS=0.103g/L將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)X、S代入（），求出不同X、S下的YX/S，取0.3≤D≤0.7之間的YX/S平均值，得：第62頁，共79頁。YX/SDPtYX/SDPt0.440.060.0260.520.600.2600.450.120.0520.520.660.2780.450.240.100.550.690.2970.470.310.1360.500.700.2770.470.430.1810.470.730.2570.490.530.226第63頁，共79頁。第64頁，共79頁。限制性基質(zhì)為碳源時(shí)，部分消耗的碳源作為能量供生命活動(dòng)，X偏低；N，S為限制性基質(zhì)，D較小時(shí)會積累多糖，脂肪等，X偏高；Mg,P,K為限制性基質(zhì)時(shí)，同上，但細(xì)胞內(nèi)這些物質(zhì)下降，YX/S增大，細(xì)胞濃度偏高；復(fù)合培養(yǎng)基時(shí)，情況復(fù)雜，隨著μ變化，限制性基質(zhì)會改變，X下降。連續(xù)培養(yǎng)結(jié)果與正常情況發(fā)生偏差第65頁，共79頁。3、帶有細(xì)胞在循環(huán)的單級恒化器X1S1V1FαF(1+α)FαFF1X2X1濃縮細(xì)胞CX1第66頁，共79頁。第67頁，共79頁。4、多級連續(xù)培養(yǎng)FS0X1S1V1FS1X2S2V2F2X物料平衡S物料平衡Fmentor1Fmentor（不補(bǔ)加）Fmentor2（補(bǔ)加）S’0F’0第68頁，共79頁。第69頁，共79頁。5、連續(xù)培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)的應(yīng)用確定最佳培養(yǎng)條件富集，選育特殊形狀菌種建立選擇性的培養(yǎng)環(huán)境生長速率不同的菌種在連續(xù)培養(yǎng)中的“去”“留”。第70頁，共79頁。在發(fā)酵生產(chǎn)中，一般所關(guān)心的問題是：如何獲得最大的生產(chǎn)強(qiáng)度；在怎樣的環(huán)境條件、生長速率下可取得最高的轉(zhuǎn)化率；控制什么限制性底物，在何種濃度水平下才能最大限度地避免其它副產(chǎn)物形成。確定最佳培養(yǎng)條件第71頁，共79頁。例如面包酵母的培養(yǎng)第72頁，共79頁。應(yīng)用獨(dú)特的限制性底物、培養(yǎng)的溫度、pH極端值、添加各種生長促進(jìn)或抑制物質(zhì)等，能夠建立起具有高度選擇性的培養(yǎng)環(huán)境。建立選擇性的培養(yǎng)環(huán)境第73頁，共79頁。生長速率不同的菌種在連續(xù)培養(yǎng)中的“去”“留”。μY＜μXμZ＞μxμW與S的濃度有關(guān)第74頁，共79頁。對于Y第75頁，共79頁。對于ZZ的積累導(dǎo)致導(dǎo)致S濃度的下降，建立新的平衡。第76頁，共79頁。D=0.25Dc時(shí)，比生長速率小于X；D=0.75Dc時(shí)，比生長速率大于X；