DNA生物合成課件

第三章DNA的生物合成第三章1

中心法則(TheCentralDogma)

遺傳信息從DNA到蛋白質的傳遞規(guī)律.DNA的遺傳信息轉錄為RNA，RNA通過翻譯指導合成蛋白質。DNA還通過復制將遺傳信息代代相傳。1970年發(fā)現(xiàn)RNA能逆轉錄為DNA，是對中心法則的補充。

逆轉錄 逆轉錄2

復制 DNA的生物合成 逆轉錄

復制（replication）：

以親代DNA為模板合成兩個相同子代DNA的過程。DNA雙螺旋結構堿基配對規(guī)律DNA雙螺旋結構3

第一節(jié)復制的特征第一節(jié)復制的特征4ParentalDNAPossiblemechanismsforreplicationParentalDNAPossiblemechanism5

半保留復制的實驗依據(jù)(M.Meselson&F.W.Stahl,1958)N14半保留復制的實驗依據(jù)N146DNA生物合成課件7

一.半保留復制 (semiconservativereplication)復制時，親代的雙鏈DNA解開成兩條單鏈，分別作為模板，以dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)為原料,

按照堿基配對(A－T、G－C)規(guī)律與模板上的堿基配對,經(jīng)依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)催化,合成一條與模板互補的新鏈,新形成的兩個子代DNA分子與親代DNA堿基序列完全相同。每個子代DNA分子中一股單鏈是從親代完整地接受過來,另一股單鏈是新合成的,故稱為半保留復制。 一.半保留復制8

9DNA生物合成課件10

半保留復制的意義

按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。是物種穩(wěn)定的分子基礎，但是相對的，不是絕對的。半保留復制的意義 11

二.雙向復制1.復制起始點(origin,ori)：多數(shù)生物體內(nèi)DNA分子兩條鏈同時復制。復制是在DNA分子的特定位點開始，稱為復制起始點，常用ori(origin)表示。原核生物的DNA只有一個Ori位點，復制從起點開始，到終點結束，完成整個DNA分子的復制,即原核生物的DNA只有一個復制單位,為單復制子，稱為復制體。

復制子：能獨立完成復制的功能單位。oriori12真核生物染色體DNA有多個復制起始點。同時形成多個復制單位，從一個DNA復制起始點起始的DNA復制區(qū)域稱復制子(replicon)，每個復制子在一個細胞分裂周期中必須起動而且只能起動一次，真核生物染色體為多復制子。真核生物染色體DNA有多個復制起始點。同時形成多個復制單位13

2.復制叉(replicationfork)

復制時，雙鏈DNA由起始點處打開，沿兩條張開的單鏈模板合成DNA新鏈，兩側形成的Y型結構稱為復制叉(replicationfork)。

14

3.雙向復制(bidirectionalreplication)復制是從一個起始點開始，同時向兩個方向進行，稱為雙向復制。

15三.半不連續(xù)復制DNA雙螺旋結構的兩條鏈走向相反，復制時兩條鏈都能作為模板合成子代DNA。DNA的新鏈合成只能沿5’→3’方向進行。DNA解鏈并開始復制后，一條新鏈合成方向與復制叉移動方向相同，即以3’→5’走向的親代鏈為模板，因此該鏈可沿5’→3’方向連續(xù)合成，這條新鏈稱為領頭鏈。另一條鏈合成方向與復制叉移動方向相反，新鏈不能連續(xù)合成稱為隨從鏈。隨從鏈的復制必須待模板鏈解鏈至一定長度才能進行復制，隨復制叉延伸過程，可合成許多DNA片段(岡崎片段)，再經(jīng)連接酶催化形成連續(xù)的新鏈。這種領頭鏈連續(xù)復制，隨從鏈不連續(xù)復制的方式稱DNA復制的半不連續(xù)性。

三.半不連續(xù)復制DNA雙螺旋結構的兩條鏈走向相反，復制時兩16

領頭鏈(leadingstrand)

順著解鏈方向生成的子鏈，其復制是連續(xù)進行的，得到一條連續(xù)的子鏈。

17

隨從鏈(laggingstrand)

復制方向與解鏈方向相反，須等解開足夠長度的模板鏈才能繼續(xù)復制，得到的子鏈由不連續(xù)的片段所組成。岡崎片段(Okazakifragment)岡崎片段(Okazakifragment)18

岡崎片段： 1968年日本生化學者岡崎利用電鏡及放射自顯影技術，觀察到DNA復制中出現(xiàn)一些不連續(xù)的片段，因而將這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段。 原核生物的岡崎片段為一至二千個核苷酸，真核生物約為數(shù)百個核苷酸。

19DNA生物合成課件20

第二節(jié)DNA復制的酶學

21

DNA復制體系復制是在酶催化下的核苷酸聚合過程,需要多種物質的共同參與:

底物：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；

聚合酶(polymerase)：依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol或DDDP；

模板(template)：解開成單鏈的DNA母鏈；

引物(primer)：提供3′-OH末端的寡核苷酸；

其他的酶和蛋白質因子

22

一、DNA聚合酶催化dNTP聚合到核酸鏈上的酶。是DNA復制的主要酶。全稱叫依賴DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指導的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均縮寫為DDDP。一、DNA聚合酶23

(一)DNA聚合酶催化的反應

1.5′至3′的聚合活性

催化四種dNTP一個一個地接到DNA鏈上去。 (dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi

24

聚合反應機理：依賴于引物和模板催化核苷酸聚合有方向性：5′3′依賴于引物和模板25

聚合反應的特點： (1)以單鏈DNA為模板 (2)以dNTP為原料 (3)引物提供3′-OH (4)聚合方向為5′→3′(5)形成3′-5′磷酸二酯鍵

26

2.核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性：切除錯配的核苷酸即時校讀5′→3′外切酶活性：切除引物切除突變的片段？3′→5′外切酶活性：5′→3′外切酶活性：？27

(二)DNA聚合酶的種類

1.原核生物的DNA聚合酶pol-I（400:pol-II40:pol-III20）5′→3′聚合酶活性+++3′→5′外切酶活性+++5′→3′外切酶活性+–-功能切除引物填補空隙修復合成不清復制的主要酶活性最高pol-Ipol-IIpol-III5′→3′聚合酶活性+28

DNA-polI:單一肽鏈的大分子，二級結構以α-螺旋為主，含A－R18個α-螺旋。曾被稱為復制酶(replicase)含量最多功能:對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。proteaseDNA-polI:protease29

N-terminalC-terminalProtease小片段（323A.A）：具有5′→3′外切酶活性大片段（604A.A）：具有5’→3’聚合活性和3′→5′外切酶活性(Klenow片段)是實驗室常用的工具酶。可被水解成兩個片段

