體內(nèi)藥物分析-第一章1課件

體內(nèi)藥物分析---第一章主講:胡芳弟

1第一章緒論第1節(jié)體內(nèi)藥物分析的重要性及與其他學(xué)科的關(guān)系第2節(jié)體內(nèi)藥物分析的對象、任務(wù)與特點(diǎn)第3節(jié)體內(nèi)藥物分析方法的基本要求第4節(jié)生物樣品分析方法的建立與驗(yàn)證

2一、體內(nèi)藥物分析的重要性為了達(dá)到藥物在臨床上的使用安全、合理和有效，越來越要求人們了解和提供藥物在體內(nèi)的更多信息，即需要對藥物及其制劑的體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過程、作用機(jī)制及藥物效應(yīng)進(jìn)行研究，因而促使藥物動力學(xué)、生物藥劑學(xué)、臨床藥理學(xué)等一些新興邊緣學(xué)科的發(fā)展與建立。第1節(jié)3通過體內(nèi)藥物分析的現(xiàn)代分離、分析定量手段，可獲得藥物在體內(nèi)的各種藥物動力學(xué)參數(shù)和吸收、分布、代謝和排泄信息等；獲得藥物在體液或組織中的有效濃度，科學(xué)地評價(jià)藥物及其制劑在體內(nèi)過程中的內(nèi)在質(zhì)量；根據(jù)血藥濃度設(shè)計(jì)給藥方案，以便更好地解決藥物使用過程的個(gè)體差異，使臨床用藥趨向于更加安全、合理和有效。因此，在1979年的《治療藥物監(jiān)護(hù)》雜志創(chuàng)刊號中指出：“歷史必將證明體液中藥物濃度的定量技術(shù)是藥理學(xué)最大進(jìn)展之一。

5不言而喻，臨床藥理學(xué)的深入研究與發(fā)展，離不開體內(nèi)藥物分析的現(xiàn)代分離、分析的定量技術(shù)，離不開體液或組織中藥物分布數(shù)量的定量測定。目前隨著藥物體內(nèi)過程的研究工作和藥物代謝物分離測定工作逐漸成為新藥開發(fā)中最重要的基礎(chǔ)工作時(shí),體內(nèi)藥物分析學(xué)科已與藥物代謝動力學(xué)和臨床藥理學(xué)互相關(guān)聯(lián)、密不可分。

6二、體內(nèi)藥物分析與其他學(xué)科的關(guān)系體內(nèi)藥物分析是隨著藥物動力學(xué)、生物藥劑學(xué)、臨床藥理學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展而興起的。體內(nèi)藥物分析興起與發(fā)展的同時(shí)又促進(jìn)了這些新興邊緣學(xué)科的發(fā)展，因此它們之間的關(guān)系是非常密切的。7

(一)與藥物動力學(xué)及生物藥劑學(xué)的關(guān)系藥物動力學(xué)(pharmacokinetics)是研究藥物及其代謝物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄等過程的量-時(shí)變化或血藥濃度隨時(shí)間變化的動態(tài)規(guī)律的一門新學(xué)科。利用體內(nèi)藥物分析技術(shù)，定量地測定血藥濃度或尿藥濃度，根據(jù)動力學(xué)原理和數(shù)學(xué)分析方法，求出一系列動力學(xué)參數(shù)和藥物制劑的生物利用度參數(shù)，以更科學(xué)的方法來評價(jià)藥物及其制劑的內(nèi)在質(zhì)量，對指導(dǎo)臨床合理用藥，確保臨床用藥的安全性和有效性等方面具有重要意義。

8(二)與臨床藥理學(xué)的關(guān)系臨床藥理學(xué)(clinicalpharmacology)是近年來獲得飛速發(fā)展的一門新興學(xué)科，重點(diǎn)研究藥效學(xué)、毒副反應(yīng)的性質(zhì)和機(jī)制，以及藥物相互作用機(jī)制等。由于臨床藥理學(xué)是研究人體和藥物之間的相互作用關(guān)系與規(guī)律，團(tuán)此需研究藥物進(jìn)人體內(nèi)對人體生理與生化機(jī)能影響和臨床效應(yīng)，以及藥物的作用原理；研究藥物在正常人與患者體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律；研究藥物可能發(fā)生的毒副反應(yīng)、過敏和繼發(fā)性反應(yīng)等。這些研究的基礎(chǔ)需要了解藥物在體內(nèi)各種體液和組織中存在的數(shù)量與質(zhì)量。因此，準(zhǔn)確測定人體內(nèi)藥物分布、存在的數(shù)量與質(zhì)量，仍是體內(nèi)藥物分析學(xué)科研究的重點(diǎn)。10為進(jìn)一步提高這些藥物的臨床治療有效水平，目前最科學(xué)的給藥方案是通過血藥濃度監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)給藥方案個(gè)體化、使血藥濃度維持在安全、有效的水平。由此可見，臨床藥物治療學(xué)的研究與開展，需要血藥濃度監(jiān)測，而血藥濃度數(shù)據(jù)的獲得，則需要體內(nèi)藥物分析的現(xiàn)代分離分析技術(shù)，常用的方法有高效液相色譜法(HPLC)、熒光偏振免疫法(FPLA)、酶免疫法(ELISA)。

123.個(gè)體差異大、具有遺傳種族差異的藥物。4.同一種藥物因治療目的的不同，血藥濃度范圍不同，如水楊酸用于鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕、抗炎時(shí)，其劑量和血藥濃度相差較大。5.在治療劑量范圍內(nèi)，具有非線性動力學(xué)特性的藥物，如苯妥英等。6.需要長期用藥的病人，如抗精神病藥，抗癲癇藥等。147.了解病人服藥依從性。8.合并用藥時(shí)，藥物的相互作用。9.常規(guī)劑量時(shí)出現(xiàn)的毒副反應(yīng)。10.病人肝腎功能損傷時(shí)。11.藥物過量中毒。12.需要調(diào)整劑量或改變藥物劑型時(shí)。

15類別藥名抗癲癇藥苯妥英*酰胺咪嗪苯巴比妥撲癇酮乙琥胺丙戊酸抗心律失常藥利多卡因奎尼丁*普魯卡因胺異丙吡胺普萘洛爾（心得安）強(qiáng)心藥地高辛*抗哮喘藥茶堿*三環(huán)類抗抑郁藥阿米替林去甲阿米替林丙咪嗪去甲丙咪嗪抗躁狂癥藥鋰*氨基苷類抗生素慶大霉素*鏈霉素丁胺卡那霉素妥布霉素卡那霉素其他抗生素氯霉素抗腫瘤藥甲氨喋呤*免疫抑制劑環(huán)孢霉素有“*”號者，為最需要監(jiān)測的藥物

16表1-1目前認(rèn)為進(jìn)行TDM有意義的藥物表1-1列出了26種血藥濃度監(jiān)測的藥物，下面舉例說明TDM在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用及意義。Eap等用場放大樣品富集技術(shù)（Field-AmplifiedSampleStacking,FASS）對血樣中的四環(huán)類抗抑郁藥物進(jìn)行富集，測定了米安色林(mianserin)、去甲米安色林、8-羥基米安色林及其對映體的血藥濃度。17第2節(jié)體內(nèi)藥物分析的對象、任務(wù)與特點(diǎn)

一、體內(nèi)藥物分析的對象

體內(nèi)藥物分析，是通過分析手段了解藥物在體內(nèi)數(shù)量與質(zhì)量的變化，獲得各種藥物動力學(xué)參數(shù)、代謝的方式和途徑等信息。從而有助于藥物生產(chǎn)、實(shí)驗(yàn)、研究和臨床等各個(gè)方面，對研究的藥物作出正確的估計(jì)與評價(jià)。

