華中農(nóng)業(yè)大學博士論文答辯課件

博士論文答辯草魚核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-bindingoligomerizationdomain，NOD)基因和γ-干擾素相關(guān)基因(IFN-gammarelatedgene，IFN-γrel)的克隆及其表達

指導教師：彭克美教授聶品研究員答辯人：陳文欽

華中農(nóng)業(yè)大學動物科技-動物醫(yī)學學院

2010年5月30日答辯內(nèi)容五、課程學習及文章發(fā)表情況四、創(chuàng)新點及下步研究計劃二、草魚NOD基因三、草魚γ-干擾素相關(guān)基因一、研究

背景匯報

內(nèi)容1.概述以往為人們所熟知的PRRs主要是一些膜結(jié)合蛋白如甘露糖受體、To1l樣受體、CD14和清道夫受體等，主要識別胞外環(huán)境的微生物結(jié)構(gòu)成分。最近的研究發(fā)現(xiàn)，胞漿中也存在著識別細菌和病毒成分的PRRs——核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)蛋白。一、研究背景NOD家族的結(jié)構(gòu)示意圖NALP1NALP2-14NOD1NOD2CARDPYDNACHTNADLRRBIRADFIINDCIITAIPAFNAIPNOD3NOD4XNOD5一、研究背景3.NOD的識別作用已有研究表明，NOD1和NOD2是細胞內(nèi)細菌肽聚糖的感受器，能識別細菌肽聚糖(PGN)的降解產(chǎn)物。NOD1識別的最小結(jié)構(gòu)是革蘭氏陰性細菌的產(chǎn)物內(nèi)消旋二氨基庚二酸(meso-diaminopimelicacid,meso-DAP)；NOD2識別細菌的最基本結(jié)構(gòu)是PGN的胞壁酰二肽（muramyldipeptide，MDP）。MDP幾乎存在于所有細菌的PGN中，因此，NOD2既是G+細菌也是G-細菌的感受器。

一、研究背景

4.NOD蛋白的信號轉(zhuǎn)導在非活化狀態(tài)，NOD1、NOD2的LRR和NACHT結(jié)合保持分子處于折疊狀態(tài)。當NOD1和NOD2通過LRR和配體結(jié)合后可以打開，通過NACHT自身寡聚，NOD分子的CARD和下游RICK分子的CARD結(jié)構(gòu)域發(fā)生嗜同種結(jié)合，活化RICK。經(jīng)過復雜的磷酸化，活化NF-κB，誘導促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄以及抗菌肽的合成。一、研究背景NODs介導的信號傳導通路圖6.選題的目的與意義

盡管對哺乳動物胞內(nèi)模式識別受體在參與對細菌的識別、誘導炎癥反應的作用等方面進行了深入的研究，但國內(nèi)外對魚類NOD基因的研究僅有2篇報道。迄今為止，對魚類NOD基因的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的特征以及是否具有類似于哺乳動物的功能還是不清楚的。本論文擬通過對草魚NOD1和NOD2基因的克隆以及表達分析，旨在揭示魚類NOD基因的結(jié)構(gòu)與表達特征。同時該研究為進一步研究NODs基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

一、研究背景1.2gcNOD2:cDNA全長3130bp，編碼982個氨基酸；ORF為2949bp，編碼982氨基酸，5′-UTR為81bp，3′-UTR為103bp，C端LRR有7個串聯(lián)結(jié)構(gòu)域；N端有兩個CARD，結(jié)構(gòu)域在27-81、111-200；中間NACHT結(jié)構(gòu)域在271-441。二、gcNODs基因的克隆與表達分析二、gcNODs基因的克隆與表達分析2.gcNODs基因的基因組結(jié)構(gòu)974968171523241319996471895524175180484848484848484124grasscarpNOD11735611271765848484848484319266147108878919090511grasscarpNOD2草魚NOD1基因組全長9kb,由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成草魚NOD2基因組全長5kb,由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成二、gcNODs基因的克隆與表達分析3.gcNODs基因的內(nèi)含子相位12345678910gcNOD10122222222zfNOD10122222222hNOD10122222222gcNOD2012222222zfNOD2012222222hNOD2012222222表1.草魚、斑馬魚以及人NODs基因內(nèi)含子相位二、gcNODs基因的克隆與表達分析4.

gcNODs基因與其他物種NODs基因的氨基酸相同/相似性比較Full-lengthCARDsNACHTLRRszebrafishNOD181.3/86.773.1/75.692.5/95.488.2/94.9humanNOD150.2/70.938.4/54.758.0/73.057.9/78.5pigNOD151.1/71.534.9/52.358.6/74.757.9/76.9mouseNOD150.4/70.939.5/52.358.0/76.454.9/74.4Full-lengthCARDsNACHTLRRszebrafishNOD283.8/92.068.5/77.690.1/95.982.8/91.8humanNOD245.6/62.629.6/46.557.3/73.154.1/67.8pigNOD246.8/65.227.6/47.456.7/73.752.6/69.3mouseNOD247.0/64.728.5/48.459.6/74.353.0/67.0二、gcNODs基因的克隆與表達分析5.

gcNODs基因的分子進化樹二、gcNODs基因的克隆與表達分析6.

gcNODs基因在不同組織中的組成性表達二、gcNODs基因的克隆與表達分析*****8.

gcNODs基因在脂多糖刺激下的誘導型表達******二、gcNODs基因的克隆與表達分析******9.