N-terminalC-terminalProtease小30

DNA-polIII:是E.coli的復制酶，在復制延長中真正起聚合新鏈作用的DNA聚合酶。由10種亞基組成的不對稱二聚體：?核心酶(α,ε,θ):3’→5’外切酶活性和5’→3’聚合酶活性?β亞基:slidingclampprotein?γ-復合物:識別帶引物的單鏈DNA，促進全酶組裝至模板上，穩(wěn)定酶結構，增強核心酶活性。催化效率最高DNA-polIII:31DNA生物合成課件32

2.真核生物的DNA聚合酶DNA-pol—引物酶活性，復制起始引發(fā)DNA-pol—沒有其他DNA-pol時才起作用DNA-pol—催化線粒體DNA的復制DNA-pol—復制中延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol—與原核生物的DNA-polI相似，在復制中起校讀、修復和填補缺口作用。

33

(三)復制的保真性(fidelity)

至少依賴三種機制：

1.遵守嚴格的堿基配對規(guī)律； 2.聚合酶在復制延長中對堿基的選擇功能； 3.復制中的即時校讀功能。

34DNA生物合成課件35

二、解旋解鏈酶類 解開并理順DNA雙鏈，維持DNA處于單鏈狀態(tài)。主要有解螺旋酶、

DNA拓撲異構酶和單鏈DNA結合蛋白。

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(一)解螺旋酶(helicase)

:

模板對復制的指導作用在于堿基的準確配對，而堿基卻埋在雙螺旋的內(nèi)部。只有把DNA解開成單鏈，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早發(fā)現(xiàn)的與復制有關的蛋白質，當時稱為rep蛋白。作用是利用ATP供能，解開DNA雙鏈。

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復制相關蛋白的基因：dnaA、dnaB、dnaC……dnaX 相應的表達產(chǎn)物蛋白質：DnaA、DnaB、DnaC……DnaX DnaA：辨認復制起始位點

DnaB：解螺旋酶 DnaC：輔助解螺旋酶使其在起始點上 結合并打開雙鏈。

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(二)單鏈DNA結合蛋白(SSB)

:

大腸桿菌SSB是由177個氨基酸殘基組成的同源四聚體，結合單鏈DNA的跨度約32個核苷酸單位。 SSB與解開的DNA單鏈緊密結合，防止重新形成雙鏈，并免受核酸酶降解。在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整。

39DNA生物合成課件40

(三)DNA拓撲異構酶(topoisomerase)

拓撲：是指物體或圖像作彈性移位而又保持物體原有的性質。

拓撲異構酶：是一類可改變DNA拓撲構象的酶。對DNA分子的作用是既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解鏈。

41

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拓撲異構酶I（topoI）:

在原核生物曾被稱為－蛋白。主要作用是切開DNA雙鏈中的一股，使DNA解鏈旋轉中不打結，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)再封閉切口。催化反應不需要ATP。

43DNA生物合成課件44

拓撲異構酶II（

topoII）:

在原核生物又叫旋轉酶(gyrase)。能切斷DNA雙鏈，使螺旋松弛。在ATP參與下，松弛的DNA進入負超螺旋，再連接斷端。

45

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三、引物酶和引發(fā)體引物酶(primase):依賴DNA的RNA聚合酶。

催化RNA引物的合成。

在大腸桿菌，引物酶是dnaG基因的產(chǎn)物。RNA引物：

在DNA模板的復制起始部位由引物酶催化NTP的聚合，形成短片段的RNA，為DNA聚合提供3′-OH末端。

47

引發(fā)體(primosome):

是由DnaB、DnaC等蛋白因子一起形成復合體，再結合引物酶(DnaG)形成較大的聚合體，結合到模板DNA上。

復制開始時，在引發(fā)體的下游解開雙鏈，再由引物酶催化引物的合成。DNA生物合成課件48

四、DNA連接酶（DNAligase）連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，形成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。反應需要ATP/NAD+。只能連接堿基互補基礎上雙鏈中的單鏈缺口，不能連接單獨存在的DNA或RNA單鏈。若DNA兩股都有單鏈缺口，只要缺口前后堿基互補也可連接。ATPATP49

DNA連接酶在復制、DNA修復、

重組、剪接中均起縫合缺口作用。是重要的工具酶之一。

50

第三節(jié)DNA生物合成過程第三節(jié)51

一、原核生物DNA的生物合成（一）復制的起始1.識別復制起始點2.解開DNA雙鏈：由拓撲異構酶松弛超螺旋，解螺旋酶解開雙鏈，SSB結合到單鏈上使其穩(wěn)定。3.形成引發(fā)體和生成引物

GenomeinE.coliGenomeinE.coli52E.coli復制起始點——oriC的序列特征三組各13bp的串連重復序列（Tandemrepeats）兩對9bp反向重復序列（invertedrepeats）,富含AT，是DnaA蛋白的結合部位。E.coli復制起始點——oriC的序列特征三組各53(1)DnaA辨認并結合oriC處并使此區(qū)域DNA解鏈。(2)DnaB在DnaC協(xié)助下解開雙鏈并沿解鏈方向移動，逐漸置換DnaA，SSB結合于解開的單鏈DNA上。(3)引物酶DnaG進入，形成由DnaB、DnaC、DnaG和DNA起始復制區(qū)構成的引發(fā)體。

DNA生物合成課件54DNA生物合成課件55DNA生物合成課件56(4)引發(fā)體的蛋白質在DNA鏈上可以移動,消耗ATP。(5)引物酶DnaG沿5’→3’方向催化NTP聚合，合成短鏈RNA引物。引物長度約為十幾個到幾十個核苷酸不等。聚合酶Ⅲ催化第一個dNTP與引物3‘-OH生成磷酸二酯鍵。拓撲酶作用,使解鏈順利進行。DNA生物合成課件57復制的起始復制的起始58大腸桿菌DNA復制的步驟大腸桿菌DNA復制的步驟59參與復制起始的各種因子DnaA蛋白辨認起始點解螺旋酶（DnaB蛋白，rep蛋白）解開DNA雙鏈DnaC蛋白協(xié)助解螺旋酶引物酶（DnaG蛋白）催化RNA引物生成SSB穩(wěn)定解開的單鏈拓撲異構酶理順DNA鏈oriC(245bp的DNA組分)E.coli的復制起始點名稱功能參與復制起始的各種因子DnaA蛋白60

