生物活性測定法課件

生物活性測定法生物藥物分析測定方法重組人促紅素體內(nèi)生物學活性測定法(網(wǎng)織紅細胞法)

本法系依據(jù)人促紅素(EPO)可刺激網(wǎng)織紅細胞生成的作用，給小鼠皮下注射EPO后，其網(wǎng)織紅細胞數(shù)量隨EPO注射劑量的增加而升高。利用網(wǎng)織紅細胞數(shù)對紅細胞數(shù)的比值變化，通過劑量-反應平行線法檢測EPO體內(nèi)生物學活性。

試劑

(1)乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑稱取乙二胺四乙酸二鉀100mg，加生理氯化鈉溶液10ml溶解，混勻，使用時新鮮配制。

(2)稀釋液取0.1g牛血清白蛋白，加生理氯化鈉溶液溶解并稀釋至100ml，即得。測定法按低、中、高(如10IU／鼠、20IU／鼠、40IU／鼠)3個劑量組，分別給近交系6～8周齡小鼠(雌性BALB／c小鼠)或B6D2F1小鼠皮下注射EPO標準品及供試品溶液，每組至少4只，每鼠注射量為不大于0.5ml。在注射后的第4天從小鼠眼眶采血3～4滴，置于預先加入200ulEDTA-K2抗凝劑的采血管中。

取抗凝血，用全自動網(wǎng)織紅細胞分析儀計數(shù)每只小鼠血液中的網(wǎng)織紅細胞數(shù)對紅細胞總數(shù)的比值(Ret％)。按注射劑量(IU)對Ret％的量反應平行線測定法(二部附錄XIV)計算供試品體內(nèi)生物學活性。

本法系依據(jù)干擾素可以保護人羊膜細胞(WISH)免受水泡性口炎病毒(VSV)破壞的作用，用結(jié)晶紫對存活的WISH細胞染色，于波長570nm處測定其吸光度，可得到干擾素對WISH細胞的保護效應曲線，以此測定干擾素生物學活性。

干擾素生物學活性測定法(細胞病變抑制法)試劑(1)MEM或RPMIl640培養(yǎng)液取MEM或RPMI1640培養(yǎng)基粉末1袋(規(guī)格為1L)，加水溶解并稀釋至1000ml，加青霉素105IU和鏈霉素105IU，再加碳酸氫鈉2.1g，溶解后，混勻，除菌過濾，4℃保存。(2)完全培養(yǎng)液量取新生牛血清10ml，加MEM或RPMI1640培養(yǎng)液90ml。4℃保存。(3)測定培養(yǎng)液量取新生牛血清7ml，加MEM或RPMI1640培養(yǎng)液93ml。4℃保存。

(7)脫色液取無水乙醇50ml、乙酸0.1ml，加水稀釋至100ml。(8)PBS

取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121℃15分鐘滅菌。

測定法使WISH細胞在培養(yǎng)基中貼壁生長。按1︰2～1︰4傳代，每周2～3次．于完全培養(yǎng)液中生長。取培養(yǎng)的細胞棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2次后消化和收集細胞，用完全培養(yǎng)液配制成每lml含2.5×105～3.5×105個細胞的細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100ul。于37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)4～6小時。

然后棄去細胞培養(yǎng)板中的上清液，每孔加染色液50ul，室溫放置30分鐘后，用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100ul，室溫放置3～5分鐘?；靹蚝螅妹笜藘x以630nm為參比波長，在波長570nm處測定吸光度，記錄測定結(jié)果。試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序或四參數(shù)回歸計算法進行處理。并按下式計算試驗結(jié)果：

Ds×Es

供試品生物學活性(IU/m1)=Pr×Dr×Er式中：Pr為標準品生物學活性，IU／ml；

Ds為供試品預稀釋倍數(shù)；

Dr為標準品預稀釋倍數(shù)；

Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為標準品半效稀釋倍數(shù)。本法系根據(jù)在不同白介素-2(IL-2)的濃度下，其細胞依賴株CTLL-2細胞存活率不同，以此檢測IL-2的生物學活性。

重組人白介素-2生物學活性測定法(CTLL-2細胞/MTT比色法)試劑(1)RPMI1640培養(yǎng)液取RPMI1640培養(yǎng)基粉末1袋(規(guī)格為1L)，加水溶解并稀釋至1000ml，加青霉素105IU和鏈霉素105IU，再加碳酸氫鈉2.1g，溶解后，混勻，除菌過濾，4℃保存。(2)基礎培養(yǎng)液取新生牛血清(FBS)10ml，加RPMl1640培養(yǎng)液90ml。4℃保存。(3)完全培養(yǎng)液取基礎培養(yǎng)液100ml，加重組人自介素-2至終濃度400～800IU。4℃保存。(4)PBS