181．分析物分析物即樣品中的被測組分，主要是生物樣品中的藥物（包括手性藥物）。然而某些研究需測定藥物在體內(nèi)的代謝物，治療藥物監(jiān)測有時(shí)也需要測定具藥理活性的代謝物，因此代謝物的分析也是體內(nèi)藥物分析的對象之一。20

2．生物樣品種類生物樣品如體液、器官、組織以及排泄物等，均為分析對象。在上述生物樣品中，尤以血液為最常用，由于血藥濃度與藥物臨床作用密切相關(guān)，以血藥濃度對時(shí)間建立的藥---時(shí)曲線，是研究藥物在體內(nèi)分布、代謝、排泄以及考察影響藥物體內(nèi)過程各種因素的重要手段。

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3．樣品來源在新藥臨床前藥理研究階段，以及由于某些藥物的體內(nèi)研究需要，常做動物試驗(yàn)，因此分析的樣品就不僅來源于人體，而且還來源于各種不同種類的實(shí)驗(yàn)動物（小鼠、大鼠、狗、兔子、羊等）。23二、體內(nèi)藥物分析的任務(wù)

體內(nèi)藥物分析是隨藥物動力學(xué)、臨床藥學(xué)及臨床藥理學(xué)的深人研究而迅速發(fā)展起來的，并且在新藥研制過程中，按照新藥審批有關(guān)規(guī)定，必須提供藥物在動物及人體內(nèi)的藥代動力學(xué)、生物利用度、體內(nèi)分布以及血漿蛋白結(jié)合率等基本參數(shù)；對于已經(jīng)應(yīng)用于臨床的藥物，也有必要再進(jìn)行深入的體內(nèi)研究。治療藥物監(jiān)測：在藥物臨床應(yīng)用期間，通過監(jiān)測血中藥物濃度(通常稱為血藥濃度)。為制訂合理的給藥方案和劑量調(diào)整提供科學(xué)依據(jù)。

241.進(jìn)行體內(nèi)各種體液、組織、器官和排出物中藥物及其代謝物的分離測定。2.進(jìn)行新測定方法的研究、開發(fā)，以供5項(xiàng)臨床常規(guī)測定之用。3.進(jìn)行分析質(zhì)量管理工作，提高測定技術(shù)和效率，以便獲得快速、準(zhǔn)確、可靠的測定結(jié)果。

264.進(jìn)行方法學(xué)研究，及時(shí)為相關(guān)學(xué)科的研究提供合理的、最佳分析條件與方法。估計(jì)、評定各種方法能達(dá)到的靈敏、專屬和準(zhǔn)確的程度，探討各種方法應(yīng)用于體內(nèi)藥物分析中有規(guī)律性的問題，以便使本學(xué)科迅速發(fā)展。5.參與相關(guān)學(xué)科研究中對獲得的分析結(jié)果的闡明工作，使所獲得的測定數(shù)據(jù)更有助于說明問題。

27三、體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)

體內(nèi)藥物分析的顯著持點(diǎn)是樣品中的藥物濃度很低。藥物分析的樣品(原料或制劑)中藥物含量一般較高，并且通常在已知(如制劑處方規(guī)定)的范圍內(nèi)。與之相比，生物樣品中的藥物濃度不僅很低，而且還受吸收、分布、代謝和排泄等體內(nèi)諸多因素的影響，呈現(xiàn)動態(tài)變化，藥物濃度波動范圍常達(dá)三個(gè)數(shù)量級以上，并且還與給藥劑量和給藥途徑等密切相關(guān)。因此，測定時(shí)必須使用靈敏度較高的分析方法。

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藥物分析的干擾成分主要來源于藥物中的共存雜質(zhì)、制劑中的賦形劑和復(fù)方中的其他藥物；而生物樣品內(nèi)的干擾成分更多，除上述干擾物外它還包括很多內(nèi)源性化合物，隨樣品種類和疾病情況不同有所不同，而且很多藥物在體內(nèi)經(jīng)過代謝可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和性質(zhì)完全不同的多種代謝物。

30由上可知：生物樣品中的干擾成分很多。這使微量藥物及其代謝物自生物基質(zhì)中的分離和分析更加困難，因此在建立分析方法時(shí)，除采取合適的預(yù)處理技術(shù)外，還必須考慮分析方法的專屬性和選擇性。

31綜上所述，體內(nèi)藥物分析的持點(diǎn)可概括如下：1.樣品中的藥物濃度低，并且波動范圍大。2.樣品內(nèi)存在的干擾成分多，測定前樣品要經(jīng)過分離、純化后才能準(zhǔn)確地測定。3.樣品量少，不易重新獲得。常采取濃集方法，以富集、凈化被測組分。供臨床用藥監(jiān)測的檢測分析方法，要求簡便、快速、準(zhǔn)確，以便迅速為臨床提供設(shè)計(jì)合理的用藥方案及中毒解救措施。

32實(shí)驗(yàn)室應(yīng)擁有多種基本儀器設(shè)備如樣品冷貯、萃取、濃集等設(shè)備，以及需配備靈敏度較高的分析儀器可進(jìn)行多項(xiàng)分析工作。工作量大，測定數(shù)據(jù)的處理和闡明有時(shí)不太容易。因此，需要相關(guān)學(xué)科的參與。

33第3節(jié)體內(nèi)藥物分析方法的基本要求

一、常用樣品的種類、采集和貯存

體內(nèi)藥物分析最常用而且易獲得的分析樣品種類有：血樣、尿樣、唾液和糞便。但在一些特定的情況下也可采用乳汁、淚液、脊髓液、膽汁、羊水以及各種組織作為分析的樣品

341.血樣在體內(nèi)藥物分析中最常采用的血樣為全血、血漿和血清，其中選用最多的是血漿或血清，測定血中藥物濃度是指測定血漿或血清中的藥物濃度，而不是指含有血細(xì)胞的全血中的藥物濃度。因?yàn)楫?dāng)藥物進(jìn)人體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，血漿中藥物的濃度與藥物在作用點(diǎn)的濃度緊密相關(guān)，可以反映藥物在體內(nèi)靶器官的狀況，因而，血漿濃度可作為作用部位藥物濃度的可靠指標(biāo)。并能真正代表體循環(huán)中的血藥濃度，才能供作計(jì)算有關(guān)藥物動力學(xué)參數(shù)之用。

血漿：離開血管的全血經(jīng)抗凝處理后，通過離心沉淀，所獲得的不含細(xì)胞成分的液體，即血漿。

血清：離體的血液凝固之后，經(jīng)血凝塊聚縮釋出的液體，即血清。

血清與血漿的區(qū)別，主要在于血清不含纖維蛋白元。

纖維蛋白原能轉(zhuǎn)換成纖維蛋白，具有凝血作用

35供測定的血樣應(yīng)能代表整個(gè)血藥濃度，因而應(yīng)待藥物在血液中分布均勻后取樣。動物實(shí)驗(yàn)時(shí)，可直接從動脈或心臟取血。對于病人，通常采取靜脈血，有時(shí)根據(jù)血藥濃度和分析方法靈敏度，也可用毛細(xì)管采血。由采集的血液制取血漿或血清。

36血漿的制備將采取的血液置于含有抗凝劑（如：肝素、枸櫞酸、草酸鹽、EDTA、氟化鈉等）的試管中，混合后，以2500r/min～3000r/min離心5min使與血細(xì)胞分離，分取上清夜即為血漿。實(shí)際工作中制備血漿時(shí)最常用的抗凝劑為肝素1mg/ml，一般lml的全血需加0.1一0.2mg的肝素，加入血樣后立即輕輕旋搖，但勿太猛烈，以免導(dǎo)致血細(xì)胞破裂。