（二）復制的延長

在DNA聚合酶催化下，以解開的單鏈為模板，以四種dNTP為原料，進行聚合作用。即新進入的dNTP與引物或延長中的子鏈上3′－OH形成磷酸二酯鍵，由5′3′方向延長子鏈。（二）復制的延長61半不連續(xù)復制：（1）領頭鏈合成方向與解鏈方向一致,連續(xù)合成（2）隨從鏈方向與解鏈方向相反,5'→3'不連續(xù)合成

半不連續(xù)復制：62

同一復制叉上，領頭鏈先于隨從鏈復制，但兩鏈由同一DNA-polⅢ催化合成同一復制叉上，領頭鏈先于隨從鏈復制，63

64（三）復制的終止原核生物為環(huán)狀DNA，雙向復制，兩個復制叉的匯合點就是復制的終點(termination,Ter)E.coli的復制終點(32位點)位于環(huán)形染色體和OriC相對處，有特異的終止區(qū)序列，剛好把DNA分成2個半圓,雙向復制進行180度后在終點匯合。（三）復制的終止原核生物為環(huán)狀DNA，雙向復制，兩個復制叉的65

隨從鏈不連續(xù)片段的連接1.引物水解:前一個岡崎片段延長至后一片段時,DNA-polI水解引物；2.填補空隙:polⅠ利用前一個岡崎片段的3′-OH,催化dNTP聚合填補空缺；3.片段連接:DNA連接酶連接二個DNA片段，形成完整的DNA鏈。領頭鏈引物水解后的空隙由環(huán)狀DNA最后復制的3′-OH末端延長填補并連接。復制終止后,2個子代DNA分子相互鉸鏈在一起,在拓撲酶Ⅱ作用下,將其分開。

66222222222222233333333333333333333333333333333333333332222222222222222222222223333333333333333333367真核生物細胞分裂的時相變化——細胞周期:

G1phase:periodgrowthofcell

Sphase:DNA合成期

G2phase:cellsprepareformitosis

Mphase:mitosis

Gophase:nondividingcellsDNAreplicateperiodically二.真核生物DNA的生物合成真核生物細胞分裂的時相變化——DNAreplicatep68真核生物DNA復制的特點真核染色質DNA結構龐大，DNA復制有多個起始點，通過許多獨立復制子完成。每個復制子有固定復制起點，雙向復制。各起點復制起始不同步。真核生物DNA聚合酶有DNA-polα、β、γ、δ、ε。DNA-polδ在復制延長中起催化作用，有解螺旋酶活性。DNA-polα有引物酶活性。拓撲異構酶復制因子(Replicationfactor,RF):RFA,RFC等.增殖細胞核抗原(Proliferationcellnuclearantigen,PCNA)聚合DNA速度比原核DNA-pol慢，但總體速度不慢。隨后鏈也是不連續(xù)合成，岡崎片段比原核細胞的短，只有數(shù)百個核苷酸。真核生物DNA復制的特點真核染色質DNA結構龐大，DNA復制69真核生物線性染色體:多個復制起點，復制叉到達下一個起點或分子末端時即終止。真核生物線性染色體:70DNA生物合成課件71DNA生物合成課件72真核DNA復制的同時,組蛋白、非組蛋白同時合成,復制完成后,裝配成核蛋白,組成染色體。真核DNA復制的同時,組蛋白、非組蛋白同時合成,復制完成后,73DNAligaseDNApolymeraseRNaseHRemoveRNAprimerFillthegapJoinDNAfragmentsDNApolεDNAligase真核生物復制的終止DNAligaseDNApolymeraseRNase74

染色體DNA呈線性，復制在末端停止。

75DNA生物合成課件76

端粒與端粒酶

端粒(telomere)是位于真核細胞線性染色體末端的特殊結構,由一段串聯(lián)重復的富含T、G的DNA短序列與端粒結合蛋白構成；端粒具有穩(wěn)定染色體，防止末端降解和融合的功能；并維持DNA復制的完整性。端粒DNA序列在進化上高度保守，不同生物的端粒序列都很相似，由長5-10bp的重復單位串聯(lián)而成，人類的重復序列為TTAGGG，長約15kb；端粒平均長度隨細胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長而變短,端粒DNA逐漸變短而消失,可導致染色體穩(wěn)定性下降，細胞隨之衰老。端粒與端粒酶77熒光原位雜交顯示的端粒（上）和端粒序列（下）熒光原位雜交顯示的端粒（上）和端粒序列（下）78DNA生物合成課件79端粒酶(telomerase)由RNA和蛋白質構成的一種核糖核蛋白復合體，RNA分子含復制端粒DNA所需的核苷酸模板，其蛋白質部分具有逆轉錄酶活性。能以自身的RNA為模板逆轉錄合成端粒DNA，維持端粒的長度。人類端粒酶含三部分：端粒酶RNA(HumantelomeraseRNA,hTR)、端粒酶協(xié)同蛋白(Humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)、端粒酶逆轉錄酶(Humantelomerasereversetranscriptase,hTRT).除骨髓干細胞、胚胎原始干細胞等細胞外,大多數(shù)正常人體細胞檢測不到端粒酶活性。惡性腫瘤細胞中,85%～90%端粒酶強陽性。端粒酶可作為腫瘤標志和腫瘤治療靶點.

端粒酶(telomerase)80

爬行模型：

81DNA生物合成課件82DNA生物合成課件83

端粒及端粒酶的意義：端粒的長短及端粒酶活性變化與細胞水平的老化(aging)及腫瘤的發(fā)生有一定關系。

84第四節(jié)逆轉錄和其他復制方式一.逆轉錄病毒和逆轉錄酶逆轉錄(reversetranscription)——以RNA為模板，dNTP為原料,在逆轉錄酶催化下,合成與RNA互補的DNA的過程。

逆轉錄酶(reversetranscriptase,依賴RNA的DNA聚合酶) 1.RNA指導的DNA聚合酶活性 2.RNA水解酶活性 3.DNA指導的DNA聚合酶活性第四節(jié)逆轉錄和其他復制方式853DmodelofHIVreversetranscriptase3DmodelofHIVreversetransc86

逆轉錄過程：逆轉錄酶催化的DNA合成反應也是5′→3′方向。需要的引物是病毒本身的一種tRNA。逆轉錄酶催化的DNA合成反應也是5′→3′方向。87DNA生物合成課件88DNA生物合成課件89DNA生物合成課件901.Aretrovirus-specificcellulartRNAhybridizeswithacomplementaryregioncalledtheprimer-bindingsite(PBS).2.ADNAsegmentisextendedfromtRNAbasedonthesequenceoftheretroviralgenomicRNA.3.TheviralRandU5sequencesareremovedbyRNaseH.4.Firstjump:DNAhybridizeswiththeremainingRsequenceatthe3'end.5.ADNAstrandisextendedfromthe3'end.6.MostviralRNAisremovedbyRNaseH.7.AsecondDNAstrandisextendedfromtheviralRNA.8.BothtRNAandtheremainingviralRNAareremovedbyRNaseH.9.Secondjump:ThePBSregionofthesecondstrandhybridizeswiththePBSregionofthefirststrand.10.ExtensiononbothDNAstrands.

