41 轉(zhuǎn)基因果蠅模型的建立

實驗!1!轉(zhuǎn)基因果蠅模型的建立41.1實驗原理1981年，科學家構(gòu)建出帶有控制眼睛顏色基因的轉(zhuǎn)座子iyl,注射到果蠅胚胎后，發(fā)育出的果蠅眼睛的顏色為野生型，這表示轉(zhuǎn)入的基因己在體內(nèi)表達。這一性狀隨果蠅繁殖保留了卜來。隨著第一只轉(zhuǎn)基因果蠅誕生，轉(zhuǎn)基因果蠅已經(jīng)成為研究廣范的生物學問題和現(xiàn)象的一種技術(shù)了。實際上，任何克隆基因可以用P轉(zhuǎn)座因子系統(tǒng)插入到基因組中。轉(zhuǎn)基因果蠅是指用實驗導入的方法使外源基因在果蠅的染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合，然后遺傳給后代的果蠅。實際上，注射的DNA由兩部分組成。一部分是含有缺陷型P因子的輔助質(zhì)粒，它雖然能夠產(chǎn)生P因子轉(zhuǎn)座酶，能夠幫助P因子轉(zhuǎn)化，但是它本身不能移動；第二部分是P轉(zhuǎn)座子構(gòu)件，由P因子的轉(zhuǎn)座基因與目的基因構(gòu)建而成的重組載體。在沒有輔助載體的情況下，P因子構(gòu)件是不能轉(zhuǎn)座整合到果蠅基因組中去的。但當輔助載體存在時，它含有的轉(zhuǎn)座酶可以幫助P因子轉(zhuǎn)座，從而使目的DNA（基因）進入細胞核，再伴隨P因子一道轉(zhuǎn)座整合到基因組上：從而可以產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因果蠅。存在于P因子序列之間的可選擇性的標記基因（如眼色基因）可用來檢測和鑒定轉(zhuǎn)基因果蠅的生成。41.2實驗材料1.質(zhì)粒DNA溶液的準備1)2)3)溶液I：50nmioVL25nmiol/L10nmiobL在4°C貯存。溶液II0.21)2)3)溶液I：50nmioVL25nmiol/L10nmiobL在4°C貯存。溶液II0.2mol/L1%配制新鮮的。溶液III5moL;L6011.5niL28.5niL葡萄糖Tns-Cl(pH=8.0)EDTANaOHSDSniLKAc冰醋酸水4)3M醋酸鈉，貯存在室溫6個月或等份分裝置-20°Co2.培養(yǎng)基4)1）葡萄汁平板:30g瓊脂加入1L水，在微波爐里溶解;分別加360niL葡萄汁，2g羥苯甲酸甲酯;30g購買的糖，在熱金屬板上攪拌溶解；把葡萄汁加到溶解的糖中攪拌好，倒入100nun的培養(yǎng)皿內(nèi)o2）酵母糊：將干酵母加到水中，直到變成花生醬狀（30g酵母加入50mL水）：加點摩礫層（顏色變成黑色，比花生醬還軟，但在平板上不會流動）。果蠅品系：白眼品系。其他材料和藥品1）購買的籃狀型咖啡過濾器2）酚、氯仿3）鹵經(jīng)油，系列7004）漂白劑（次氯酸納）5）EB染液6）乙醇7）TAE8）異丙醇9）雙面膠，12nun寬10）塑料大口杯11）注射用玻璃毛細管12）銀子13）pMD18-T和pUAST載體14）DNA分子量標記15）PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA純化試劑16）柱式質(zhì)粒純化試劑盒4.