37血清的制備將采取的血樣在室溫下至少放置30min到1h，待凝結(jié)出血餅后，用細(xì)竹棒或玻璃棒輕輕地剝?nèi)パ?，然后?000r/min～3000r/min離心5min～10min，分取上清液即為血清。其量約為全血的30％一50％。在室溫高時(shí)，血凝過程進(jìn)行得很快，宜在血凝后半小時(shí)內(nèi)分離血清。當(dāng)室溫低時(shí)，血凝過程較慢，可將血液置37℃溫度下加速血清析出。全血也應(yīng)加入抗凝劑混勻，防止凝血后影響測定。

38血樣取樣次數(shù)與時(shí)間間隔的選擇，應(yīng)隨測定目的不同而有所差異。例如藥物動力學(xué)參數(shù)的測定，需測繪制藥物在體內(nèi)的藥—時(shí)曲線。應(yīng)根據(jù)動力學(xué)曲線模型、給藥方式來確定取樣次數(shù)與時(shí)間間隔，要在曲線首尾及峰值附近或濃度較大處取樣。藥物動力學(xué)參數(shù)測定中常用的取樣次數(shù)見圖1-1。

3940如測定血藥濃度，進(jìn)行治療藥物濃度監(jiān)測，則取樣時(shí)需在血中藥物濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)后才有意義。一般情況下需要連續(xù)給藥。經(jīng)過6個(gè)半衰期，血藥濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)。由于每種藥物生物半衰期不同，到達(dá)穩(wěn)態(tài)的時(shí)間不同，所以服藥或注射后采血測定時(shí)間也不同。

41采取血樣后，應(yīng)及時(shí)分離血漿與血清，并最好立即進(jìn)行分析。如不能立即測定時(shí)，應(yīng)妥善儲存。血漿或血清樣品不經(jīng)蒸發(fā)、濃縮，必須置硬質(zhì)玻璃試管中完全密塞后保存。短期保存時(shí)置冰箱（4℃）中，長期保存時(shí)要在冷凍櫥（庫）（-20℃）中冷凍保存。42要注意采血后及時(shí)分離出血漿或血清再進(jìn)行儲存。若不預(yù)先分離，血凝后冰凍保存，則因冰凍有時(shí)引起細(xì)胞溶解，從而妨礙血漿或血清分離，或因溶血影響藥物濃度變化。432.唾液用唾液作為藥物濃度監(jiān)測及藥物動力學(xué)研究的報(bào)道逐漸增多。唾液中的藥物濃度通常與血漿濃度相關(guān)，即可用唾液中藥物的濃度來反應(yīng)血漿藥物濃度。如MichelleWood[10]等采用固相萃取前處理技術(shù)和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）同時(shí)定量分析了唾液中的多種違禁藥品（苯丙胺、去氧麻黃堿、3,4-甲二氧基苯異丙胺、可卡因、嗎啡、甲基嗎啡等）和它們的代謝物。

44MartaConcheiro等用HPLC熒光檢測器測定了唾液中的四種苯丙胺衍生物（MDMA,MDA,MDEA,MBDB）的含量，經(jīng)過了簡單地液-液萃取后，進(jìn)樣分析，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為285nm和320nm，流動相為磷酸（pH5）-乙腈（75：25），在10mim內(nèi)所有的組分都得到了很好地分離。色譜圖見圖3-2。

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圖3-2空白唾液加了2ng/mlMDMA,MDA,MDEA,MBDB色譜圖46應(yīng)用唾液作為體液樣品測定藥物濃度有很多優(yōu)點(diǎn)：與采取血樣不同，取樣是非傷害性的，采樣不受時(shí)間、地點(diǎn)的限制，很容易反復(fù)采集；采集時(shí)病人無痛苦無危險(xiǎn)，極易為兒童接受；有些唾液中藥物濃度可以反映血漿中游離型藥物濃度，如地高辛、苯妥英鈉和茶堿等，在唾液中的濃度與血漿中游離的或未與蛋白結(jié)合的藥物濃度相等。可從唾液藥物濃度推定血漿中游離藥物濃度，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值、已引起人們的注意。47許多用于血漿藥物濃度的測定方法，只需稍加改進(jìn)或不改進(jìn)即可直接用于唾液中藥物濃度測定。進(jìn)人唾液中藥物的量與血液中藥物在生理pH值(7.4)下電離度的程度以及蛋白結(jié)合程度有關(guān)，非電離的藥物在唾液中的濃度高些。但另一方面，由于唾液是由腮腺、頜下腺、舌下腺和口腔粘膜內(nèi)許多散在的小腺體分泌的組成不同的混合液體，其組成也會發(fā)生經(jīng)時(shí)變動；

48因此，唾液中的藥物濃度與血漿中的游離藥物濃度相比就容易變動；而且唾液中的藥物濃度與血漿中藥物濃度的比值（S/P）只有少數(shù)藥物是恒定值；有些與蛋白結(jié)合百分率較高的藥物，其在唾液中的濃度比血漿濃度低得多，需要高靈敏度的方法才能進(jìn)行準(zhǔn)確地測定；有些患者（如癲癇、昏迷）不能采集唾液樣品。49唾液的采集應(yīng)盡可能在刺激少的安靜狀態(tài)下進(jìn)行。一般在漱口后15min收集，收集口內(nèi)自然流出或舌在口腔內(nèi)攪動后流出的混合唾液，然后用2000r/min-3000r／min離心15min，小心吸取上清液，然后作進(jìn)一步分離、凈化處理后即可供測定用。

50唾液中含有粘蛋白，粘蛋白是在唾液分泌后，受唾液中酶催化而生成的。為阻止粘蛋白的生成，應(yīng)將唾液在4℃以下保存。如果分析時(shí)沒有影響，則可用堿處理唾液，使粘蛋白溶解而降低粘度。唾液在保存過程中，會放出二氧化碳而使pH值升高，因此，需要測定唾液的pH值時(shí)，應(yīng)在取樣當(dāng)時(shí)為好。冷藏保存唾液時(shí)，解凍后有必要將容器內(nèi)唾液充分?jǐn)噭蚝笤儆?，不然測定結(jié)果會產(chǎn)生誤差。513.尿樣采用尿樣測定藥物濃度的目的與血液、唾液樣品不同。尿藥測定主要用于藥物劑量回收研究、藥物腎清除率、藥物體內(nèi)代謝及生物利用度研究，并可推斷患者是否違反醫(yī)囑用藥，同時(shí)根據(jù)藥物劑量回收研究可以預(yù)測藥物的代謝過程及測定藥物的代謝類型（代謝速率，MR）等

52體內(nèi)藥物消除主要是通過尿液，以藥物原形或代謝物及其絡(luò)合物形式排出體外。因尿藥濃度較高，通常變化較大，所以應(yīng)測定—定時(shí)間內(nèi)排入尿中藥物的總量，這就需要測定在規(guī)定時(shí)間內(nèi)的尿液體積及尿藥濃度。由于尿藥濃度改變不直接反映血藥濃度，加上尿液排出過程中，不僅包括腎小球的濾過，還包括腎小管的重新吸收，這樣就使得尿液與血液中藥物濃度的相關(guān)性很不理想。受試者腎功能正常與否將影響藥物的排泄，這些都對測定結(jié)果的闡明帶來較大的困難。53尿中藥物大多呈絡(luò)合狀態(tài)。藥物經(jīng)第二階段代謝后與體內(nèi)某些內(nèi)源性物質(zhì)如葡萄糖醛酸結(jié)合或與藥物本身的某些代謝物結(jié)合，然后排入尿中。所以為了測定尿液中藥物總量，無論是直接測定或萃取分離之前，都需要將絡(luò)合的藥物游離。有些藥物僅需要較溫和的條件即可使之游離，但有的則需要較劇烈的方法。有些不穩(wěn)定的藥物則可采用酶解方法。54尿樣的優(yōu)點(diǎn)：在所有體液樣品中，尿樣最容易獲得，并且樣品量大，取樣次數(shù)可增加，內(nèi)含藥物濃度高。因健康人尿液中不含蛋白質(zhì)，不需進(jìn)行去除蛋白處理，所以常用作藥物體內(nèi)代謝研究的首選樣品。