LTRstandsfor"longterminalrepeat".DNA生物合成課件91

RNA病毒經(jīng)逆轉錄成為雙鏈DNA，能整合入宿主細胞基因組，并隨宿主細胞復制和表達,可能使宿主細胞發(fā)生癌變。RNA病毒經(jīng)逆轉錄成為雙鏈DNA，能整合入宿主細胞基因組，92DNA生物合成課件93Atypical,"minimal"retrovirusconsistsof:1.anouterenvelopewhichwasderivedfromtheplasmamembraneofitshost2.manycopiesofanenvelopeproteinembeddedinthelipidbilayerofitsenvelope3.acapsid;aproteinshellcontaining4.twomoleculesofRNAand5.moleculesoftheenzymereversetranscriptaseAtypical,"minimal"retroviru94HumanImmunodeficiencyVirus(HIV)

HumanImmunodeficiencyVirus(95DNA生物合成課件96Reversetranscription

invirus分子生物學研究可應用逆轉錄酶合成DNA。以mRNA為模板，經(jīng)逆轉錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈，稱為互補DNA(complementaryDNA,cDNA)cDNAReversetranscription分子生物學研究可97

二.滾環(huán)復制和D環(huán)復制

一些簡單低等生物或染色體以外的DNA復制的特殊形式。

98D環(huán)復制滾環(huán)復制線粒體DNA為D環(huán)復制D環(huán)復制的特點是復制起點不在雙鏈DNA同一位點，內(nèi)、外環(huán)復制有時序差別

D環(huán)復制滾環(huán)復制線粒體DNA為D環(huán)復制D環(huán)復制的特點是復制起99

第四節(jié)

DNA損傷與修復

100

突變(mutation)： 是指遺傳物質結構改變而引起的遺傳信息的改變，也稱為DNA損傷(DNAdamage)。 從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。

101DNA生物合成課件102

一、突變的意義(一)突變是進化、分化的分子基礎

進化過程是突變的不斷發(fā)生所造成的。沒有突變就沒有今天的五彩繽紛的世界。遺傳學家認為：沒有突變就不會有遺傳學。

大量的突變都屬于由遺傳過程自然發(fā)生的，叫自發(fā)突變或自然突變（spontaneousmutation）。

103

(二)突變導致基因型改變

這種突變只有基因型的改變，而沒有可察覺的表型改變。

多態(tài)性(polymophism)：是用來描述個體之間的基因型差別現(xiàn)象。利用DNA多態(tài)性分析技術，可識別個體差異和種、株間差異。

104

(三)突變導致死亡突變發(fā)生在對生命至關重要的基因上，可導致個體或細胞的死亡。

105

(四)突變是某些疾病的發(fā)病基礎包括遺傳病、腫瘤及有遺傳傾向的病。有些已知其遺傳缺陷所在。但大多數(shù)尚在研究中。

106鐮狀細胞貧血

是一種常染色體顯性遺傳血紅蛋白(Hb)病。因β-肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸所代替，構成鐮狀血紅蛋白(HbS),取代了正常Hb(HbA)。鐮狀細胞貧血107DNA生物合成課件108

二、引發(fā)突變的因素

大量的突變屬自發(fā)突變，發(fā)生頻率為10-9。

用生活環(huán)境中導致突變的因素，在實驗室可以誘發(fā)突變，稱為誘變，導致突變的因素稱為誘變劑。主要有物理和化學因素。

109

物理因素：紫外線和各種輻射二聚體的形成影響了DNA的雙螺旋結構,使復制和轉錄受阻二聚體的形成影響了DNA的雙螺旋結構,使復制和轉錄受阻110

化學因素：常見的化學誘變劑化合物類別分子改變堿基類似物(如：5-BU)A→5-BU→G羥胺類(NH2OH)T→C亞硝酸鹽(NO2-)C→U烷化劑(如：氮芥類)G→mG化合物類別分子改變堿基類似物(如：5-BU)A→5-111

三、突變的類型(一)錯配（點突變）

——指DNA分子上一個堿基的變異（置換）。

1.轉換(transition)： 發(fā)生在同型堿基之間的置換嘌呤←→嘌呤嘧啶←→嘧啶 2.顛換(transversion)： 發(fā)生在異型堿基之間的置換嘌呤←→嘧啶

112

鐮形紅細胞貧血病人的Hb(HbS)與正常成人的Hb(HbA)比較HbSHbA基因模板鏈CACCTCmRNAGUGGAG肽鏈第6位氨基酸ValGluHbSHbA基因模板鏈CACCTCmRNAGUGGA113

(二)缺失(deletion)和插入(insertion)

1.缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上缺失 2.插入：DNA大分子上插入一個堿基或一段核苷酸鏈

114

框移突變(frame-shiftmutation):

缺失和插入引起的三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變。通常使基因產(chǎn)物完全失活，出現(xiàn)終止碼會使翻譯提前終止。

正常 5′……GCA

GUA

CAU

GUC…… 丙纈組纈缺失C5′……GAG

UAC

AUG

UC…… 谷酪蛋絲

115

(三)重排(rearrangement)

——DNA分子內(nèi)發(fā)生較大片段的交換，也稱為重組。 移位的DNA可以在新位點上顛倒方向反置（倒位），也可以在染色體 之間發(fā)生交換重組。

116第四章：DNA的突變、損傷和修復第四章：DNA的突變、損傷和修復117第一節(jié)：突變（mutation)第一節(jié)：突變（mutation)118一、突變的主要類型