儀器倒置顯微鏡、體視顯微鏡（圖41-1）、拉針儀、微量移液器、轉(zhuǎn)基因儀、顯微操作器、低溫高速臺式離心機、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、SHINADZU電子天平、HX-1050恒溫循環(huán)器、超凈工作臺、X-90型暗箱式紫外透射儀、THZ-82B氣浴恒溫振蕩器、YY-III-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYY-III型電泳槽、微波爐、XK96-A快速混勻器、GBII240-89不銹鋼電熱恒溫水浴鍋、TGR16-12高溫冷凍離心機、血sc。離心機、超純水純化儀41.3實驗方法1.DNA的制備1）目的基因片段的獲得：（1）.通過PrunerPreimer5.0程序設(shè)計引物序列，并引入EcoRI酶切位點：PCR擴增目的片段后純化；（2）連接到pMD18-T±o具體連接反應(yīng)如下：pMDBTl匹，PCR產(chǎn)物5匹，連接溶液16ML,16°C連接過夜；（3）構(gòu)建好的pMD18-T一目的基因的轉(zhuǎn)化：將100匹的感受態(tài)細胞（DH-5a）加入10pL的pMD18-T目的基因連接子中，置冰上30min；42°C30-90s熱休克；迅速冰上冷卻3~5min；加入1niLLB液體培養(yǎng)基（未加抗生素），37°C搖床1h；3000rpm離心2min,去700pL上清，：剩下菌液混勻，取出150卜iL涂布在37笆預熱含氨茉青霉素的平板培養(yǎng)基上,剩余菌液4°C保存；倒置平板，于37°C培養(yǎng)，12h可出現(xiàn)菌落（4）pMD18-T目的基因陽性克隆的篩選與鑒定隨機挑選單個菌落于含氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基（lOOpg/mL）中，37°C搖床培養(yǎng)15h左右，小量制備質(zhì)粒DNA,瓦wRl和Ps/I酶切鑒定是否含插入片段。分光光度計測定質(zhì)粒DNA的濃度，設(shè)計酶切反應(yīng)體系是：EcoRl與Psfl各1匹，RNase0.5匹，10XHBuffer2pL,質(zhì)粒DNA1pL,超純水15.5將反應(yīng)液成分按以上比例加入EP管中，混勻，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中酶切過夜，次口電泳點樣檢查。（5）.pMD18-T-目的基因質(zhì)粒的酶切、目的片段的純化回收用EcoRl酶切pMD18-T-目的基因10匹質(zhì)粒,將反應(yīng)液成分按以上酶切鑒定的比例加入EP管中，混勻，于37°C恒溫培養(yǎng)箱放置過夜，次口用合適濃度的瓊脂糖凝膠，60V電壓2-3h電泳，以使目的DNA片段和其它DNA片段盡可能分開，切下所要回收的瓊脂塊。用純化試劑盒回收。2）pUAST重組載體的構(gòu)建（1）用EcoRI酶切pUAST質(zhì)粒，反應(yīng)體系如下：EcoRl20pL,10XHBuffer20pL,質(zhì)粒DNA40pL,超純水120pL,總體枳200pL。將反應(yīng)液成分加入EP管中，混勻，于37°C恒溫培養(yǎng)箱放置過夜，點樣3pL檢查，確認質(zhì)粒完全切開；（2）去磷酸化：反應(yīng)體系如下：CIAP6pL,AlkalinePlusahataseBuffer40|.iL,質(zhì)粒DNA197pL,超純水157pL,總體枳200將反應(yīng)液成分加入EP管中,混勻，于水浴50°C放置30mm；（3）加入酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提一次，吸上清；（4）加入三氯甲烷抽提兩次，吸上清；（5）加入0.1倍體積3MNaAc和三倍體枳的無水乙醇：（6）-20°C放置30min；（7）12000rpm離心15-20min,棄上清,空氣干燥;加入10|1L超純水，-20°C保存；載體pUAST和目的基因的連接，連接的方法和比例參照1.1).