55尿液主要成分是水、尿素及鹽類，是很好的細(xì)菌生長液，因此應(yīng)在取樣后立即測定。實(shí)際工作中若需收集24小時(shí)或更長時(shí)間的尿樣，而不能立即測定時(shí)，則應(yīng)置于4℃冰箱內(nèi)冷藏。如需在室溫保存，則應(yīng)在采樣后的尿液立即加入少量防腐劑甲苯或氯仿。56為了避免樣品中被測藥物發(fā)生分解或產(chǎn)生其他化學(xué)變化，取樣后最好立即進(jìn)行分析測定。但在實(shí)際工作中常需將收集到的樣品冷藏、冰凍，臨用前再融化并放至室溫后使用。生物樣品中的一些不穩(wěn)定的藥物，易受血漿中酶水解的影響，當(dāng)收集好樣品之后應(yīng)立即加入酶抑制劑氟化鈉，防止藥物分解。57生物樣品在采樣、貯存與分析測定過程中都要與器皿接觸。因此，應(yīng)注意在各個(gè)環(huán)節(jié)中可能造成樣品的損失或污染，以免將因污染引入的雜質(zhì)判定為藥物新的代謝物。

58二、樣品的前處理技術(shù)

在測定生物樣品中藥物及其代謝物時(shí)，樣品的前處理是十分重要的。少數(shù)情況下可將體液經(jīng)簡單處理后進(jìn)行直接測定，如用反相高效腋相色譜法可將含藥物的尿液直接進(jìn)樣；用放射免疫法測定血清中藥物濃度時(shí)．可用分離后得到的血漿或血清直接測。59但是，對大多數(shù)樣品通常在最后一步測定之前，需要采取適當(dāng)方法進(jìn)行樣品的預(yù)處埋。如含有藥物的組織、器官等樣品，不經(jīng)處理則不能測定；微量藥物存在于大量生物介質(zhì)中．若直接進(jìn)行測定．內(nèi)源性雜質(zhì)可能產(chǎn)生干擾，藥物濃度太低將會達(dá)不到儀器靈敏度要求，因此生物樣品中的藥物在測定之前進(jìn)行樣品的前處理，即進(jìn)行分離、純化、濃集，必要時(shí)還需對待測組分進(jìn)行化學(xué)衍生化，從而為測定創(chuàng)造良好的條件。60生物樣品中去除蛋白質(zhì)的原因是：①生物樣品如血漿、血清、糞便和唾液中含有大量的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)能與藥物結(jié)合成為結(jié)合型蛋白藥物，所以在測定體內(nèi)藥物的含量時(shí)，首先應(yīng)去除其中的蛋白質(zhì)，以使結(jié)合型的藥物游離出來；②當(dāng)測定血液、尿液和腦脊液等體液中的藥物時(shí)，因這些體液中含有蛋白質(zhì)，在測定過程中會形成泡沫，出現(xiàn)渾濁或沉淀而干擾測定；③在測定過程中，有些測定試劑會與蛋白質(zhì)反應(yīng)，結(jié)果影響正常的測定；④體內(nèi)的蛋白質(zhì)會污染層析柱或其他的儀器、設(shè)備．由于以上四點(diǎn)原因，所以測定生物樣品中藥物的含量時(shí)，必須要將其中的蛋白質(zhì)去除掉．

1、生物樣品中蛋白質(zhì)的處理61目前有很多除去蛋白質(zhì)的方法，下面重點(diǎn)介紹幾種常用的方法：62A加入可與水混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽最常用的能與水混溶的有機(jī)溶劑如：乙醇．甲醇．丙酮和乙睛，中性鹽如硫酸銨．硫酸鈉、氯化鈉等．當(dāng)它們過量存在時(shí)．能使蛋白質(zhì)脫水后沉淀下來，其中性鹽的濃溶液能使蛋白質(zhì)膠體脫水，并中和其電荷，使蛋白質(zhì)失去膠體性而沉淀下來．使與蛋白質(zhì)結(jié)合狀態(tài)的藥物及其代謝物釋放出來，然后將其離心，即可獲得含有藥物及其代謝物的上層澄清液．利用這種方法除去蛋白質(zhì)后的樣品。一般可用于色譜法直接進(jìn)樣分析測定。

63B加入酸性沉淀劑常用的酸性沉淀劑有三氯醋酸．高氯酸．磷酸．鉑酸．磷鎢釀．磷銅酸．水楊酸．鎢釀．苦味酸及偏磷酸等，它們的作用機(jī)制是使蛋白質(zhì)分子的陽離子形成不溶性鹽而沉淀，其條件是PH值要低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)．加入這些沉淀劑之后，立即形成白色沉淀，離心后可得澄明的上清液。64C加入重金屬鹽沉淀劑一般常用鋅鹽、銅鹽和汞鹽等陽離子型沉淀劑，可在高于等電點(diǎn)的pH值溶液與蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基形成不溶性沉淀，離心后，可將蛋白質(zhì)除去．65蛋白質(zhì)的沉淀效率與介質(zhì)pH值及加入沉淀劑的體積有關(guān)．在一定pH值范圍內(nèi)．各種蛋白質(zhì)沉淀劑加人的體積與蛋白質(zhì)沉淀百分率的關(guān)系詳見上表66以上三種方法，雖可有效地去除樣品中的蛋白質(zhì)，但這些方法均屬于蛋白質(zhì)沉淀法，這種方法對于與蛋白質(zhì)結(jié)合較強(qiáng)的藥物來講，其回收率較低．因此，有人提出，與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物可用酶消化法，使其從蛋白質(zhì)結(jié)合物中游離而釋出，但酶消化法容易導(dǎo)致某些藥物的分解而干擾藥物的測定．

67D酶消化法在測定某些與蛋白質(zhì)結(jié)合較強(qiáng)而又對酸穩(wěn)定的藥物時(shí)，常采用酶消化法．酶消化法的優(yōu)點(diǎn)在于：①避免某些藥物在酸中水解及在溫度較高時(shí)降解；②可用有機(jī)溶劑直接提取消化液，而無乳化現(xiàn)象；③當(dāng)應(yīng)用HPLC法測定時(shí)，不需要再進(jìn)行過多的凈化操作；④對蛋白結(jié)合率較強(qiáng)的藥物，用本法后可使收率提高,最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草茵酶，它是一種細(xì)菌性蛋白分解酶，可在PH7．0—11．0范圍內(nèi)使蛋白質(zhì)肽鍵降解，一般在50一60℃具有最大的活力，而其結(jié)晶型酶在20℃穩(wěn)定．此法的主要缺點(diǎn)是不適用于一般在堿性溶液中易水解的藥物．

68除了上述4種方法外，體液中的蛋白質(zhì)也可通過微孔薄膜進(jìn)行超濾，以除去蛋白．但這種方法不常用，其原因是：①不適用于蛋白結(jié)合力較強(qiáng)的藥物；②藥物容易被吸附在超濾薄膜上而影響測定，故不作介紹．692、生物樣品中藥物及其代謝物的萃取生物樣品中待測藥物及其代謝物常用的萃取方法有：液—液萃取法，固相萃取法。