突變是DNA堿基序列水平上的永久的、可遺傳的改變。堿基序列的變化可以分為下面幾種類型

：堿基替換（basesubstitution），即DNA分子中一個堿基被另一個堿基替代；插入（insertion），涉及一個或多個堿基插入到DNA序列中；缺失（deletion），涉及DNA序列上一個或多個堿基的缺失；第一節(jié)：突變（mutation)一、突變的主要類型突變是DNA堿基序列水平上的永久的119重復（duplication），一段堿基序列發(fā)生一次重復；倒位（inversion），一段堿基序列發(fā)生倒轉，但仍保留在原來的位置上；易位（translocation），一段堿基序列從原來的位置移出，并插入到基因組的另一位置。重復（duplication），一段堿基序列發(fā)生一次重復；倒1201.堿基替換堿基替換又稱為點突變（pointmutation），是一種最簡單的突變。堿基替換可以分為轉換（transition）和顛換（transversion）兩種類型。轉換是指嘌呤與嘌呤之間，或嘧啶與嘧啶之間的替換；顛換是指嘌呤與嘧啶之間的替換。1.堿基替換121DNA生物合成課件122DNA生物合成課件123DNA生物合成課件1242.缺失、插入、移碼突變基因的編碼序列中插入或者缺失一個或兩個堿基，會使DNA的閱讀框架發(fā)生改變，導致插入或缺失部位之后的所有密碼子都跟著發(fā)生變化，結果產(chǎn)生一種截短的或異常的多肽鏈，這種突變稱為移碼突變（frameshiftmutations）。移碼突變常常完全破壞了編碼蛋白質的功能，除非移碼突變發(fā)生在靠近讀碼框的遠端的地方。2.缺失、插入、移碼突變基因的編碼序列中插入或者缺失一個125DNA生物合成課件1263.DNA重排DNA重排包括缺失、倒位、易位和重復?；蚪M中相似序列之間的配對，以及隨后發(fā)生的重組可以造成DNA的重排。如圖，同一DNA分子的兩個同向重復序列之間的配對和重組將使兩個重復序列之間的部分形成一個獨立的環(huán)，從原來的DNA分子上釋放出來。原來的DNA分子則產(chǎn)生相應的缺失。

3.DNA重排DNA重排包括缺失、倒位、易位和重復。127圖表示同一DNA分子上的兩個反向重復序列發(fā)生配對形成的莖環(huán)結構。配對后的重組將導致反向重復序列之間的部分發(fā)生倒位。例如，大腸桿菌染色體含有7個拷貝的rRNA基因。有一些大腸桿菌菌株，染色體上兩個rRNA操縱子之間的序列發(fā)生了倒位。這些菌株能夠存活，但生長速度比正常的菌株要慢一些。

圖表示同一DNA分子上的兩個反向重復序列發(fā)生配對形成128第二部分：突變的修復第二部分：突變的修復129一、光復活（Photoreactivation）

在可見光存在的情況下，DNA光解酶（DNAphotolyase）把環(huán)丁烷嘧啶二聚體分解為單體。DNA光解酶,又稱光復活酶（photoreactivatingenzyme）。光解酶在暗中結合到環(huán)丁烷二聚體上，吸收300～350nm的光后被激活，裂解二聚體后與DNA分子脫離。從光復活修復過程可以看出，光解酶不是將嘧啶二聚體替換掉，而是將兩個嘧啶環(huán)之間的非正?；瘜W鍵切開，恢復到原來的形式。由于這種修復作用只在可見光下才可發(fā)生，所以這種修復機制稱為光復活。

一、光復活（Photoreactivation）在130

(一)光修復(lightrepairing)光修復酶光修復酶131DNA生物合成課件132二、烷基的轉移二、烷基的轉移133核苷酸切除修復需要移去一段包括損傷在內(nèi)的核苷酸序列，然后再通過DNA合成把余下的單鏈缺口填補上。它可以修復一系列損傷，包括環(huán)丁烷二聚體、6－4光產(chǎn)物和鏈間交聯(lián)等引起的DNA變形（majordistortion）。盡管這些損傷也可以通過途徑進行修復，但NER是它們的主要修復手段。其他能夠引起DNA產(chǎn)生顯著變形的損傷也可以通過該途徑進行修復。但是，這種機制不能修復DNA上的錯配堿基，以及僅造成DNA微小變形的堿性類似物和甲基化堿基。三、核苷酸切除修復核苷酸切除修復需要移去一段包括損傷在內(nèi)的核苷酸序列，然后134

修復過程需要多種酶的一系列作用，其中包括UvrA,UvrB,UvrC和UvrD。由2個UvrA亞基和1個UvrB亞基構成的復合體，非特異性地結合在DNA分子上，并沿DNA分子滑動，對DNA進行掃描，其中UvrA負責檢測螺旋中的扭曲，一旦抵達扭曲部位，UvrA就會退出復合體。UvrB募集UvrC,UvrC具有核酸內(nèi)切酶活性，它切斷損傷位點兩側的磷酸二酯鍵，3’切割點距損傷位點4－5個核苷酸，5’切割點距損傷位點8個核苷酸。修復過程需要多種酶的一系列作用，其中包括UvrA,U135UvrD與5’端的切點結合。UvrD是一種解旋酶（又稱DNAhelicaseII），它解開兩個切點之間的DNA雙螺旋，導致一段短的帶有損傷的ssDNA和UvrC被釋放出來，此時UvrB仍結合于另一條單鏈DNA分子上，可能是防止單鏈被降解,也可能是指導DNA聚合酶I與缺口的3’OH結合，合成一段新的核苷酸片斷填補缺口，同時釋放出UvrB,最后一個磷酸二酯鍵由DNA連接酶催化形成。UvrD與5’端的切點結合。UvrD是一種解旋酶（又稱DNA136DNA生物合成課件137四、堿基切除修復DNA糖基化酶（glycosylases）能夠切斷脫氨堿基、甲基化堿基和氧化堿基等非正常堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵，在DNA上產(chǎn)生一個無嘌呤（apurinic）或無嘧啶（apyrimidinic）位點（AP位點）。細胞胞內(nèi)的AP核酸內(nèi)切酶，附著在AP位點上，并在AP位點的5’-端切斷磷酸二酯鍵，形成一個游離的3’－OH末端。DNA聚合酶I利用其5’-3’外切酶活性切去AP位點以及其下游的一段核苷酸序列，同時延伸3’-OH末端填補缺口。最后的切口由DNA連接酶封閉。四、堿基切除修復DNA糖基化酶（glycosylases138DNA生物合成課件139DNA生物合成課件140五、錯配修復（mismatchrepair）DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性可將錯誤摻入的核苷酸去除。聚合酶的這種校正功能將DNA復制的忠實度提高100倍。然而，DNA聚合酶的校正作用并非絕對安全，有些錯誤插入的核苷酸會逃脫檢測，并在新合成的鏈與模板鏈之間形成錯誤配對。在下一輪復制時錯誤插入的核苷酸將指導與其互補的核苷酸插入到新合成的鏈中，結果導致DNA序列中產(chǎn)生一個永久性改變。五、錯配修復（mismatchrepair）DNA聚合141由于復制中出現(xiàn)的錯配堿基存在于子鏈中，因此該系統(tǒng)必須在復制叉通過之后有一種能夠識別親本鏈與子鏈的方法，以保證只從子鏈中糾正錯配的堿基。由于復制中出現(xiàn)的錯配堿基存在于子鏈中，因此該系統(tǒng)必須在復制叉142