(2);pUAST-目的基因連接子的轉(zhuǎn)化，方法同1.1).(3);pUAST-目的基因陽性克隆的篩選和鑒定，方法同1.1).(4);pUAST-目的基因質(zhì)粒的大量制備挑取連接正確的菌種加入500niL的液體培養(yǎng)基中，放入37°C搖床培養(yǎng)約16小時；EP管中加50mL菌液，6000rpm離心2min,棄上清，重復一次；加入溶液I4mL,重懸打散；加入溶液II8mL,顛倒5-10次，冰上放置小于5min；加入溶液III6mL,顛倒5-10次，冰上放置5T0null；4000rpm離心10mm4°C吸上清轉(zhuǎn)管，加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),混勻，4000ipm離心5inin:吸上清轉(zhuǎn)管，加入等體積三氯甲烷，混勻，4000rpm離心5min：重復一次；吸上清轉(zhuǎn)管，加入0.7倍體枳的異丙醇沉淀，6000rpm離心15nwi;棄上清，加入1mL70%酒精，4000rpm離心5min；棄上清，干燥2h；加入500匹滅菌ddH2Oo放入65笆水浴鍋中30min使DNA酶失活加入RNase放入37°C培養(yǎng)箱中消化過夜；點樣2卜(L檢查濃度。2.胚胎的制備受體果蠅系是yw(yellowwhite-通常用yDf(1)"和為，一*個不能自動恢復的缺少白色的品系)°在注射前的至少2d收集約200只羽化的果蠅(2?3d)到籠子里；用有酵母糊的葡萄汁板封閉敞開的一端，按時間規(guī)律飼養(yǎng)果蠅，至少一天換兩次葡萄汁板。用小皿來收集胚胎；當收集用來注射的胚胎時，每30nun換一次平板。丟棄前兩次的收集物，以消除陳舊胚胎的污染；將帶有胚胎的葡萄汁平板自然風干5nun,同時，準備幾個用來注射的蓋玻片；在蓋玻片的一端邊緣貼一塊大約1cm寬的雙面膠；用毛筆或小鐵幺幺輕輕地將葡萄汁平板上的果蠅胚胎排到蓋玻片的雙面膠上；用細尖銀子輕推胚胎的腹部或側(cè)部，使胚胎按照固定的方向整齊排列。排列時,胚胎的后端向外，前端向內(nèi)。如下圖所示。

針頭方向后面前面蓋玻片針頭方向后囪鹵姓油前面蓋玻片圖41-2胚胎在蓋玻片上的排列。等胚胎干燥后，在上而覆蓋一層鹵燃油，厚度要適中。針頭方向后面前面蓋玻片針頭方向后囪鹵姓油前面蓋玻片要保證在玻片上排列胚胎的時間最多2.3min,然后繼續(xù)干燥和注射，因為如果時間過長，胚胎脫水將變化太大。8）胚胎排列到玻片上后，須經(jīng)室溫干燥胚胎，然后用鹵燃油覆蓋（如圖41-2）。干燥可能是影響成活率的關(guān)鍵因素。在注射開始時，要測定幾塊玻片的胚胎材料來確定它的干燥時間（如3,4或5min,這時間要依據(jù)環(huán)境的溫度和濕度而定）。如果卵黃膜被注射針尖推凹，不能立即返回到它的起始形狀，是胚胎太干燥了。如果針尖很順利的刺入胚胎，但是細胞質(zhì)在針尖進入后立即流出，表明胚胎太濕了。干燥時間似乎與溫度更加有關(guān)，一般是25°（2下4?51皿或24°C下5?6min.針頭的準備1）可用任何型號的拉針儀，用1O-|1L的玻璃毛細管加熱拉制針頭。