高效液相色譜儀使用與操作規(guī)程(學(xué)生用)課件

高效液相色譜儀

使用與操作規(guī)程Agilent1100HPLC第一步第二步第三步第四步準(zhǔn)備開機(jī)

注意事項(xiàng)

清潔關(guān)機(jī)

步驟Agilent1100系統(tǒng)組成本系統(tǒng)由溶劑輸送泵（四元泵，標(biāo)配真空脫氣機(jī)）Rheodyne7725i手動進(jìn)樣閥柱溫箱VWD紫外-可見檢測器Agilent1100色譜數(shù)據(jù)工作站和電腦等組成，另外還包括打印機(jī)、不間斷電源等輔助設(shè)備。接通電源，依次開啟不間斷電源、真空脫氣機(jī)、四元泵、檢測器，待泵和檢測器自檢結(jié)束后，打開電腦顯示器、主機(jī)，最后打開色譜工作站。第二步、開機(jī)一）參數(shù)設(shè)定1、波長設(shè)定：2、流速設(shè)定：3、流動相比例設(shè)定：4、梯度設(shè)定：

二）更換流動相并排氣泡1：

將吸濾器放入裝有準(zhǔn)備好的流動相的儲液瓶中；2：順時(shí)針轉(zhuǎn)動泵的排液閥180°，打開排液閥；3：運(yùn)行泵，泵以3ml/min的流速沖洗5min（可設(shè)定）后泵流速設(shè)為0ml/min；4：將排液閥逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)適度擰緊，關(guān)閉排液閥。5：如管路中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。三）平衡系統(tǒng)用檢驗(yàn)方法規(guī)定的流動相沖洗系統(tǒng)，一般最少需6倍柱體積的流動相。檢查各管路連接處是否漏液，如漏液應(yīng)予以排除。觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動應(yīng)不超過1MPa。如超過則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按檢查管路后再操作。觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移<0.01mV/min，噪聲為<0.001mV時(shí)，可認(rèn)為系統(tǒng)已達(dá)到平衡狀態(tài)，可以進(jìn)樣。五）譜圖的判斷及結(jié)果計(jì)算1、系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：

①分離度：一般應(yīng)≥1.5。②重復(fù)性：兩次譜圖的峰面積應(yīng)相差不的過1%。

③理論塔板數(shù)：應(yīng)≥規(guī)定的理論塔板數(shù)目。

④拖尾因子：0.95＜T＜1.05

⑤保留時(shí)間：對照與樣品的主成分保留時(shí)間應(yīng)大致一致。⑥RSD：精密度＜3%。2、結(jié)果計(jì)算①外標(biāo)法：

②內(nèi)標(biāo)法：第四步、注意事項(xiàng)二、樣品1、采用過濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒；2、用流動相或比流動相弱（若為反相柱，則極性比流動相大；若為正相柱，則極性比流動相?。┑娜軇┲苽錁悠啡芤海M量用流動相制備樣品液；3、手動進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量盡量小，使用定量管定量時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)為定量管的3～5倍；一、流動相1、流動相應(yīng)選用色譜純試劑、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過濾后使用，過濾時(shí)注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍；2、水相流動相需經(jīng)常更換（一般不超過2天），防止長菌變質(zhì)；3、使用雙泵時(shí)，A、B、C、D四相中，若所用流動相中有含鹽流動相，則A、D（進(jìn)液口位于混合器下方）放置含鹽流動相，B、C（進(jìn)液口位于混合器上方）放置不含鹽流動相；A、B、C、D四個(gè)儲液器中其中一個(gè)為棕色瓶，用于存放水相流動相。第四步、注意事項(xiàng)四、操作過程1、開機(jī)操作：（1）、打開電源，用Harb相連接時(shí)，注意Harb電源，打開計(jì)算機(jī)，打開BootpServer（一般啟動時(shí)已打開）；（2）、自上而下打開個(gè)組件電源，BootpServer里顯示有信號時(shí)（有六行字符），打開工作站（先打開Online）；（3）、打開沖洗泵頭的10％異丙醇溶液的開關(guān)（需用針捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量為準(zhǔn)；（4）、注意各流動相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于最低限會自動停泵，注意洗泵溶液的體積，及時(shí)加液；（5）、使用過程中要經(jīng)常觀察儀器工作狀態(tài)，及時(shí)正確處理各種突發(fā)事件。第四步、注意事項(xiàng)2、先以所用流動相沖洗系統(tǒng)一定時(shí)間（如所用流動相為含鹽流動相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動相），正式進(jìn)樣分析前30min左右開啟D燈或W燈，以延長燈的使用壽命；3、建立色譜操作方法，注意保存為自己命名的Method，勿覆蓋或刪除他人的方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

