水生生物監(jiān)測(cè) 環(huán)境DNA宏條形碼法- 編制說(shuō)明

《水生生物監(jiān)測(cè)環(huán)境DNA宏條形法》征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明《水生生物監(jiān)測(cè)環(huán)境DNA宏條形碼法》標(biāo)準(zhǔn)編制組二零二二年五月

目次TOC\o"1-2"\h\z\u1項(xiàng)目背景 附錄F

（規(guī)范性）

生物統(tǒng)計(jì)表檢測(cè)單位：檢測(cè)人：樣品采集日期：年月日樣品處理日期：點(diǎn)位名稱：樣品序列數(shù)：分子分類單元編號(hào)序列門(mén)綱目科屬種序列數(shù)相對(duì)豐度附錄G

（規(guī)范性）

野外質(zhì)量控制與保證G.1樣品的采集G.1.1制定合理的采樣操作程序，在確定的采樣時(shí)間、采樣點(diǎn)、采樣層次，用符合質(zhì)量要求的統(tǒng)一設(shè)備采樣，采水量或采泥量盡量保持一致，以保證采集的樣品具有代表性和可比性。G.1.2保證所有野外設(shè)備處于良好的運(yùn)行狀態(tài)，應(yīng)制定一項(xiàng)常規(guī)檢查、維護(hù)及/或校準(zhǔn)的計(jì)劃，以確保野外數(shù)據(jù)的異質(zhì)性和質(zhì)量。G.1.3合理安排各類生物樣品采集順序，盡量避免生物類群在采集前受到較大擾動(dòng)。G.1.4正確填寫(xiě)樣品標(biāo)簽，包括樣品編號(hào)、日期、水體名稱、采樣位置以及采集人姓名。G.1.5及時(shí)在現(xiàn)場(chǎng)處理樣品。受生物活動(dòng)影響，隨時(shí)間變化明顯的項(xiàng)目應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)測(cè)定。G.1.6水樣采集后可應(yīng)選用冰袋或4°C短暫保存，并在6小時(shí)內(nèi)完成過(guò)濾。G.1.7整個(gè)采樣和前處理過(guò)程盡量保持無(wú)外源污染，符合以下要求：a) 應(yīng)全程佩戴無(wú)菌實(shí)驗(yàn)手套，采集下一個(gè)樣品應(yīng)及時(shí)更換手套。b) 采樣和前處理過(guò)程宜采用一次性無(wú)菌裝置或耗材。對(duì)于重復(fù)使用裝置和耗材，應(yīng)選用漂白劑（次氯酸鈉的濃度不低于1.5%）消毒不少于1分鐘。c) 重復(fù)使用的采樣瓶，應(yīng)浸泡在漂白劑中不少于5分鐘，用蒸餾水重復(fù)沖洗3次，并晾干。在采樣點(diǎn)，再次用水樣沖洗三次，在采集樣品前應(yīng)除去任何殘留的漂白劑。確保清洗后丟棄的水樣未與待取的水樣混合。d) 應(yīng)只從外部接觸采樣瓶，不得接觸采樣瓶及瓶蓋內(nèi)部。e) 如果有必要進(jìn)入水中采樣，應(yīng)使用膠靴，并在采樣點(diǎn)之間進(jìn)行消毒。清除鞋底和靴子兩側(cè)的所有污垢、鵝卵石和其他環(huán)境碎屑。f) 水樣過(guò)濾前，不應(yīng)讓手套接觸被污染的表面，如任何未消毒的設(shè)備。若接觸，應(yīng)及時(shí)更換手套。g) 過(guò)濾水樣前，每個(gè)樣品的過(guò)濾器接觸面應(yīng)使用漂白劑消毒不少于1分鐘，并用蒸餾水沖洗3遍。G.1.8所有使用漂白劑產(chǎn)生的廢物須收集運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，按照危險(xiǎn)廢物處理。G.2采樣記錄G.2.1認(rèn)真填寫(xiě)環(huán)境采樣記錄表，見(jiàn)附錄A。除了樣品相關(guān)信息，采樣時(shí)間、地點(diǎn)、經(jīng)緯度、水溫、氣溫、水文、采樣介質(zhì)等也應(yīng)有詳細(xì)記錄，確保采樣現(xiàn)場(chǎng)數(shù)據(jù)的完整性。G.3樣品的運(yùn)輸G.3.1應(yīng)根據(jù)采樣記錄或登記表核對(duì)清點(diǎn)樣品，以免有誤或丟失。G.3.2樣品運(yùn)輸應(yīng)按照要求的貯存溫度執(zhí)行，必要時(shí)需準(zhǔn)備冷藏設(shè)備。G.3.3運(yùn)輸中應(yīng)仔細(xì)保管樣品，以確保樣品無(wú)破損、無(wú)污染。應(yīng)避免強(qiáng)光照射及強(qiáng)烈震動(dòng)。G.3.4樣品的運(yùn)輸盡量迅速。G.4樣品的保存G.4.1按照要求分別保存各類樣品，保存時(shí)，每隔一周檢查固定液，必要時(shí)進(jìn)行添加。G.4.2不同介質(zhì)來(lái)源的環(huán)境DNA樣品應(yīng)單獨(dú)運(yùn)輸保存，宜置于不同冰箱中保存，若條件有限，應(yīng)置于冰箱的不同儲(chǔ)存室。G.4.3環(huán)境樣品不得與DNA樣品共同運(yùn)輸保存，宜置于不同冰箱中保存，若條件有限，應(yīng)置于冰箱的不同儲(chǔ)存室。