也可以買拉好的針頭；2）在正常情況下，需要將針頭尖折斷，使口徑達到2?4Fun,具體做法是：用一根精細的鈣針將其折斷，或者在針頭安到顯微操作儀上后，將針頭在顯微鏡蓋玻片的邊上壓，以此折斷針頭；3）要將針頭灌液時，可以將一小滴注射液滴在固定于載玻片上的石蠟?zāi)ど希棵饔贸錆M針頭。也可以在針頭的大口接上一個吸頭；4）灌注好的針頭可以將其針尖插入到油中保存起來。注射因為注射必須在極細胞形成之前，所以最好用收集一個小時的胚胎。也可以用一個半小時后的，但通常有很多老胚胎，這些老胚胎在注射過程中通常會被針尖破壞。為了避免胚胎體阻礙針尖，要記錄過期胚胎的位置并在注射后用銀子移開它們。1）拉針：針頭應(yīng)該要提前準備，需要準確調(diào)整微移。插入的毛細管必須足夠小以致小到用肉眼看不見。針頭的延伸部分（插入后的一半）應(yīng)該有1cm長。用拉針儀拉制大小和長度均合適的注射針；2）目的DNA溶液的轉(zhuǎn)移：用微量移液器將目的DNA溶液轉(zhuǎn)移至注射玻璃針內(nèi)。3）破針：簡單的方法是將玻璃注射針的的針尖貼在蓋玻片的邊緣，輕輕移動，直到看到液滴出現(xiàn)。液滴大小合適，說明針尖大小合適：4）把玻璃注射針的末端與程控注射儀相連，以保證針管內(nèi)的溶液可以通過壓力被推進胚胎。同時，玻璃注射針必須固定在顯微操縱器上，以便它能夠三維移動;5）裝上排有去卵殼的胚胎玻片，使胚胎后部朝向針頭；6）在顯微鏡下聚焦，然后移動平臺使胚胎的邊緣剛好與針尖接觸，注射；胚胎蓋玻片（邊緣）圖41-2圖示為果蠅胚胎注射。注意要趕走氣泡，以免細胞質(zhì)從胚胎里漏出來。7）在注射過程中，針頭應(yīng)該很順利的插入。在大部分裝置上，是移動平臺而不是顯微操縱器。然而為了在垂直水平排列有胚胎的針頭，要上下移動顯微操縱器。針頭應(yīng)該插入背部尾端，那里是極細胞形成的地方；8）把胚胎放到針頭（針端應(yīng)該在聚焦區(qū)）來確定針頭接觸哪里，如必要的話，用顯微操縱器調(diào)整針頭的高度；9）當針頭接觸到預期的點，稍微快速穩(wěn)定地移動平臺來插入針頭，使針頭快速順利插入；10）拉回胚胎使針尖盡可能接近卵黃膜，然后釋放壓力注射DNAo注射足夠多以致于在細胞質(zhì)中流動，但不要太多而在拔出針頭時細胞質(zhì)流出。通過移動平臺再重復一次。有時，針頭從注射的胚胎中拔出時被殘骸堵塞。就必須對針頭進行疏通，可以通過在玻片的邊緣接觸，也可■以通過利用壓力和觀察溶液的出現(xiàn)測試恢復端。當然，再次破壞可能會導致針尖太寬影響注射成功，需要用新針頭。11）注射后，胚胎應(yīng)該保存在濕環(huán)境，25°C下22h以上或18°C下3611以上；12）胚胎孵化后，用解剖針收集，把它們輕輕地放入食物小瓶的表面。當用瓊脂食物時，表面應(yīng)該是軟的濕潤的，用解剖針在上面劃線再加一滴水。4.雜交1）分離在1天中涌現(xiàn)的成蟲果蠅，阻止它們自交。為了建立獨立的轉(zhuǎn)基因品系，高效的方法是用含有四個標記性狀的雙平衡品系與注射過的成蟲做單對雜交（如w/w：CyO/Sco：TM3,D）；2）觀察下一代的w+轉(zhuǎn)化珠。盡管出現(xiàn)隱性致死染色體，這種雜交也不會明顯減少與野生型相關(guān)的能繁殖的轉(zhuǎn)基因果蠅的產(chǎn)生；3）每個轉(zhuǎn)化果蠅與單個的平衡系（如yw/yw：CyO/Sco；+/+：或yw/yw；+/+：TM3/D）雜交，根據(jù)與顯性有關(guān)的眼色的分離來確定轉(zhuǎn)基因在哪條染色體上。這種雜交也促進獨立系的建立。例如，如果轉(zhuǎn)基因被證明是在第二條染色體上，P[w+]/CyO平衡系是因為CyO系的雜交的結(jié)果。