液-液萃取法液-液萃取法是應(yīng)用最多的分離．凈化方法，其原因是：（1）可將被測藥物及其代謝物自大量共存物中分離出來，避免雜質(zhì)對測定的于擾。(2）該法簡單，快速，經(jīng)濟(jì)適用，可使萃取液直接蒸去溶劑使待測組分濃集，以增加測定的靈敏度。（3）很多組分經(jīng)過萃取后可獲得90％以上的回收率。對生物樣品中的藥物及其代謝物進(jìn)行多次萃取，也能獲得較高的回收率。70

在體內(nèi)藥物分析中，無論是藥物濃度監(jiān)測或者是藥物動力學(xué)研究．所分析測定的樣品數(shù)量較多，一般只進(jìn)行一次萃取，盡管一次萃取藥物及其代謝物的萃取回收率不太高．就一般生物藥物分析的基本要求而言，萃取率不低于50%即可，現(xiàn)將實(shí)際工作中常用的萃取溶劑列表于下，以供參考。7172

溶劑提取時(shí)，水相的最佳pH值的選擇與藥物的pKa值有關(guān)，從理論計(jì)算來說．對堿性藥物的最佳pH值要高于pKa值l一2pH單位，對酸性藥物來說，pH值要低于pKa值l一2pH單位．在實(shí)際工作中的一般提取原則是堿性藥物在堿性pH介質(zhì)中提取，而酸性藥物在酸性pH介質(zhì)中提取。這樣就可使得90％藥物以非電離形式存在，易被溶劑提取，為保持溶液pH值的穩(wěn)定，溶劑萃取多采用緩沖溶液，這樣可維持提取率的重現(xiàn)性。73在液—液萃取中盡可能采用極性溶劑，這樣既叫得到合適的回收率，又使干擾雜質(zhì)的提取量減到最??；但有時(shí)力為了克服極性較小的碳?xì)浠衔锶軇┨崛∧芰θ鹾蜏p小藥物在容器表面上的吸附損失，常在碳?xì)浠衔锶軇┲屑尤肷倭康拇碱悺?4

大量樣品萃取通常采用分液漏斗。按照一般萃取操作進(jìn)行；但在臨床藥物濃監(jiān)測及藥物代謝動力學(xué)研究中，通常用萃取試管。在實(shí)際工作中多采用有標(biāo)準(zhǔn)磨口玻璃塞的離心管作為萃取試管。使用時(shí)，將體液樣品、緩沖液和萃取溶劑置試管內(nèi)，再將試管放在漩渦混合器漩渦混合萃取。萃取后試管內(nèi)有機(jī)相和水相會有輕微乳化現(xiàn)象，一般應(yīng)將試管放在離心機(jī)內(nèi)離心處理，使水相和有機(jī)相完全分層。若需要下層液體，可將毛細(xì)吸管尖端伸入上液層中，通過玻璃水泵將上層液體吸走。75超臨界流體萃取超臨界流體萃取是20世紀(jì)70年代開始用于工業(yè)生產(chǎn)中有機(jī)化合物萃取的，它是用超臨界流體作為萃取劑、從各種組分復(fù)雜的樣品中，把所需要的組分分離提取出來的一種分離提取技術(shù)：用于色譜樣品處理中，可從復(fù)雜樣品中將欲測組分分離提取山來，制成適合于色譜分析的樣品。

76基本原理超臨界流體是介于氣體和液體之間的一種非氣態(tài)，又非液態(tài)的物質(zhì)。這種物態(tài)只能存在于溫度和壓力都超過其臨界點(diǎn)的情況下，超臨界流體的性質(zhì)，如密度、粘度和擴(kuò)散度等等，都處于氣體和液體之間。超臨界流體的密度與液體相近，大致是氣體的100一1000倍，因此超臨界流體的分子間作用力比氣體強(qiáng)，它與溶質(zhì)分子的作用力也很強(qiáng)，與液體一樣．很容易溶解其他物質(zhì)；超臨界流體的粘度即使在40MPa下也只略高于氣體，溶質(zhì)在超臨界流體中的擴(kuò)散系數(shù)比在液體中大的多．傳質(zhì)速率很高，這也有利于物質(zhì)在超臨界流體中的溶解。同時(shí)超臨界流體的表面張力很小，很容易穿進(jìn)樣品基質(zhì)內(nèi)，并能保持較高的流速，可使萃取過程在高效、相對經(jīng)濟(jì)的條件下完成、所以超臨界流體是一種十分理想的萃取劑。77當(dāng)超臨界流體的溫度略高于臨界溫度時(shí)、超臨界流體的壓縮系數(shù)最大，此時(shí)壓力的微小變化，就能導(dǎo)致它的密度的變化，調(diào)節(jié)壓力就可以控制它的密度，就可以控制它對溶質(zhì)的溶解能力。這樣，在稍高于臨界溫度的情況下．改變超臨界流體的壓力，可以把樣品中的不同組分按它們在超臨界流體中的溶解度大小不同先后萃取出來。降低壓力溶解度大的組分可萃?。S壓力增加，難溶組分逐漸與基體分離而被萃取，所以使用程序升壓，超臨界流體不但可以從復(fù)雜樣品中萃取各種組分，也可以使這些組分得到初步的分離。

78除溫度和壓力外，在超臨界流體中加入少量其他溶劑也可改變它對被萃取溶質(zhì)的溶解能力。其作用機(jī)理至今尚未完全清楚。通常加入量不超過10％．而且以極性溶劑，異丙醇居多，少量其他溶劑的加入，可使超臨界萃取技術(shù)的使用范同進(jìn)一步擴(kuò)大到極性較大的化合物。用于超臨界流體萃取的超臨界流體必須穩(wěn)定、安全、易于操作，對欲萃取溶質(zhì)有足夠大的溶解能力，同時(shí)又有良好的選擇性。通常以臨界條件較低的物質(zhì)優(yōu)先考慮。其中水的臨界值最高，實(shí)際中很難使用、在實(shí)際使用最多的是二氧化碳．它不但因?yàn)榕R界值相對較低易于操作，而且具有一系列優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)性質(zhì)不活潑，不易被萃取溶質(zhì)起反應(yīng)；79無毒、無嗅，不會有二次污染；容易得到高純度，價(jià)格適中，便于廣泛使用；沸點(diǎn)低，容易從萃取后的組分中除去，后處理比較簡單，不用加熱，適用于萃取對熱敏感的化合物，在臨界點(diǎn)附近，溫度和壓力的改變會使流體密度發(fā)生較大變化，同時(shí)使許多物質(zhì)在其中的溶解度也發(fā)生變化。二氧化碳極性很低，只能用于萃取低極性和非極性化合物，對極性化合物溶解能力很低，但可以加入極性改世劑，如甲醇來增加對極性化合物的溶解能力。有時(shí)也采用衍生化方法來增加欲萃取物質(zhì)在二氧化碳中的溶解能力。80

對于極性較大的化合物也可用氨或氧化亞氮作為超臨界流體進(jìn)行萃取。因?yàn)樗鼈兙哂小O性．對極性化合物溶解性能好。81微波萃取技術(shù)微波萃取是一種萃取速度快、試劑用量少、回收率高、靈敏以及易于自動控制的新的樣品制備技術(shù)，用于色譜分析的樣品制備。在一般的液—液萃取中，為了提高萃取效率，加速萃取速度，人們也常采用加熱萃取溶劑的方法，但是由于萃取溶劑的沸點(diǎn)限制了萃取溫度的進(jìn)一步提高．使得一般的液—液萃取時(shí)間較長，所用試劑量也較大。為了防止萃取試劑在加熱沸點(diǎn)的蒸發(fā)損失，發(fā)明了索氏萃取裝置，利用沸騰時(shí)冷凝下來的萃取溶劑對萃取樣反復(fù)進(jìn)行萃取，這樣萃取溶劑的用雖可大大減少，但萃取時(shí)間仍然很長。隨著微波樣品制備技術(shù)的發(fā)展，微波萃取技術(shù)也被用到液—液萃取技術(shù)上