取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121℃15分鐘滅菌。(5)噻唑藍(MTT)溶液取MTT0.1g，加PBS溶解并稀釋成20ml，經(jīng)0.22pm濾膜過濾除菌。4℃避光保存。(6)裂解液

15％十二烷基硫酸鈉溶液，使用期限不得超過12個月。CTLL-2細胞應為偏酸性、略微渾濁液體，傳代后48～60小時用于重組人白介素-2生物學活性測定。

供試品溶液的制備將供試品按標示量復溶后，用基礎培養(yǎng)液稀釋成每lml約含200IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中。做2倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。每孔分別留50ul供試品溶液，棄去孔中多余溶液。以上操作在無菌條件下進行。測定法

CTLL-2細胞用完全培養(yǎng)液于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)至足夠量，離心收集CTLL-2細胞，用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，然后重懸于基礎培養(yǎng)液中配制成每lml含6.O×105個細胞的細胞懸液，置37℃、5％二氧化碳條件下備用。在加有標準品溶液和供試品溶液的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液50ul，于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)18～24小時。

Ds×Es

供試品生物學活性(IU/m1)=Pr×Dr×Er式中：Pr為標準品生物學活性，IU／ml；

Ds為供試品預稀釋倍數(shù)；

Dr為標準品預稀釋倍數(shù)；

Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為標準品半效稀釋倍數(shù)。本法系依據(jù)小鼠骨髓白血病細胞(NFS-60細胞)的生長狀況因重組人粒細胞刺激因子(G-CSF)生物學活性的不同而不同，以此檢測G-CSF的生物學活性。

重組人粒細胞刺激因子生物學活性測定法(NFS-60細胞／MTT比色法)(4)PBS

取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121℃15分鐘滅菌。(5)噻唑藍(MTT)溶液取MTT粉末0.10g，加入PBS20ml中，配制成每lml含5.0mg的溶液，經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌。4℃避光保存。(6)裂解液取鹽酸14ml、TritonX-100溶液50ml，加異丙醇，配制成500ml的溶液。室溫避光保存。

標準品溶液的制備取重組人粒細胞刺激因子生物學活性測定標準品按說明書復溶后，用基礎培養(yǎng)液稀釋至每lml含50～100IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中，進行2倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2個孔，每孔分別留50ul標準品溶液，棄去孔中多余溶液。以上操作在無菌條件下進行。

供試品溶液的制備將供試品按標示量復溶后，用基礎培養(yǎng)液稀釋成約每lml含50～100IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中，做2倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2個孔，每孔分別留50ul供試品溶液，棄去孔中多余溶液。以上操作在無菌條件下進行。

在加有標準品溶液和供試品溶液的96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入細胞懸液50ul于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)40～48小時。每孔加入MTT溶液20ul，于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)5小時。以上操作在無菌條件下進行。每孔加入裂解液100ul混勻后，放入酶標儀，以630nm為參比波長，于波長570nm處測是吸光度，記錄測定結(jié)果。試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序或四參數(shù)回歸計算法進行處理。并按下式計算結(jié)果：

Ds×Es

供試品生物學活性(IU/m1)=Pr×Dr×Er式中：Pr為標準品生物學活性，IU／ml；

Ds為供試品預稀釋倍數(shù)；

Dr為標準品預稀釋倍數(shù)；

Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為標準品半效稀釋倍數(shù)。本法系依據(jù)人紅細胞白血病細胞(簡稱TF-1細胞的生長狀況因重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)生物學活性的不同而不同，以此檢測GM-CSF的生物學活性。重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子生物學活性測定法(TF-1細胞／MTT比色法)試劑(1)RPMI1640培養(yǎng)液取RPMI1640培養(yǎng)基粉末1袋(規(guī)格為1L)，加水溶解并稀釋至1000ml，加青霉素105IU和鏈霉素105IU，再加碳酸氫鈉2.1g，溶解后，混勻，除菌過濾，4℃保存。(2)基礎培養(yǎng)液取新生牛血清100ml，加入RPMI1640培養(yǎng)液900ml中。4℃保存。(3)完全培養(yǎng)液基礎培養(yǎng)液加重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子至終濃度為每lml含5.0ng或每lml含80IU。