當新合成的DNA鏈上出現(xiàn)錯配的堿基對時，2分子的MutS識別并結合錯配的堿基對。接著2分子的MutL蛋白結合到MutS－DNA復合體上。DNA分子通過MutS－MutL復合體在兩個方向上的滑動形成一個回環(huán)。一旦遇到半甲基化的GATC序列，MutS－MutL便募集MutH。MutH在子鏈GATC序列的5’端切斷磷酸二酯鍵，產(chǎn)生一個3’－羥基末端和一個5’－磷酸末端(...pN-3'-OH+pGpApTpC....)。當新合成的DNA鏈上出現(xiàn)錯配的堿基對時，2分子的MutS143核酸外切酶在解旋酶（UvrD）及Ssb蛋白的協(xié)作下，從切口處開始去除一段包括錯配堿基在內(nèi)的一段堿基序列。如果切口位于錯配位點的3’端，此步驟由外切核酸酶I負責完成。如果切口位于錯配位點的5’端，則由能夠從5’至3’方向降解核酸鏈的外切核酸酶VII或RecJ執(zhí)行。最后，DNA聚合酶III和DNA連接酶根據(jù)親本鏈的序列填補子鏈上被切除的部分，包括錯配的堿基。核酸外切酶在解旋酶（UvrD）及Ssb蛋白的協(xié)作下，從切口處144DNA生物合成課件145DNA生物合成課件146DNA生物合成課件147DNA生物合成課件148CH3GATC

CTAGGTGATC5′3′CTAG3′5′GTCH3CH3GATC

CTAGGTMutHMutSMutL切口CH3GATC

CTAGGT5′3′CH3

GATC5′3′

CTAG3′5′TGDNA解鏈酶核酸外切酶SSBdNMPsCH3GATC

CTAGGT5′3′DNA聚合酶DNA連接酶dNTPsCH3GATC

CTAGGC3.2DNA錯配修復的模型CH3GATCC149六、重組修復（recombinationalrepair）在討論重組修復機制之前，有必要先分析一下胸腺嘧啶二聚體對DNA復制的影響。當聚合酶III遇到胸腺嘧啶二聚體時，會在二聚體位點停頓下來。這時，細胞會在二聚體的下游開始下一個岡崎片段的合成，新生鏈在二聚體對應的位置上出現(xiàn)一個缺口。通過重組過程可填補新生鏈上的缺口。缺口可用圖所示的DNA重組方式填補：①受損DNA復制時，一條子代DNA分子在損傷的對應部位出現(xiàn)缺口。六、重組修復（recombinationalrepair）150DNA生物合成課件151②另一條子代DNA分子完整的母鏈與有缺口的子鏈DNA進行重組交換，母鏈DNA上相應的片段被用于填補子鏈上的缺口，而母鏈DNA出現(xiàn)又出現(xiàn)一個新的缺口。③母鏈上的缺口再以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段進行填補，最后由DNA連接酶連接，完成修補。

一個雙鏈損傷變成兩個單鏈損傷②另一條子代DNA分子完整的母鏈與有缺口的子鏈DNA進行重組152重組修復并不能去除損傷，損傷仍然保留在原來的位置。但是重組修復能使細胞完成DNA復制，并且新合成的子鏈是完整的。經(jīng)多次復制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細胞中只有一個細胞是帶有損傷DNA的。重組修復機制對于細胞處理不易被修復或者不能被修復的損傷有著特殊的意義。重組修復并不能去除損傷，損傷仍然保留在原來的位置。但是重153DNA生物合成課件154DNA生物合成課件155RecombinationalRepair(Post-ReplicationRepair)DNAreplicationStructuraldistortionExcisepatchfromintactstrandandinsertingapRepairgapExcisionrepair?(RecA)RecombinationalRepair(Post-R156六、SOS反應（SOSresponses）1.SOS反應：當DNA受到嚴重損傷時，染色體的DNA復制被抑制，進而誘導細胞產(chǎn)生SOS反應：大約20個參與DNA損傷修復和DNA復制功能恢復的基因的表達水平升高，細胞的DNA修復能力得到加強，甚至出現(xiàn)DNA的跨損傷（tanslesionsynthesis）合成。六、SOS反應（SOSresponses）1.SOS反應：1572.LexA:

在正常的細胞內(nèi)，SOS基因的誘導表達被阻遏蛋白LexA抑制。LexA以二聚體的形式與SOS基因啟動子區(qū)的SOS框（SOSbox，5‘-CTG--tenbases--CAG-3‘,TACTGTATATATATACAGTA-3′）結合阻遏了基因的轉錄起始。然而，此時細胞中的某些SOS基因產(chǎn)物也維持在相當高的水平，這是因為有些基因具有另一個不受LexA調(diào)控的啟動子，或者基因的SOS框的堿基序列與一致序列的出入比較大，LexA與之結合得不是十分牢固。

2.LexA:1583.SOS反應的誘導：

當DNA受到嚴重損傷后，由于細胞內(nèi)的切除修復和重組修復致使DNA單鏈部分在細胞中積累。RecA蛋白因與單鏈DNA結合而被活化，活化后的RecA蛋白再與LexA結合，引起LexA的自切，解除LexA對SOS基因的阻遏作用。3.SOS反應的誘導：1594.SOS基因：

在SOS反應中，SOS基因是按照一定的順序被誘導表達的。SOS基因的表達時間由LexA與基因的SOS框的親和力決定。按照在SOS反應中的表達時期，可以大致把SOS基因分為3組。首先被誘導的SOS基因是一些參與單鏈損傷修復的基因（比如，uvrA，uvrB，uvrD）或者與損傷耐受性有關的基因（比如，polB）。編碼LexA和DinI的基因也在這一時期被誘導表達。DinI的功能是延遲激活跨損傷的DNA合成。