82萃取溶劑溶劑的極性對萃取效率有很大的影響,除此之外,還要求溶劑對分離成分有較強(qiáng)的溶解能力,對萃取成分的后續(xù)操作干擾較少。已見報(bào)道用于微波萃取的溶劑有:甲醇、丙酮、乙酸、二氯甲烷、正己烷、乙腈、苯和甲苯等有機(jī)溶劑及硝酸、鹽酸、氫氟酸和磷酸等無機(jī)試劑,以及己烷—丙酮、二氯甲烷—甲醇和水—甲苯等混合溶劑。83萃取溫度萃取溫度應(yīng)低于萃取溶劑的沸點(diǎn),不同的物質(zhì)最佳萃取回收溫度不同。在微波密閉容器中,由于內(nèi)部壓力可達(dá)到110MPa以上,因此,溶劑沸點(diǎn)比常壓下的溶劑沸點(diǎn)提高許多,用微波萃取可以達(dá)到常壓下使用同樣溶劑所達(dá)不到的萃取溫度,既可以提高萃取效率又不致于分解待測萃取物。

84固相萃取、固相微萃取固相萃取固相萃取(solidphaseextraction，SPE)是近20年發(fā)展起來的一種生物樣品預(yù)處理技術(shù)。隨著SPE柱種類、相關(guān)裝備及技術(shù)的發(fā)展，SPE已廣泛應(yīng)用于干擾成分多且藥物濃度較低的體內(nèi)樣品分析，是生物樣品預(yù)處理中具有發(fā)展優(yōu)勢的技術(shù)之一。

85本法的優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)極性大的藥物或兩性藥物難于采用液—液提取法分離時(shí)，本法可獲得滿意的結(jié)果．它的操作是將具有吸附、分配或離子交換性質(zhì)的、表面積大的擔(dān)體作為填充劑裝在分離管或?qū)游龉苤校股飿悠分械乃幬?、代謝物或其他干擾物留在擔(dān)體而進(jìn)行分離．目前比較廣泛使用的固相是活性炭、氧化鋁、硅藻土、離子交換樹脂和非離子型的樹脂及凝膠等．

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(1)活性炭用活性炭作固定相的優(yōu)點(diǎn)是可用于分離生物樣品中濃度較低的藥物，且用活性炭分離出的藥物其雜質(zhì)含量較少，所以用活性炭分離尿和血液中的藥物，方法如下；取1m1血清或10m1尿液樣品，置離心管中，加入活性炭(約8．50mg)，充分混合后、離心(2000rpm棄去水層，用1ml蒸餾水洗滌活性炭，洗去吸附的雜質(zhì)，再離心后，棄去水層．將離心管的活性炭層充分振搖、使分散．加入合適的有機(jī)溶劑進(jìn)行藥物的解吸、離心后，將有機(jī)溶劑揮干，所得殘?jiān)纯捎糜诙糠治觯淙秉c(diǎn)是將吸附于活性炭的藥物用有機(jī)溶劑解吸附時(shí)較困難．所以給定量分析帶來一定的干擾．

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(2)氧化鋁用氧化鋁作固相的優(yōu)點(diǎn)是具有較強(qiáng)的吸附力．適用于含較高濃度鹽的溶液和生物樣品中含極性基團(tuán)藥物(如兒茶酚胺類藥物)的分離．但由于吸附性強(qiáng)，造成藥物的回收率降低，故在日常使用中較少應(yīng)用．(3)離子交換樹脂用離子交換樹脂作固定相的優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)用洗脫液將藥物從離子交換樹脂柱上洗脫后，直接進(jìn)行分光光度法測定．例如，從強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂上洗脫的腎上腺素、5—羥色胺酸和多巴胺等藥物時(shí)，可獲得較好的層析效果，也可用于極性高、可電解的慶大霉素類藥物的分離．但其缺點(diǎn)是操作方法比較繁瑣和冗長．如供試品中存在有不揮發(fā)性鹽，在使用離子交換樹脂柱時(shí)，供試品應(yīng)先脫鹽或經(jīng)溶劑提?。?8

(4)AmberliteXAD—3型樹脂優(yōu)點(diǎn)是能夠直接從生物樣品中分離出藥物的硫酸及葡萄糖醛酸苷等絡(luò)合物．也能從極性溶劑中(水、尿)吸附非極性溶質(zhì)，適用于從水相中分離出親脂性藥物．其方法如下；取尿樣20m1，加入裝有XAD—3型樹脂的微粒，以醋酸乙酯—二氯乙烷(6:4)混合液洗脫，收集洗脫液，加0．1mol鹽酸溶液1滴，將溶液蒸發(fā)至干(85℃水浴)、然后根據(jù)藥物的性質(zhì)加入一定量的溶劑溶解后檢測．本法的缺點(diǎn)是對嘌呤類藥物幾乎不吸附；若將藥物與葡萄糖醛酸結(jié)合的尿樣事先未經(jīng)水解，直接上柱，然后再將洗脫液進(jìn)行水解時(shí)，其體內(nèi)藥物的回收率就很低(約為10％)．

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(5)PBondapakcla用PBondapakC：作固定相裝于色譜柱中，當(dāng)體內(nèi)藥物通過柱時(shí)，藥物就停留在柱上，與親水性的內(nèi)源性組分分開；然后再用較低極性的溶劑將停留在柱上的藥物洗脫出來．這種微型柱相當(dāng)于一個(gè)預(yù)柱，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、溶劑用量少．可節(jié)省費(fèi)用和時(shí)間．如與HPLC法相配合，可將生物樣品中的被測組分分離和提純。(6)交聯(lián)葡聚糖凝膠衍生物在葡聚糖分子上連接不同的側(cè)鏈，可以得到各種類型的固定相，將這些固定相裝于色譜柱中，當(dāng)體內(nèi)藥物通過色譜柱時(shí)，藥物就滯留在柱上，然后可用有機(jī)溶劑(正相或反相)洗脫，或用離子交換劑分離生物樣品中呈離子狀態(tài)的藥物，或用緩沖液洗脫、分取游離型藥物．需要指出的是，目前此項(xiàng)技術(shù)已同HPLＣ法相配合，使生物樣品從預(yù)處理到含量測定向著自動化的數(shù)據(jù)處理方向發(fā)展．

90SPE的萃取機(jī)制SPE分為反相、正相和離子交換3種類型。1．1反相SPE用于水溶液中中等極性或非極性待測物的萃取，常用固定相有c18、c-苯基等。樣品的碳?xì)滏I與硅膠表面的官能團(tuán)以范德華力吸附，使極性溶液中的待測物保留在固定相上。一般用非極性溶劑洗脫待測物。含藥樣品大多為水溶性血漿、尿、組織液等，待測物多為中等極性或非極性，可用反相SPE進(jìn)行預(yù)處理。鍵合硅膠固定相中有一定數(shù)量未鍵合的硅醇基，當(dāng)pH>4時(shí)，硅醇基以離子形式存在，可發(fā)生陽離子交換二級相互作用，可在保留強(qiáng)極性干擾物的同時(shí)也吸附待測物。調(diào)節(jié)洗脫液的pH值，可破壞上述二級相互作用而洗脫待測物。

911．2正相SPE用于中等極性到非極性基質(zhì)中的極性待測物的萃取。常用固定相有氰基、氨基等。待測物在正相小柱上的保留取決于其極性官能團(tuán)與吸附劑表面的極性官能團(tuán)間的相互作用。1．3離子交換SPE用于帶電荷的離子化合物。原理為待測物的帶電基團(tuán)與硅膠帶電基團(tuán)間靜電吸引。為將待測物從水溶液中吸引到離子交換鍵合相上，樣品pH值應(yīng)保證待測物官能團(tuán)和鍵合相官能團(tuán)均為帶電離子。因此，pH值、合適宜的離子強(qiáng)度和待測物的含量是離子交換SPE的重要條件。常用的陰離子填料為硅膠上鍵合鹵化季銨鹽、氨基等。陽離子填料為硅膠上鍵合了苯磺酸鹽、羧酸等。