對于這種雜交，雄性轉(zhuǎn)基因果蠅更可取，因為它們通常產(chǎn)生更多的后代而不必從同胞中分離出來，仍然是原始的。如果許多轉(zhuǎn)基因系來自小瓶，就有可能從單個注射的母本中得到不止一種的獨立系。然而，如果是這樣的話，在個體中就會增加多個插入的可能性，這是不期望的；4）從單個注射母本中取三個轉(zhuǎn)基因個體，分別與單個平衡系交配，通常就能確保有可育系，尤其當它們是雄性時。所以，一旦從瓶中得到了三個轉(zhuǎn)基因果蠅，一般就不用再搜索了。5.成功率1）得到轉(zhuǎn)基因果蠅的效率與注射的質(zhì)粒大小有關(guān)。得到類似的轉(zhuǎn)化效率所用的質(zhì)粒大小范圍是12?22kb。平均孵化率是40?70%,羽化（從孵化的胚胎）率是60?80%,然而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因果蠅（從注射過的胚胎）的效率是5?20%。通常注射40?50個胚胎，可以得到5個或更多的獨立轉(zhuǎn)基因系。2）在不同的系里，眼色表現(xiàn)型依據(jù)轉(zhuǎn)基因在染色體上的插入位點而變化：眼色從微黃到橘黃或紅色。這些小白眼表達的不同水平經(jīng)常與臨近的轉(zhuǎn)基因表達水平有關(guān)。3）有時轉(zhuǎn)化效率比預期的要低好多。實際上，在一些構(gòu)建體中盡管注射了大量的胚胎，但沒有得到轉(zhuǎn)基因果蠅。這可?能是注射的轉(zhuǎn)基因的顯性影響，使可能的轉(zhuǎn)基因果蠅致死或引起不育。有時，只要減少注射的質(zhì)粒的濃度就能解決這個問題，可能是因為插入前的轉(zhuǎn)基因的表達是致死或不育的主要原因。4）如果用低濃度（約20pg/niL）注射，問題還存在的話，在這種條件下平行注射其他構(gòu)建體?；蛘哂肎AL4系，在這個系里，轉(zhuǎn)基因放在GAL4UAS以下，導致開始建立的轉(zhuǎn)基因系不會表達。這個轉(zhuǎn)基因然后通過與激活GAL4表達的另一轉(zhuǎn)基因品系雜交來誘導。5）另外一種策略是放一個含有poly-A信號的FRT盒于轉(zhuǎn)基因的啟動子和開放閱讀框中。得到轉(zhuǎn)基因果蠅后，F(xiàn)RT盒能夠通過介入表達FLPase（催化兩個FRT序列的連接，因此移開起抑制作用的poly-A信號）的轉(zhuǎn)基因而除去。6）如果具有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化效率低，這種轉(zhuǎn)基因的蛋白產(chǎn)物起抑制作用（如LacZ報告基因），這可能是轉(zhuǎn)基因的調(diào)控序列抑制附近的小白眼基因，導致轉(zhuǎn)基因果蠅看不到白眼。如果重新得到轉(zhuǎn)基因品系，它們一般有非常明顯的眼色，整合位點可能接近于小白眼和轉(zhuǎn)基因擴增表達的地方。發(fā)現(xiàn)這個問題可以通過在小白眼可選擇標記基因的啟動子上游的Glass結(jié)合位點來克服。Glass位點增加白眼的表達，是因為Glass蛋白在眼觸角盤狀物（其它含光受體的組織腦內(nèi)的一些細胞）的感應(yīng)現(xiàn)象，因此盡管有抑制效應(yīng)也會觀察到轉(zhuǎn)基因果蠅。然而，這種方法也可能增加轉(zhuǎn)基因插入到異染色或其它抑制DNA中的可■能性，這會導致轉(zhuǎn)基因的抑制表達。41.4注意事項幾種可供選擇的收集胚胎的處方。