HXY-第四章-目的基因的獲取

HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!第四章目的基因的獲取目的基因：準備要分離、改造、擴增或表達的基因。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!

基因克隆的本質是把某一目的DNA片段通過無性方式進行擴增和表達，而這一過程往往是通過載體和寄主細胞來實現(xiàn)的。

一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目標DNA片段的獲得；2、克隆載體的構建；3、寄主細胞的轉化；4、重組體克隆的選擇和鑒定。

目前，以大腸桿菌為寄主，以質粒和噬菌體等為載體的基因克隆體系已經(jīng)相當?shù)某墒?。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!節(jié)

基因組DNA片斷化一、限制性內(nèi)切酶法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!二、隨機片斷化1.限制性內(nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。①內(nèi)切酶識別位點的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長度和隨機程度。（1）限制性內(nèi)切酶的選用原則HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!2.機械切割法（1）超聲波超聲波強烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機片斷。（2）高速攪拌1500轉/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機片斷。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!①

保護dNTP的5’端P或3’端-OH③

用酸或堿脫保護（1）原理1.磷酸二酯法②

帶保護的單核苷酸連接保證合成反應的定向進行。帶5’保護的單核苷酸與帶3’保護的另一個單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!

將個核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。

固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。15合成的二核苷酸連接處有三個酯鍵！HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!化學合成的DNA片斷一般在200bp以內(nèi)。二、

化學合成DNA片斷的組裝用T4多核苷酸激酶使各個片段的5’端帶上磷酸。1.互補連接法預先設計合成的片斷之間都有互補區(qū)域，不同片斷之間的互補區(qū)域能形成有斷點的完整雙鏈。（2）5’端磷酸化（1）互補配對（合成的DNA單鏈的5’端是-OH）HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!2.互補延伸連接法預先設計的片斷之間有局部互補區(qū)，可以相互作為另一個片斷延長的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。3’

5’

5’

3’

5’

3’

T4DNA連接酶Klenow片段引物HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!DNA合成儀5.合成人工接頭或銜接物含有各種酶切位點人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptorHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!（2）目前常用的載體

2.構建基因文庫的載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對載體的要求載體系列：

容量為

24kpcosmid載體：

容量為

50kbYAC：

容量為

1MbBAC:容量為

300kbHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!（2）載體與基因組DNA大片段的連接①

粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。②人工接頭法（adaptor）人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!例如：人的基因組是

3×109bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細菌中直接表達。（3）包含了所有編碼蛋白質的基因。（4）比DNA文庫小的多，容易構建。4.構建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提取3.cDNA文庫的特點提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉錄酶引物mRNAcDNA鏈3’

3’

5’

5’

引物cDNA鏈3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH堿HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。方法二：妙用RNaseH小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。DNAPolI除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!三、文庫的查詢（screening）用目的基因探針與文庫中的重組載體進行Southernblot雜交。文庫載體探針電泳后雜交放射自顯影測序分析HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNATotalmRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過柱與探針堿基互補的mRNA結合到柱上，其它mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCRHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!從表達A蛋白和不表達A蛋白的組織細胞中分別提取和分離總mRNA。將表達A蛋白的mRNA合成cDNA鏈。再同不表達A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交的cDNA就包括特異表達的A基因的cDNA單鏈。用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進行擴增、克隆、測序。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!3.mRNA差異顯示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端的錨定引物Oligo(dT)引物的3’端加兩個核苷酸（倒數(shù)第二個不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’

3’

HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!（3）5’端的隨即引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTT5’

3’

擴增cDNA鏈。RTNMTTTTTTTT5’

cDNA3’

NNNNNNNNNN5’

3’

NNNNNNNNNN5’

3’

cDNA第二鏈，并PCRHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!（5）隨機-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較不同組織的240組引物組合PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。選擇有差異的帶，進一步PCR作探針。篩選文庫，找到差別基因的全長序列。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!原核基因組部分原核細胞提取基因組DNAPCR擴增HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!目的基因的引物1反轉錄成目的基因cDNA鏈目的基因的引物2目的

基因cDNA第二鏈PCRmRNAHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!大腸桿菌作為寄主進行DNA克隆的實驗方案DNA片段的獲得載體構建細菌轉化重組體的鑒定限制性內(nèi)切酶消化機械切割雙鏈cDNA的合成化學法直接合成同聚物加尾粘性末端連接平末端連接加接頭造成粘性末端重組噬菌體DNA轉染重組質粒的轉化體外包裝進行轉導表型鑒定核酸雜交免疫學分析酶切鑒定HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。1.優(yōu)點2.缺點目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgeneHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!1）4bp的內(nèi)切酶平均每46（4096）bp一個切點。2）6bp的內(nèi)切酶平均每44（256）bp一個切點。隨機程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點相連。（Sau3A—BamHI）HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!1976年H.G.Khorana提出了用化學方法合成基因的設想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。第二節(jié)

化學合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動化合成法。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應的單核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先連接了一個保護基團。2.磷酸三酯法HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!固相磷酸三酯合成過程固相支持物結果是全保護的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之間對氯苯。最后脫保護固相支持物固相支持物CHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!T4DNA連接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA雙鏈（3）連接酶連成完整雙鏈HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!1.直接合成基因三、

寡聚核苷酸化學合成的優(yōu)點2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很難作cDNA

3.合成探針序列4.定點突變合成合成帶有定點突變的基因片斷。（2）有些基因比較短，化學合成費用較低HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!

將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應的宿主細胞中保存和擴增。

理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。一、基因文庫的構建1.基因文庫（genelibrary）第三節(jié)

目的基因的保存和擴增HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!斷點完全隨機，片斷長度合適于載體連接。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。（1）染色體DNA大片段的制備3.基因文庫構建的一般步驟超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）。

①

物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機片斷。②

酶切法：HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!各種酶的接頭可以向公司定做或購買。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉移酶粘性末端③同聚物加尾HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!4.基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因組DNA的百分數(shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!1.cDNA以mRNA為模板逆轉錄出的DNA稱cDNA。2.cDNAlibrary二、

cDNA文庫的構建mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。

利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化Column（柱）HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!反轉錄酶（3）cDNA的合成①cDNA鏈合成逆轉錄酶能以RNA為模板合成DNA。用OligodT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的鏈。

mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!方法一：剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結構（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。cDNA鏈5’

cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA鏈cDNA第二鏈5’

3’

③cDNA第二鏈合成HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!mRNAcDNA3’

5’

反轉錄酶引物mRNAcDNA鏈3’

5’

引物mRNAcDNA鏈3’

5’

mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA鏈3’

5’

RNaseHDNAligase去引物HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!④去掉發(fā)卡結構核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結構（但這會導致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA鏈cDNA第二鏈5’

3’

cDNA鏈cDNA第二鏈5’

3’

5’

3’

HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉入受體菌?；蚪柚┒宿D移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。5.cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉移酶HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!6.cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1nHXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁!第四節(jié)

目的基因的分離和擴增一、目的基因的分離1.探針柱分離特異mRNA根據(jù)已知的基因序列合成探針，結合到纖維素柱上，用來分離純化該基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁!2.mRNA消解雜交原理：羥基磷灰石柱結合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結合單鏈DNA。（Hydroxylapatitecolumn）HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁!AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA鏈A雜交內(nèi)含蛋白A的cDNA羥磷灰石柱過柱吸收RNA-DNA單鏈濾過羥磷灰石柱BAPCR16cDNA文庫HXY-第四章-目的基因的獲取共58頁，您