92SPE的萃取裝置2．1SPE小柱SPE小柱應(yīng)用最廣泛，材料為高純度醫(yī)用聚丙烯，出口為Luer氏接口，可接針頭，將流出液引入接收管中。小柱中支持固相床的篩板材料多為孔徑10～20m的四氟乙烯、聚丙烯或不銹鋼。一般儲液體積為0．5～60ml，填料量35mg～10g。樣品量較少時(shí)，可選用填料量小的SPE小柱。2．2圓片濾頭該濾頭有截面積大、流速高、萃取快等優(yōu)點(diǎn)，適于臨床小樣品(血清或血漿)的預(yù)處理。932．3涂布纖維用于固相微萃取。為在細(xì)小的固體融溶硅膠纖維上涂布聚合物固定相。纖維浸入溶液中，待測物在涂層中擴(kuò)散、分配。取出纖維，用強(qiáng)溶劑洗脫待測物后測定。2．4SPE萃取儀液體樣品上SPE小柱后，在加壓下以一定流速通過固定相。用注射器給液體樣品加壓，較黏稠樣品用真空抽濾。抽濾裝置分為單管與多管兩種。體內(nèi)藥物分析樣品數(shù)較多，可選用多管系統(tǒng)。多管系統(tǒng)由玻璃缸、活動支架、真空減壓閥、流量控制閥、真空表和真空泵組成。流出液由活動支架上的試管收集。94SPE的方法建立3．1選擇SPE小柱或?yàn)V膜首先應(yīng)根據(jù)待測物的理化性質(zhì)和樣品基質(zhì)，選擇對待測物有較強(qiáng)保留能力的固定相。若待測物帶負(fù)電荷，可用陰離子交換填料，反之則用陽離子交換填料。若為中性待測物，可用反相填料萃取。SPE小柱或?yàn)V膜的大小與規(guī)格應(yīng)視樣品中待測物的濃度大小而定。對于濃度較低的體內(nèi)樣品，一般應(yīng)選用盡量少的固定相填料萃取較大體積的樣品。3．2活化萃取前先用充滿小柱的溶劑沖洗小柱或用5～10ml溶劑沖洗濾膜。一般可先用甲醇等水溶性有機(jī)溶劑沖洗填料，因?yàn)榧状寄軡櫇裎絼┍砻?，并滲透到非極性的硅膠鍵合相中，使硅膠更容易被水潤濕，之后再加入水或緩沖液沖洗。加樣前，應(yīng)使SPE填料保持濕潤，如果填料干燥會降低樣品保留值；而各小柱的干燥程度不一，則會影響回收率的重現(xiàn)性。953．3加樣一般可采取以下措施：(1)用0．1mol／L酸或堿調(diào)節(jié)，使pH<3或pH>9，離心取上層液萃取；(2)用甲醇、乙腈等沉淀蛋白質(zhì)后取上清液，以水或緩沖液稀釋后萃??；(3)用酸或無機(jī)鹽沉淀蛋白質(zhì)后取上清液，調(diào)節(jié)pH值后萃取；(4)超聲15min后加入水、緩沖液，取上清液萃取。尿液樣品中的藥物濃度較高，加樣前先用水或緩沖液稀釋，必要時(shí)可用酸、堿水解反應(yīng)破壞藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，然后萃取。流速應(yīng)控制為2～4ml／min，流速快不利于待測物與固定相結(jié)合。

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3．4清洗填料反相SPE的清洗溶劑多為水或緩沖液，可在清洗液中加入少量有機(jī)溶劑、無機(jī)鹽或調(diào)節(jié)pH值。加入小柱的清洗液應(yīng)不超過一個(gè)小柱的容積，而SPE濾膜為5～10ml。3．5洗脫待測物應(yīng)選用5～10ml離子強(qiáng)度較弱但能洗下待測物的洗脫溶劑。若需較高靈敏度，則可先將洗脫液揮干后，再用流動相溶解殘留物后進(jìn)樣。能力較弱的SPE填料可用小體積、較弱的洗脫液洗下待測物，再用極性較強(qiáng)的HPLC分析柱柱分析洗脫物。若待測物可電離，可調(diào)節(jié)pH值，抑制樣品離子化，以增強(qiáng)待測物在反相SPE填料中的保留，洗脫時(shí)調(diào)節(jié)pH值使其離子化并用較弱的溶劑洗脫，收集洗脫液后再調(diào)節(jié)pH值使其在HPLC分析中達(dá)到最佳分離效果。在洗脫過程中應(yīng)減慢流速，用兩次小體積洗脫代替一次大體積洗脫，回收率更高。

97固相微萃取固相微萃取可用于氣相色譜，也可用于液相色譜。用于GC時(shí)．是將固相微萃取針管(不銹鋼套管)插入進(jìn)樣口，使用進(jìn)樣口的高溫?zé)峤馕繕?biāo)化合物，解吸后被載氣帶入色譜柱。們于HPLC時(shí)，是將固相微萃取針管(不銹鋼套管)插入固相微萃取41PLc接口解吸池，然后再利用HPLC的流動相通過解吸池洗脫目標(biāo)化合物，并將目標(biāo)化合物帶入色譜柱。

983關(guān)于結(jié)合物的水解問題所謂體內(nèi)的結(jié)合物是指藥物進(jìn)入體內(nèi)，有的以原型，有的經(jīng)氧化、還原、水解后生成的代謝產(chǎn)物與體內(nèi)的葡萄糖醛酸、醋酸、硫酸等結(jié)合而生成的化合物．由于它們較原型的藥物具有較大的極性，不易被有機(jī)溶劑所提取，所以常需要通過水解將藥物游離后，再用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取、分離和測定．對于體內(nèi)結(jié)合物的水解，常采用以下兩種方法：99(1)酸水解通常用1﹪的鹽酸一定量在加熱100℃情況下水解30min、就能將結(jié)合物水解成游離型藥物，酸水解對一些硫酸酯和葡萄糖醛酸來說，條件比較嚴(yán)格，且可能得到較高的空白值及不好的薄層層析色譜圖．(2)酶水解通常采用葡萄糖醛酸酶—硫酸酯酶混合酶，在pH4．5—5．5、37℃培育數(shù)小時(shí)，進(jìn)行水解．酶水解的優(yōu)點(diǎn)是被測藥物或共存物很少會發(fā)生降解．但其缺點(diǎn)也是比較明顯的．例如酶水解時(shí)間較長，以及內(nèi)酶制劑引入的粘液蛋白可能導(dǎo)致乳化及色譜柱頂部阻塞，且在尿液中采用酶水解時(shí)需要先去除尿液中能抑制酶的陽離子．1004膜分離技術(shù)

（一）概述

膜分離是近年來新發(fā)展起來的可用于分析化學(xué)領(lǐng)域中的新技術(shù)之一。20世紀(jì)80年代以來，相繼涌現(xiàn)了膜引進(jìn)質(zhì)譜，膜—?dú)庀嗌V／質(zhì)譜(GC／MS)，膜—微捕集質(zhì)譜(membranc—micr。traP／MS)．膜萃取—?dú)庀嗌V等技術(shù)和分析方法。膜在揮發(fā)性有機(jī)物的分離和在Gc和Ms分析樣品制備中的應(yīng)用研究越來越多，發(fā)展也越來越快。至今，應(yīng)用膜分離技術(shù)或者膜與其他分離技術(shù)的聯(lián)用已經(jīng)成功地完成了許多種類樣品的基體分離和濃縮，包括各種氣體和蒸氣樣品、多水和液體樣品、某些固體樣品等等。