(4)PBS

取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121℃15分鐘滅菌。(5)噻唑藍(MTT)溶液取MTT粉末0.10g，加入PBS20ml中，配制成每lml含5.0mg的溶液，經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌。4℃避光保存。(6)裂解液取鹽酸14ml、TritonX-100溶液50ml，加異丙醇，配制成500ml的溶液。室溫避光保存。

標準品溶液的制備取重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子標準品按說明書復溶后，用基礎培養(yǎng)液稀釋至每lml含10～20IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中，進行2倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2個孔，每孔分別留50ul標準品溶液，棄去孔中多余溶液。以上操作在無菌條件下進行。

供試品溶液的制備將供試品按標示量復溶后，用基礎培養(yǎng)液稀釋成約每lml含10～20IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中，做2倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2個孔，每孔分別留50ul供試品溶液，棄去孔中多余溶液。以上操作在無菌條件下進行。測定法

TF-1細胞株用完全培養(yǎng)液于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)，控制細胞濃度為每1ml含2.0×105～7.0×105個細胞，傳代后24～36小時用于生物學活性測定。將試驗所用溶液預溫至37℃，取足量TF-1細胞培養(yǎng)物，離心并收集TF-1細胞，用基礎培養(yǎng)液洗滌3次，然后重懸于基礎培養(yǎng)液中配成每1ml含4.0×105個細胞的細胞懸液，置37℃?zhèn)溆?。向加有標準品溶液和供試品溶液?6孔細胞培養(yǎng)板中加入細胞懸液．每孔50ul，于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)48～52小時后，每孔加入MTT溶液20ul，于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)5小時．以上操作在無菌條件下進行。再向上述各孔加裂解液100ul，混勻后．放人酶標儀，以630nm為參比波長，于波長570nm處測定吸光度，記錄測定結(jié)果。試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序或四參數(shù)回歸計算法進行處理。并按下式計算結(jié)果：

Ds×Es

供試品生物學活性(IU/m1)=Pr×Dr×Er式中：Pr為標準品生物學活性，IU／ml；

Ds為供試品預稀釋倍數(shù)；

Dr為標準品預稀釋倍數(shù)；

Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為標準品半效稀釋倍數(shù)。本法系依據(jù)重組牛堿性成纖維細胞生長因子（BFGF）對小鼠胚胎成纖維細胞(Balb/c3T3細胞)的生長具有刺激作用，Balb/c3T3細胞的生長狀況因重組牛堿性成纖維細胞生長因子生物學活性的不同而不同，以此檢測重組牛堿性成纖維細胞生長因子的生物學活性。

重組牛堿性成纖維細胞生長因子生物學活性測定法(細胞增殖法／MTT比色法)試劑(1)RPMI1640培養(yǎng)液取RPMI1640培養(yǎng)基粉末1袋(規(guī)格為1L)，加水溶解并稀釋至1000ml，加青霉素105IU和鏈霉素105IU，再加碳酸氫鈉2.1g，溶解后，混勻，除菌過濾，4℃保存。(2)維持培養(yǎng)液取新生牛血清4ml，加RPMI1640培養(yǎng)液至1000ml。(3)完全培養(yǎng)液取新生牛血清100ml，加RPMI1640培養(yǎng)液至1000ml。(4)PBS

取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121℃15分鐘滅菌。(5)噻唑藍(MTT)溶液取MTT粉末0.10g，加入PBS20ml中，配制成每lml含5.0mg的溶液，經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌。4℃避光保存。標準品溶液的制備取重組牛堿性成纖維細胞生長因子標準品按說明書復溶后，用維持培養(yǎng)液稀釋至每lml含40IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2個孔。以上操作在無菌條件下進行。供試品溶液的制備供試品標示量復溶后，用基礎培養(yǎng)液稀釋成每lml約含40IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2個孔。以上操作在無菌條件下進行。

測定法

Balb/c3T3細胞株用完全培養(yǎng)液于37％、5％二氧化碳培養(yǎng)，控制細胞濃度為每lml含1.0×105～5.0×105個細胞，傳代后24～36小時用于生物學活性測定。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，消化并收集細胞，用完全培養(yǎng)液配成每lml含5.0×104～1.0×105個細胞的細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100ul。在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)。24小時后換成維持培養(yǎng)液。置37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)24小時。制備的細胞培養(yǎng)板棄去維持液，加入標準品溶液和供試品溶液，每孔100ul1。置37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)64～72小時。每孔加人MTT溶液20ul，于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)5小時。以上步驟在無菌條件下進行。棄去培養(yǎng)板中的液體后，向每孔中加入二甲基亞砜100ul，混勻后，放入酶標儀，以630nm為參比波長，于波長570nm處測定吸光度，記錄測定結(jié)果。試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序或四參數(shù)回歸計算法進行處理。并按下式計算結(jié)果：