gcNODs基因在PolyI:C刺激下的誘導型表達******二、gcNODs基因的克隆與表達分析11.

gcNOD1基因重組蛋白的表達與純化97.466.243.031.020.114.4二、gcNODs基因的克隆與表達分析11.

gcNOD1基因重組蛋白的表達與純化M1234567897.466.243.031.020.1二、gcNODs基因的克隆與表達分析13.小結(jié)（1）首次從魚類中克隆了NOD1和NOD2基因，氨基酸的排列、基因組結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子相位的分析都顯示了NOD1和NOD2在進化上具有很強的保守性；（2）熒光定量分析顯示草魚的NOD1和NOD2基因呈廣泛的組成性表達分布，在所檢測的組織中都可以檢測到表達；二、gcNODs基因的克隆與表達分析（3）來自革蘭氏陽性菌的PGN對草魚NOD1的表達在大多數(shù)組織中沒有顯著的作用；（4）在LPS刺激下，gcNOD1的誘導表達特征與gcNOD2相似；（5）polyI:C和病毒感染也能誘導gcNOD1和gcNOD2的表達。三、gcIFN-γrel基因的克隆與表達分析1.gcIFN-γrel基因的分子特點

IFN-γrel基因的cDNA包含861bp，其中5-UTR長39bp，ORF長504bp編碼167個氨基酸，3-UTR長316bp。3-UTR富含AT（75.2%），一個潛在的多腺苷酸加尾信號（AATAAA)位于poly[A]尾上游13bp。三、gcIFN-γrel基因的克隆與表達分析2.gcIFN-γrel基因與其他物種γ-干擾素與γ-干擾素相關(guān)基因同源性比較SpeciesAminoacididentity/similarity(%)CatfishIFN-γrel37.8/63.2ZebrafishIFN-γrel62.9/77.6CarpIFN-γrel50.0/71.9ZebrafishIFN-γ19.8/44.3GoldfishIFN-γ21.7/44CodIFN-γ20.6/44.3CatfishIFN-γ21.8/48.3CarpIFN-γ20.7/41.4FuguIFN-γ17.7/40.7TroutIFN-γ119.4/48.9TroutIFN-γ221.5/50.6SalmonIFN-γ21.9/52.8三、gcIFN-γrel基因的克隆與表達分析3.gcIFN-γrel基因與其他硬骨魚類γ-干擾素與γ-干擾素相關(guān)基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系三、gcIFN-γrel基因的克隆與表達分析4.gcIFN-γrel基因的組織表達三、gcIFN-γrel基因的克隆與表達分析5.gcIFN-γrel基因在脂多糖和PolyI:C刺激下的誘導性表達****LPS****polyI:C三、gcIFN-γrel基因的克隆與表達分析6.

PGN的刺激對草魚IFN-γrel、NOD1和NOD2表達的影響三、gcIFN-γrel基因的克隆與表達分析7.

gcIFN-γrel基因在呼腸孤病毒感染下的誘導型表達*******三、gcIFN-γrel基因的克隆與表達分析8.小結(jié)(1)序列分析顯示本研究所克隆的gcIFN-γrel基因是一個

與斑馬魚、鯰魚和鯉魚中IFN-γrel基因同源的基因，而不是那個早已存在的IFN-γ基因；(2)與哺乳類和鮭鱒的IFN-γ不同的是，從20條不同來源的草魚的序列分析顯示，gcIFN-γrel在它的內(nèi)含子中缺乏多態(tài)性微衛(wèi)星序列；三、gcIFN-γrel基因的克隆與表達分析(3)gcIFN-γrel呈廣泛的組成性表達；(4)聚肌胞甘酸(polyI:C)，一種模擬病毒雙鏈RNA而合成的dsRNA，能上調(diào)gcIFN-γrel基因的表達;(5)在所分析的四個組織中，gcIFN-γrel的表達規(guī)律與gcNOD2相一致；推測IFN-γ和IFN-γrel被細菌的產(chǎn)物PGN所激活可能是通過NOD2依賴的方式。四、創(chuàng)新點及下步研究計劃1.主要創(chuàng)新點

（1）首次從草魚中克隆了胞內(nèi)識別細菌的模式識別受體NOD1和NOD2基因的cDNA全長和基因組全長；（2）對草魚胞內(nèi)模式識別受體NOD1和NOD2從mRNA水平、蛋白水平及細胞水平進行了表達或定位分析；同時，首次研究了病毒的感染對細菌模式識別受體NOD1和NOD2基因表達的影響；（3）克隆了草魚IFN-γ相關(guān)基因的cDNA全長和基因組全長，并對該基因的表達規(guī)律進行研究；首次提出了草魚IFN-γ相關(guān)基因與NOD樣模式識別受體在發(fā)揮功能上存在相關(guān)性。2.下步研究計劃

（1）研究NOD樣模式識別受體對細菌成分的識別以及在病毒感染中的作用；（2）研究NOD樣模式識別受體在激活下游的NF-κB的信號通路的作用；（3）研究IFN-γ與NOD樣模式識別受體的協(xié)同作用。四、創(chuàng)新點及下步研究計劃五、課程學習及論文發(fā)表情況1.課程學習情況

學位課11個學分

非學位課3個學分共計14個學分2.發(fā)表論文情況ChenWQ(陳文欽),XuQQ,ChangMX,NieP,PengKM.Molecularcharacterizationandexpressionanalysisofnucle