4.SOS基因：160如果參與單鏈修復的基因不能幫助恢復正常的DNA合成速度，參與重組修復的基因便被誘導表達，它們包括recA和recN。如果出現(xiàn)大范圍的DNA損傷，依靠提高重組修復的能力仍不能克服損傷對DNA復制的抑制作用，以sfiA和umuDC為代表的第3組基因被激活。umuDC操縱子被激活后細胞會進行DNA跨損傷復制。SfiA的作用是抑制細胞的分裂。如果DNA的復制速度恢復到正常，這3類基因按照與激活相反的次序依次被關閉。相反，如果細胞仍不能修復DNA損傷，原噬菌體被誘導裂解細胞。如果參與單鏈修復的基因不能幫助恢復正常的DNA合成速度，參與161geneGeneproduct/functionn.ofcopy/cellBasallevelSOSinducedcellExpressedfirstlexALexA/SOSrepressor1,3001uvrAUvrABCexcinuclease/excisionrepair20250uvrBUvrABCexcinuclease/excisionrepair2501,000uvrDHelicaseII/excisionrepair,fidelityofrecombinationalrepair5,000–8,00025,000–65,000polBDNApolymeraseII/translesionDNAsynthesis40300ruvASubunitofRuvABhelicase/recombinationalrepair7005,600geneGeneproduct/functionn.of162ruvBSubunitofRuvABhelicase/recombinationalrepair2001,600dinIInhibitionofUmuDprocessing<5002,300ExpressedsecondrecARecAcoprotease,synaptase/SOSderepressor,recombinationalrepair1,000–10,000100,000recNRecN/recombinationalrepair??ruvBSubunitofRuvABhelicase/163ExpressedlastsfiASfiA(SulA)/celldivisioninhibitor??umuDSubunitofUmuD′C/translesionDNAsynthesis1802,400umuCSubunitofUmuD′C/translesionDNAsynthesis0200ExpressedlastsfiASfiA(SulA)/1645.SOS誘導突變

umuC和umuD（UV-inducedmutagenesis,umu），它們屬于同一個操縱子，轉錄方向是DC。如上所述，與其他SOS基因一樣，umuC和umuD基因在正常情況下被LexA阻遏。當DNA受損、復制受阻時，與單鏈DNA結合的RecA不但促進LexA自體切割，同樣也能促進UmuD的自體切割，只是RecA促進UmuD切割的效率相當?shù)?，這就保證了UmuD在SOS反應的晚期才會發(fā)生自體切割，形成UmuD’。兩分子UmuD’與一分子的UmuC組成的三聚體稱為DNA聚合酶V。5.SOS誘導突變umuC和umuD（UV-indu165在損傷位點，DNA聚合酶V取代停頓下來的DNA聚合酶III復制DNA的損傷區(qū)。這種DNA聚合酶的一個重要性質是，雖然它們是模板依賴性的，但是它們向新生鏈的3’末端添加核苷酸時并不依賴堿基配對原則，因此DNA聚合酶V又稱為差錯傾向聚合酶（error-pronepolymerase）。在損傷位點的另一側，DNA聚合酶III迅速取代DNA聚合酶V進行DNA合成。盡管這類DNA聚合酶在進行跨損傷DNA合成時不遵循堿基配對原則，但是插入的核苷酸仍不是隨機的。在損傷位點，DNA聚合酶V取代停頓下來的DNA聚合酶III復166DNA生物合成課件167

第三章DNA的生物合成第三章168

中心法則(TheCentralDogma)

遺傳信息從DNA到蛋白質的傳遞規(guī)律.DNA的遺傳信息轉錄為RNA，RNA通過翻譯指導合成蛋白質。DNA還通過復制將遺傳信息代代相傳。1970年發(fā)現(xiàn)RNA能逆轉錄為DNA，是對中心法則的補充。

逆轉錄 逆轉錄169

復制 DNA的生物合成 逆轉錄

復制（replication）：

以親代DNA為模板合成兩個相同子代DNA的過程。DNA雙螺旋結構堿基配對規(guī)律DNA雙螺旋結構170

第一節(jié)復制的特征第一節(jié)復制的特征171ParentalDNAPossiblemechanismsforreplicationParentalDNAPossiblemechanism172

半保留復制的實驗依據(jù)(M.Meselson&F.W.Stahl,1958)N14半保留復制的實驗依據(jù)N14173DNA生物合成課件174

一.半保留復制 (semiconservativereplication)復制時，親代的雙鏈DNA解開成兩條單鏈，分別作為模板，以dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)為原料,

按照堿基配對(A－T、G－C)規(guī)律與模板上的堿基配對,經(jīng)依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)催化,合成一條與模板互補的新鏈,新形成的兩個子代DNA分子與親代DNA堿基序列完全相同。每個子代DNA分子中一股單鏈是從親代完整地接受過來,另一股單鏈是新合成的,故稱為半保留復制。 一.半保留復制175

176DNA生物合成課件177

半保留復制的意義

按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。是物種穩(wěn)定的分子基礎，但是相對的，不是絕對的。半保留復制的意義 178

二.雙向復制1.復制起始點(origin,ori)：多數(shù)生物體內(nèi)DNA分子兩條鏈同時復制。復制是在DNA分子的特定位點開始，稱為復制起始點，常用ori(origin)表示。原核生物的DNA只有一個Ori位點，復制從起點開始，到終點結束，完成整個DNA分子的復制,即原核生物的DNA只有一個復制單位,為單復制子，稱為復制體。

復制子：能獨立完成復制的功能單位。oriori179真核生物染色體DNA有多個復制起始點。同時形成多個復制單位，從一個DNA復制起始點起始的DNA復制區(qū)域稱復制子(replicon)，每個復制子在一個細胞分裂周期中必須起動而且只能起動一次，真核生物染色體為多復制子。真核生物染色體DNA有多個復制起始點。同時形成多個復制單位180

2.復制叉(replicationfork)

復制時，雙鏈DNA由起始點處打開，沿兩條張開的單鏈模板合成DNA新鏈，兩側形成的Y型結構稱為復制叉(replicationfork)。

181

3.雙向復制(bidirectionalreplication)復制是從一個起始點開始，同時向兩個方向進行，稱為雙向復制。

182三.半不連續(xù)復制DNA雙螺旋結構的兩條鏈走向相反，復制時兩條鏈都能作為模板合成子代DNA。DNA的新鏈合成只能沿5’→3’方向進行。DNA解鏈并開始復制后，一條新鏈合成方向與復制叉移動方向相同，即以3’→5’走向的親代鏈為模板，因此該鏈可沿5’→3’方向連續(xù)合成，這條新鏈稱為領頭鏈。另一條鏈合成方向與復制叉移動方向相反，新鏈不能連續(xù)合成稱為隨從鏈。隨從鏈的復制必須待模板鏈解鏈至一定長度才能進行復制，隨復制叉延伸過程，可合成許多DNA片段(岡崎片段)，再經(jīng)連接酶催化形成連續(xù)的新鏈。這種領頭鏈連續(xù)復制，隨從鏈不連續(xù)復制的方式稱DNA復制的半不連續(xù)性。

三.半不連續(xù)復制DNA雙螺旋結構的兩條鏈走向相反，復制時兩183

領頭鏈(leadingstrand)

順著解鏈方向生成的子鏈，其復制是連續(xù)進行的，得到一條連續(xù)的子鏈。

184

隨從鏈(laggingstrand)