101膜分離技術(shù)不但可以進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)的分離和濃縮，而且可以進(jìn)行半揮發(fā)性的或者不揮發(fā)性的物質(zhì)的分離和濃縮。目前，已經(jīng)在樣品分析儀器的市場上出現(xiàn)了多種形式的應(yīng)用膜分離技術(shù)的產(chǎn)品，諸如：膜直接引進(jìn)裝置、膜萃取—微捕集串聯(lián)裝置、膜—質(zhì)譜聯(lián)用儀器等。由于膜分離技術(shù)具有裝置結(jié)構(gòu)簡單、操作程序方便、無需有機(jī)溶劑處理、可與各種分析儀器直接連接，易于實(shí)現(xiàn)自動化操作和在線在場操作等．所以膜分離技術(shù)的應(yīng)用涉及分析領(lǐng)域中幾乎所有的方面，并且取得了引人注目的結(jié)果。102當(dāng)然，膜分離技術(shù)與其他的分離技術(shù)一樣，存在著某些不足，諸如：膜的強(qiáng)度較差、使用壽命較短、易于受到污染而影響分離效率等等。盡管如此，膜分離技術(shù)與現(xiàn)代分析儀器的結(jié)合仍然可以完成大量的分析測試工作，成為當(dāng)代最具競爭力的分析樣品制備技術(shù)。

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采用聚甲基硅氧烷膜材料分離氣體或蒸氣分子的傳輸機(jī)制是溶解—擴(kuò)散過程。樣品中有機(jī)物分子通過膜進(jìn)行分離通常需要經(jīng)過如下5個(gè)步驟：①樣品中的有機(jī)物分子通過擴(kuò)散到達(dá)膜介質(zhì)的一側(cè)表面：②有機(jī)物分子被溶解并進(jìn)入膜中；③在膜中，被溶解的有機(jī)構(gòu)分子形成濃度梯度并擴(kuò)散過膜；④在膜的另一側(cè)表面，有機(jī)物分子解吸成為蒸氣；⑤有機(jī)物蒸氣分子滲透并脫離膜介質(zhì)表面。104（三)微透析技術(shù)

微透析技術(shù)作為一種直接進(jìn)行的細(xì)胞外液痕量物質(zhì)采樣的方法，微透析技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于動物和人體的研究，特別是在局部藥動學(xué)研究中具有其他方法難以取代的地位。該技術(shù)自上個(gè)世紀(jì)70年代發(fā)展至今經(jīng)歷了由單點(diǎn)取樣，雙位點(diǎn)取樣、三聯(lián)取樣到四聯(lián)取樣的發(fā)展過程。

105（1）單點(diǎn)取樣：1972年，DelgadoJM[135]采用一支探針置于恒河猴腦部動態(tài)取樣,觀察腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺釋放。王丹巧等采用微透析技術(shù)研究了帕金森病模型大鼠紋狀體內(nèi)多巴胺的代謝過程

106（2）雙位點(diǎn)取樣：隨著微透析技術(shù)應(yīng)用增多、新型探針不斷出現(xiàn)、操作技術(shù)日趨成熟,最初的腦內(nèi)單位點(diǎn)微透析技術(shù)發(fā)展至多位點(diǎn),應(yīng)用范圍也從腦科學(xué)逐漸擴(kuò)展至心、肺、肝、膽、腎、眼、皮膚、骨骼肌、脂肪、血液等器官和組織的生理、病理、藥理及臨床研究等各個(gè)領(lǐng)域。傳統(tǒng)的藥動學(xué)研究多是采用血液或組織勻漿進(jìn)行的,而微透析技術(shù)的應(yīng)用,使活體狀態(tài)下連續(xù)觀察血液和機(jī)體特定部位的游離藥物濃度變化成為可能,進(jìn)而更真實(shí)地反應(yīng)藥物在機(jī)體吸收、分布,代謝、排泄的過程。107(3)三聯(lián)取樣：ShinkaiN[140]和MathyFX[141]等進(jìn)行了基于皮膚、關(guān)節(jié)、血液的三聯(lián)微透析技術(shù)。TsaiP[142]等采用微透析技術(shù)分析了SD大鼠血、肝臟、膽汁中小檗堿的其藥代動力學(xué)變化，結(jié)果提示小檗堿的肝膽排泄是逆濃度差的主動轉(zhuǎn)運(yùn)。108（4）四聯(lián)取樣：目前微透析技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到四聯(lián)探針技術(shù),即在麻醉動物體內(nèi)同時(shí)插入四根探針,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要監(jiān)測4種不同組織或同一組織4個(gè)不同部位的藥物代謝動力學(xué)變化

109（四）:生物樣品中待測組分的濃集

生物樣品在萃取過程中，不僅待測組分得到純化，而且還有可能被初步濃集。在實(shí)際工作中，微量待測組分往往分布于較大體積的萃取溶劑中，不能直接供氣相色譜和高效液相色譜測定．因此必須采取相應(yīng)措施，使被測組分濃集.110實(shí)際工作中常用的濃集方法有兩種：—種方法足用盡量少的萃取液，使被測組分萃取到小體積溶劑中，然后直接吸取適量進(jìn)樣分析測定；另一種采用揮去溶劑的方法．但應(yīng)避免直接加熱濃縮，因?yàn)橹苯蛹訜峥赡芷茐谋粶y組分或引起被測組分揮發(fā)損失。揮去萃取溶劑常用的方法是將萃取液置離心試管中，緩緩?fù)ㄈ霘怏w，一般可通入壓縮空氣，遇氧不穩(wěn)定的組分可改用氮?dú)狻?/p>

111對熱穩(wěn)定的被測組分，為加快溶劑的揮發(fā)可將離心試管置一定溫度的水浴中；對熱不穩(wěn)定或易隨氣流揮發(fā)的被測組分，可采用減壓法揮去溶劑，可將萃取液的離心試管置玻璃真空干燥器內(nèi)緩緩抽氣，減壓下使溶劑揮干。112毛細(xì)管電泳柱上富集技術(shù)是既發(fā)揮了毛細(xì)管電泳技術(shù)的優(yōu)勢又適應(yīng)了當(dāng)前痕量分析要求而發(fā)展起來的樣品在線富集檢測技術(shù)，它不需要特殊的設(shè)備，消耗試劑少，操作簡單，成本較低，靈敏度高，因此，它的出現(xiàn)引起的研究工作者廣泛注意，相應(yīng)的改進(jìn)工作及其推廣應(yīng)用研究得以大量開展。

1131電堆集技術(shù)1．1電堆集1．2大體積電堆集1．3柱頭場放大樣品堆集(FASS)2動態(tài)pH界面一CE聯(lián)用技術(shù)3Sweeping—CE3．1Sweeping富集技術(shù)3．2陰、陽離子選擇性完全捕集1143．3DynamicpHJunction—Sweeping(動態(tài)pH界面富集技術(shù)與Sweeping富集技術(shù))115第四節(jié)生物樣品分析方法的建立與驗(yàn)證

一、分析方法的建立1.建立分析方法前應(yīng)了解的內(nèi)容①藥物的主要理化件質(zhì)（極性、酸堿性、溶解度、穩(wěn)定性、以及對光的吸收或熒光性質(zhì)等）；②藥物體內(nèi)存在狀況（游離或結(jié)合）、體內(nèi)代謝以及主要藥代動力學(xué)參數(shù)；③分析方法應(yīng)用的目的：應(yīng)用于新藥體內(nèi)研究（如藥代動力學(xué)、生物利用度）的方法，不強(qiáng)調(diào)快速、簡便，