附錄H

（規(guī)范性）

實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制與保證H.1實(shí)驗(yàn)室要求H.1.1DNA提取實(shí)驗(yàn)室和PCR實(shí)驗(yàn)室須在物理空間上相互獨(dú)立，不應(yīng)有空氣的直接相通。H.1.2PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備紫外線超凈工作臺(tái)。H.1.3每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備專用的實(shí)驗(yàn)工作服，并定期清洗。H.2基本操作要求H.2.1實(shí)驗(yàn)人員不得在同一天進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。H.2.2確保所有儀器和設(shè)備處于良好的工作狀態(tài)，重要儀器（如PCR儀、離心機(jī)、冰箱和移液槍）應(yīng)進(jìn)行定期校準(zhǔn)和維護(hù)。H.2.3確保所有的實(shí)驗(yàn)耗材和試劑在保質(zhì)期內(nèi)，在正確的pH值下，可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行高壓蒸汽滅菌。H.2.4實(shí)驗(yàn)耗材（如槍頭、離心管和PCR管等）須高溫滅菌。H.2.5實(shí)驗(yàn)操作前，應(yīng)用1.5%的漂白劑擦拭桌面，用75%乙醇消毒雙手，用1.5%的漂白劑消毒實(shí)驗(yàn)儀器。H.2.6實(shí)驗(yàn)操作前，移液槍?xiě)?yīng)選用75%的酒精消毒或紫外線消毒30min。H.2.7實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)全程穿著實(shí)驗(yàn)服，并佩戴一次性無(wú)菌實(shí)驗(yàn)手套。H.2.8實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，移液槍不得接觸任何盛放樣品或試劑的容器內(nèi)壁。H.2.9同一耗材（例如1.5mL離心管、移液槍頭等）不得重復(fù)接觸來(lái)自不同樣品的實(shí)驗(yàn)材料。H.2.10實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)小心開(kāi)關(guān)容器蓋，樣品不宜長(zhǎng)時(shí)間敞口放置。H.2.11懷疑或確定產(chǎn)生交叉污染的樣品、試劑或耗材，不得繼續(xù)使用。H.3環(huán)境DNA提取H.3.1實(shí)驗(yàn)操作前，應(yīng)用1.5%的漂白劑擦拭桌面。H.3.2DNA提取應(yīng)全程佩戴口罩，防止刺激性氣味和交叉污染。H.3.3沉積物稱量和轉(zhuǎn)移宜選用一次性無(wú)菌稱量匙。H.3.4同一批次實(shí)驗(yàn)應(yīng)最后處理陽(yáng)性對(duì)照樣品。H.3.5準(zhǔn)確記錄陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)樣品的DNA濃度和質(zhì)量。H.3.6應(yīng)按照要求對(duì)DNA樣品進(jìn)行分裝和保存。環(huán)境DNA應(yīng)長(zhǎng)期保存，準(zhǔn)確記錄、標(biāo)記完整。H.3.7陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和樣品的DNA應(yīng)分開(kāi)保存，在物理空間上相互獨(dú)立?？杀４嬖诓煌洌魲l件有限，可保存在冰箱的不同分層。H.4宏條形碼擴(kuò)增與保存H.4.1PCR混合試劑配制宜在紫外線超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。H.4.2紫外線超凈工作臺(tái)使用前，應(yīng)紫外線消毒30min。H.4.3原始測(cè)序數(shù)據(jù)應(yīng)按照GB/T35890的規(guī)定保存為FASTQ文件，并準(zhǔn)確記錄測(cè)序數(shù)據(jù)的樣品來(lái)源、編號(hào)、擴(kuò)增引物和對(duì)應(yīng)的Index信息等。H.5生物信息學(xué)分析H.5.1陰性對(duì)照中的序列數(shù)應(yīng)小于樣品平均序列數(shù)的10%，并剔除樣品中包含的陰性對(duì)照序列。H.5.2生信分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)集應(yīng)妥善存儲(chǔ)，并按照要求記錄保