4、使用手動進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，在進(jìn)樣前和進(jìn)樣后都需用洗針液洗凈進(jìn)樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進(jìn)樣前必須用樣品液清洗進(jìn)樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡；5、溶劑瓶中的沙芯過濾頭容易破碎，在更換流動相時(shí)注意保護(hù)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過濾頭變臟或長菌時(shí)，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；第四步、注意事項(xiàng)6、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個(gè)管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過程中關(guān)閉D燈、W燈；7、關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)閉泵、檢測器等，再關(guān)閉工作站，然后關(guān)機(jī)，最后自下而上關(guān)閉色譜儀各組件，關(guān)閉洗泵溶液的開關(guān)；8、使用者須認(rèn)真履行儀器使用登記制度，出現(xiàn)問題及時(shí)向老師報(bào)告，不要擅自拆卸儀器。未經(jīng)操作培訓(xùn)，不得擅自使用儀器。第四步、注意事項(xiàng)四、使用經(jīng)驗(yàn)交流（1）1、流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜過濾)。2、流動相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。3、不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。4、使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上。第四步、注意事項(xiàng)四、使用經(jīng)驗(yàn)交流（2）5.長時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)，因?yàn)榧兯组L霉。6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑(如甲醇)等清洗進(jìn)樣器。7.C18柱絕對不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗。清洗方法：①以異丙醇作溶劑沖洗；②放在異丙醇中間用超聲波清洗；③用10％稀硝酸清洗。

高效液相色譜儀

中常遇見的問題及處理方法一、保留時(shí)間變化1.柱溫變化2.等度與梯度間未能充分平衡3.緩沖液容量不夠4.柱污染5.柱內(nèi)條件變化6.柱快達(dá)到壽命1.柱恒溫2.至少用10倍柱體積的流動相平衡柱3.用>25mmol/L的緩沖液4.每天沖洗柱5.穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動相6.采用保護(hù)柱三、保留時(shí)間延長1.流速下降2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化3.鍵合相流失4.流動相組成變化5.溫度降低1.管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡2.用流動相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱3.流動相PH值保持在3～7.5檢查柱的方向4.防止流動相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫四、出現(xiàn)肩峰或分叉1.樣品體積過大2.樣品溶劑過強(qiáng)3.柱塌陷或形成短路通道4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效5.進(jìn)樣器損壞1.用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%2.采用較弱的樣品溶劑3.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5.更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子六、基線噪聲

1.氣泡(尖銳峰)2.污染(隨機(jī)噪聲)3.檢測器燈連續(xù)噪聲4.電干擾(偶然噪聲)5.檢測器中有氣泡1.流動相脫氣,加柱后背壓2.清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑3.更換氘燈4.采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)5.流動相脫氣,加柱后背壓七、峰拖尾

1.柱超載2.峰干擾3.硅羥基作用4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效5.柱塌陷或形成短路通道6.死體積或柱外體積過大7.柱效下降1.降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相2.清潔樣品,調(diào)整流動相3.加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,鈍化樣品4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件6.連接點(diǎn)降至最低,對所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管7.用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱八、峰展寬

1.進(jìn)樣體積過大2.在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢4.檢測器時(shí)間常