復制方向與解鏈方向相反，須等解開足夠長度的模板鏈才能繼續(xù)復制，得到的子鏈由不連續(xù)的片段所組成。岡崎片段(Okazakifragment)岡崎片段(Okazakifragment)185

岡崎片段： 1968年日本生化學者岡崎利用電鏡及放射自顯影技術，觀察到DNA復制中出現(xiàn)一些不連續(xù)的片段，因而將這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段。 原核生物的岡崎片段為一至二千個核苷酸，真核生物約為數(shù)百個核苷酸。

186DNA生物合成課件187

第二節(jié)DNA復制的酶學

188

DNA復制體系復制是在酶催化下的核苷酸聚合過程,需要多種物質的共同參與:

底物：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；

聚合酶(polymerase)：依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol或DDDP；

模板(template)：解開成單鏈的DNA母鏈；

引物(primer)：提供3′-OH末端的寡核苷酸；

其他的酶和蛋白質因子

189

一、DNA聚合酶催化dNTP聚合到核酸鏈上的酶。是DNA復制的主要酶。全稱叫依賴DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指導的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均縮寫為DDDP。一、DNA聚合酶190

(一)DNA聚合酶催化的反應

1.5′至3′的聚合活性

催化四種dNTP一個一個地接到DNA鏈上去。 (dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi

191

聚合反應機理：依賴于引物和模板催化核苷酸聚合有方向性：5′3′依賴于引物和模板192

聚合反應的特點： (1)以單鏈DNA為模板 (2)以dNTP為原料 (3)引物提供3′-OH (4)聚合方向為5′→3′(5)形成3′-5′磷酸二酯鍵

193

2.核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性：切除錯配的核苷酸即時校讀5′→3′外切酶活性：切除引物切除突變的片段？3′→5′外切酶活性：5′→3′外切酶活性：？194

(二)DNA聚合酶的種類

1.原核生物的DNA聚合酶pol-I（400:pol-II40:pol-III20）5′→3′聚合酶活性+++3′→5′外切酶活性+++5′→3′外切酶活性+–-功能切除引物填補空隙修復合成不清復制的主要酶活性最高pol-Ipol-IIpol-III5′→3′聚合酶活性+195

DNA-polI:單一肽鏈的大分子，二級結構以α-螺旋為主，含A－R18個α-螺旋。曾被稱為復制酶(replicase)含量最多功能:對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。proteaseDNA-polI:protease196

N-terminalC-terminalProtease小片段（323A.A）：具有5′→3′外切酶活性大片段（604A.A）：具有5’→3’聚合活性和3′→5′外切酶活性(Klenow片段)是實驗室常用的工具酶?？杀凰獬蓛蓚€片段

N-terminalC-terminalProtease小197

DNA-polIII:是E.coli的復制酶，在復制延長中真正起聚合新鏈作用的DNA聚合酶。由10種亞基組成的不對稱二聚體：?核心酶(α,ε,θ):3’→5’外切酶活性和5’→3’聚合酶活性?β亞基:slidingclampprotein?γ-復合物:識別帶引物的單鏈DNA，促進全酶組裝至模板上，穩(wěn)定酶結構，增強核心酶活性。催化效率最高DNA-polIII:198DNA生物合成課件199

2.真核生物的DNA聚合酶DNA-pol—引物酶活性，復制起始引發(fā)DNA-pol—沒有其他DNA-pol時才起作用DNA-pol—催化線粒體DNA的復制DNA-pol—復制中延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol—與原核生物的DNA-polI相似，在復制中起校讀、修復和填補缺口作用。

200

(三)復制的保真性(fidelity)

至少依賴三種機制：

1.遵守嚴格的堿基配對規(guī)律； 2.聚合酶在復制延長中對堿基的選擇功能； 3.復制中的即時校讀功能。

201DNA生物合成課件202

二、解旋解鏈酶類 解開并理順DNA雙鏈，維持DNA處于單鏈狀態(tài)。主要有解螺旋酶、

DNA拓撲異構酶和單鏈DNA結合蛋白。

203

(一)解螺旋酶(helicase)

:

模板對復制的指導作用在于堿基的準確配對，而堿基卻埋在雙螺旋的內(nèi)部。只有把DNA解開成單鏈，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早發(fā)現(xiàn)的與復制有關的蛋白質，當時稱為rep蛋白。作用是利用ATP供能，解開DNA雙鏈。

204

復制相關蛋白的基因：dnaA、dnaB、dnaC……dnaX 相應的表達產(chǎn)物蛋白質：DnaA、DnaB、DnaC……DnaX DnaA：辨認復制起始位點

DnaB：解螺旋酶 DnaC：輔助解螺旋酶使其在起始點上 結合并打開雙鏈。

205

(二)單鏈DNA結合蛋白(SSB)

:

大腸桿菌SSB是由177個氨基酸殘基組成的同源四聚體，結合單鏈DNA的跨度約32個核苷酸單位。 SSB與解開的DNA單鏈緊密結合，防止重新形成雙鏈，并免受核酸酶降解。在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整。

206DNA生物合成課件207

(三)DNA拓撲異構酶(topoisomerase)

拓撲：是指物體或圖像作彈性移位而又保持物體原有的性質。

拓撲異構酶：是一類可改變DNA拓撲構象的酶。對DNA分子的作用是既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解鏈。

208

209

拓撲異構酶I（topoI）:

在原核生物曾被稱為－蛋白。主要作用是切開DNA雙鏈中的一股，使DNA解鏈旋轉中不打結，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)再封閉切口。催化反應不需要ATP。

210DNA生物合成課件211

拓撲異構酶II（

topoII）:

在原核生物又叫旋轉酶(gyrase)。能切斷DNA雙鏈，使螺旋松弛。在ATP參與下，松弛的DNA進入負超螺旋，再連接斷端。

212

213

三、引物酶和引發(fā)體引物酶(primase):依賴DNA的RNA聚合酶。

催化RNA引物的合成。

在大腸桿菌，引物酶是dnaG基因的產(chǎn)物。RNA引物：

在DNA模板的復制起始部位由引物酶催化NTP的聚合，形成短片段的RNA，為DNA聚合提供3′-OH末端。

214

引發(fā)體(primosome):

是由DnaB、DnaC等蛋白因子一起形成復合體，再結合引物酶(DnaG)形成較大的聚合體，結合到模板DNA上。

復制開始時，在引發(fā)體的下游解開雙鏈，再由引物酶催化引物的合成。DNA生物合成課件215

四、DNA連接酶（DNAligase）連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，形成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。反應需要ATP/NAD+。只能連接堿基互補基礎上雙鏈中的單鏈缺口，不能連接單獨存在的DNA或RNA單鏈。若DN