Ds×Es

供試品生物學活性(IU/m1)=Pr×Dr×Er式中：Pr為標準品生物學活性，IU／ml；

Ds為供試品預稀釋倍數(shù)；

Dr為標準品預稀釋倍數(shù)；

Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為標準品半效稀釋倍數(shù)。本法系依據(jù)重組人表皮生長因子（EGF）對小鼠胚胎成纖維細胞(Balb／c3T3細胞)的生長具有刺激作用，Balb／c3T3細胞的生長狀況因重組人表皮生長因子生物學活性的不同而異，以此檢測重組人表皮生長因子的生物學活性。重組人表皮生長因子生物學活性測定法

(細胞增殖法／MTT比色法)試劑(1)RPMI1640培養(yǎng)液取RPMI1640培養(yǎng)基粉末1袋(規(guī)格為1L)，加水溶解并稀釋至1000ml，加青霉素105IU和鏈霉素105IU，再加碳酸氫鈉2.1g，溶解后，混勻，除菌過濾，4℃保存。(2)維持培養(yǎng)液取新生牛血清4ml，加RPMI1640培養(yǎng)液至1000ml。(3)完全培養(yǎng)液取新生牛血清100ml，加RPMI1640培養(yǎng)液至1000ml。(4)PBS

取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121℃15分鐘滅菌。(5)噻唑藍(MTT)溶液取MTT粉末0.10g，加入PBS20ml中，配制成每lml含5.0mg的溶液，經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌。4℃避光保存。標準品溶液的制備取重組人表皮生長因子標準品按說明書復溶后，用維持培養(yǎng)液稀釋至每lml含50IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個濃度做2個孔。以上操作在無菌條件下進行。

供試品溶液的制備將供試品按標示量復溶后，用維持培養(yǎng)液稀釋成每lml約含50IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個濃度做2個孔。以上操作在無菌條件下進行。

測定法

Balb／c3T3細胞株用完全培養(yǎng)液于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)，控制細胞濃度為每lml含1.0×105～5.0×105個細胞，傳代后24～36小時用于生物學活性測定。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，消化和收集細胞，用完全培養(yǎng)液配成每lml含5.0×104～8.0×104個細胞的細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100ul。在37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)。24小時后換成維持培養(yǎng)液。置37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)24小時。制備的細胞培養(yǎng)板棄去維持液，加標準品溶液和供試品溶液，每孔100ul。置37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)64～72小時。每孔加入MTT溶液20ul，于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)5小時。以上操作在無菌條件下進行。棄去培養(yǎng)板中的液體后，向每孔中加入二甲基亞砜(DMSO)100ul，混勻后在酶標儀上，以630nm為參比波長，于波長570nm處測定吸光度，記錄測定結(jié)果。

試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序或四參數(shù)回歸計算法進行處理。并按下式計算結(jié)果：

Ds×Es

供試品生物學活性(IU/m1)=Pr×Dr×Er式中：Pr為標準品生物學活性，IU／ml；

Ds為供試品預稀釋倍數(shù)；

Dr為標準品預稀釋倍數(shù)；

Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋倍數(shù)；Er為標準品半效稀釋倍數(shù)。本法系用人凝血因子Ⅷ缺乏血漿為基質(zhì)血漿，采一用期法測定供試品人凝血因子Ⅷ效價。試劑(1)3.8％枸櫞酸鈉溶液取無水枸櫞酸鈉9.5g，加水溶解并稀釋至250ml。人凝血因子Ⅷ效價測定法(一期法)

(2)咪唑緩沖液(pH7.3)取咪唑0.68g和氯化鈉1.17g，加水使溶解成100ml，加入0.1mol/L鹽酸溶42.2ml，再加水稀釋至200ml，即得。(3)稀釋液取1體積的3.8％枸櫞酸鈉加入5體積咪唑緩沖液混合，加適量20％人血白蛋白至終濃為1％。

(4)激活的部分凝血活酶(APTT)試劑

(5)人凝血因子Ⅷ缺乏血漿為人凝血因子Ⅷ含量低于1％的人血漿或人工基質(zhì)血漿。

(6)0.05mol/L氯化鈣溶液取氯化鈣(CaCl2·2H2O)147g，加水溶解并稀釋至1000ml，配制成lmol氯化鈣貯存液，用前用水稀釋20倍，配制成0.05mol/L氯化鈣溶液。