另外一種是用2%的瓊脂，冰醋酸（每100niL2滴）和酒精（每100niL2滴）。當瓊脂溶液沸騰再冷卻后加入醋酸和酒精。在使用前，每個平板加一些烘干的酵母，冰醋酸大部分用Kimwipe擦干；當注射過的胚胎在培養(yǎng)時，油要注意擴散，使胚胎露出脫水。用油筆在雙面膠上劃圈阻止擴散。然而，厚層油會使胚胎致死，所以用適量的油是胚胎稍微露出直到孵化。用更輕的400系列鹵炷油，來減少厚層油的可能性，但要保持油流動就更加困難了；用CsCl梯度或購買的柱狀物純化的質(zhì)粒DNA可用來注射。然而，這些方法有時產(chǎn)生粘性DNA溶液在針頭形成氣泡，導致注射過程的障礙。沒必要用高純度的DNA；高于500pg/niL的DNA濃度會極大地減少幼蟲的成活率。用低至20pg/mL濃度的DNA,轉(zhuǎn)基因效率高；磷酸緩沖注射液（如，5niMKC1,0.1mMPO『+,pH7.8）通常用來稀釋注射的DNA。然而，用無菌去離子水稀釋DNA到終濃度為lOOpg/mL,這不會明顯地影響幼蟲的成活率和轉(zhuǎn)化的效率；不要將葡萄汁培養(yǎng)皿烘太干，因為果蠅要得到濕氣才行，太干了果蠅也不能躺到上面。酵母糊應(yīng)該是新鮮配制，在培養(yǎng)皿上延伸約1/4的面積，為收集的果蠅提供食物?；\子每4?5d要換，因為籠子干了，果蠅就躺到了表面而不是在收集皿中了。大于12d的就不收集：胚胎收集也可用不含食物的能顛倒的1/2-品脫的玻璃或塑料牛奶瓶，但是要接近收集培養(yǎng)皿（蓋子上有從35nun的培養(yǎng)皿中粘有瓊脂/酵母）。然后，在收集前，100?200條2?10d的成蟲轉(zhuǎn)移到新食物中；一般用次氯酸鈉去卵殼。將水移到平板上，用漆刷輕輕刷表面（刷子是#3,駱駝毛的），將胚胎倒入一個小收集籃里。用水沖洗再轉(zhuǎn)移到50%次氯酸鈉中2.5mm,斷斷續(xù)續(xù)的攪動。用水沖洗在用刷子將胚胎轉(zhuǎn)移到瓊脂糖塊（2%瓊脂，25%糖蜜；用剃刀剪一部分）上。用鐐子將去了卵殼的胚胎排列在瓊脂糖塊上，卵孔挨著糖塊。然后，用紙片的膠端收集胚胎：在前面的注射方法中，建議在18°C下培育。然而，在25°C下不會降低孵化率和整個效率。（梁淑媛袁婺州吳秀山）主要參考文獻■MarindiaDepra;LeniraMariaNunesSepel;ElgionLuciodaSilvaLoretoV.Alow-costappaiatusfbrtransformingDrosophilaanddetectinggreenfluorescentprotein(GFP)geneticmarkers.Genet.Mol.Biol.vol.27no.1SaoPaulo2004.Thumiel,C.S.,Boulet,A.M.,andLipshitz,H.D.VectorsforDrosopliilaP-element-mediatedtransformationandtissuecultuietiansfection.Gene,1988,74,445-456.Sainbrook,J.,Fritsch,E.F?,andManiatis,T.MolecularClonmg:ALaboratoiyManual.2nded.ColdSpringHarborLaboratoiyPress,ColdSpringHaiboi;NewYork.1989.Brand,A.H.andPeniinon,N.Targetedgeneexp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