人凝血因子Ⅷ標準溶液的制備用人凝血因子Ⅷ缺乏血漿將標準品稀釋成每1ml含1IU凝血因子Ⅷ，再用稀釋液分別進行10倍、20倍、40倍和80倍稀釋，置冰待用。供試品溶液的制備用人凝血因子Ⅷ缺乏血漿將供品稀釋成每lml約含1IU凝血因子Ⅷ，再用稀釋液進10倍和20倍或40倍稀釋，置冰浴待用。測定法取激活的部分凝血活酶試劑0.1ml，置37℃水浴保溫一定時間(一般4分鐘)，加人凝血因子Ⅷ缺乏血漿0.1ml、供試品溶液0.lml，混勻，置37％水浴保溫一定時間(一般5分鐘)，加已預熱至37℃0.05mol/L氯化鈣溶液0.1ml，記錄凝固時間。用不同稀釋度的人凝血因子Ⅷ標準溶液0.1ml替代供試品溶液，同法操作。將標準溶液人凝血因子Ⅷ效價(IU/ml)的對數(shù)對其相應的凝固時間(秒)的對數(shù)進行直線回歸處理，求出直線回歸方程。計算供試品溶液人凝血因子Ⅷ效價，再乘以稀釋倍數(shù)，即為供試品人凝血因子Ⅷ效價(IU/ml)。本法系依據(jù)綿羊紅細經(jīng)醛化和鞣酸化處理后，具有較強的吸附蛋白質(zhì)的能力，能將白喉類毒素吸附于紅細胞表面上，若遇到供試品中相應抗體，會發(fā)生抗原抗體結(jié)合，產(chǎn)生特異性凝集，通過比較凝集反應終點測定供試品中白喉抗體效價。

人免疫球蛋白中白喉抗體效價測定法

試劑(1)1％兔血清生理氯化鈉溶液無菌采集兔全血，分離血清，置56℃30分鐘滅能。取0.5ml兔血清加49.5ml生理氯化鈉溶液，混勻。(2)白喉抗體診斷紅細胞懸液用1％兔血清生理氯化鈉溶液復溶凍干白喉抗體診斷紅細胞至5％懸液。白喉抗體標準品溶液的制備用1％兔血清生理氯化鈉溶液將白喉抗體標準品稀釋至每lml含0.2HAU。

供試品溶液的制備用1％兔血清生理氯化鈉溶液將供試品稀釋4倍。測定法在UV型血凝板上，用1％兔血清生理氯化鈉溶液將供試品溶液做2倍系列稀釋，每孔留25ul，再向每孔加25ul白喉抗體診斷紅細胞懸液，置振蕩器混勻30～60秒，放濕盒內(nèi)37℃結(jié)和1小時。在UV型血凝板上，用1％兔血清生理氯化鈉溶液將白喉抗體標準品溶液做2倍系列稀釋，每孔留25ul，同上法操作。

在UV型血凝板上，加1％兔血清生理氯化鈉溶液25ul，自“再向每孔加25ul白喉抗體診斷紅細胞懸液”起，同法操作，為陰性對照。陰性對照孔呈典型的“-”，否則試驗不成立，應重試。以出現(xiàn)“++”為判定終點。按下式計算供試品白喉抗體效價：

供試品白喉抗體效價(HAU/g)=

E×DF式中：E為出現(xiàn)“++”的最高稀釋倍數(shù)的標準品的白喉抗體效價，HAU/ml；D為出現(xiàn)“++”的供試品的最高稀釋倍數(shù)；

F為靜注人免疫球蛋白供試品IgG含量(g/m1)；或人免疫球蛋白供試品蛋白含量(g/m1)。判定標準“-”紅細胞集中在孔底中央，呈一邊緣光滑致密的小紅點；“+”大部分紅細胞沉于孔底中央，周圍有少量的紅細胞；“++”紅細胞部分凝集，孔底中央有一疏松的小紅圈；“+++”大部分紅細胞凝集呈均勻分布，孔底中央有很弱的小紅圈；“++++”紅細胞凝集呈均勻分布。本法系依據(jù)抗人T細胞免疫球蛋白與人淋巴細胞結(jié)合，在補體存在下破壞淋巴細胞，根據(jù)淋巴細胞死亡率測定供試品抗人T細胞免疫球蛋白效價。

抗人T細胞免疫球蛋白效價測定法(淋巴細胞毒試驗)試劑(1)淋巴細胞分離液(Ficoll’s)(2)Hank’s液(3)20％胎牛血清Hank’s液試驗當天取適量經(jīng)消毒保存的Hank’