分子生物學(xué) 第五講 細(xì)胞周期調(diào)控課件

第五講細(xì)胞周期調(diào)控

一、細(xì)胞周期的基本概念

細(xì)胞周期（cellcycle)是指細(xì)胞從第一次分裂結(jié)束產(chǎn)生新細(xì)胞到第二次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）分裂期又稱M期，是細(xì)胞分裂期細(xì)胞周期示意圖當(dāng)細(xì)胞中DNA損傷時，激活凋亡基因，使進(jìn)入增殖周期的細(xì)胞停留在G1→S期，容許細(xì)胞修復(fù)DNA避免突變。如果損傷嚴(yán)重時，細(xì)胞則走向凋亡。

流式細(xì)胞術(shù)可以檢測細(xì)胞周期周期中的主要事件：G1期：合成蛋白、糖類、脂類等，但不合成DNA，是細(xì)胞的最初生長期。決定G1期向S期轉(zhuǎn)換的特定時期稱起始點(diǎn)（或限制點(diǎn)，或檢驗(yàn)點(diǎn)），受內(nèi)外多種因素的控制。S期：DNA合成，在真核生物立即與組蛋白結(jié)合，形成核小體。G2期：合成大量蛋白質(zhì)，能否進(jìn)入M期，受G2期檢驗(yàn)點(diǎn)的控制。M期：細(xì)胞分裂ExperimentaldemonstrationofthecoordinatedSynthesisofDNAandhitones.二、細(xì)胞周期研究的歷史進(jìn)程1841年，柏林大學(xué)的波蘭神經(jīng)內(nèi)科學(xué)家和生物學(xué)家羅伯特·里麥克（RobertRemak，1815-1865）就報(bào)道了細(xì)胞分裂現(xiàn)象，并得出結(jié)論，細(xì)胞分裂是細(xì)胞增殖的方式，也是機(jī)體生長發(fā)育的“根本動力”，當(dāng)時認(rèn)為細(xì)胞的增殖活動主要發(fā)生在形態(tài)變化明顯的有絲分裂期。1953年，Howard和Pelc發(fā)現(xiàn)蠶豆根尖細(xì)胞分裂中遺傳物質(zhì)DNA的復(fù)制發(fā)生于靜止期中的一個時期，這一時期與有絲分裂期在時間上存在前后兩個間隙。由此，他們第一次明確的提出了細(xì)胞周期的概念，并將細(xì)胞周期劃分為上述的4個時期，其中的S期即是DNA合成的時期。

Johnson和

Rao(1970)將Hela細(xì)胞同步于不同階段，然后與M期細(xì)胞混合，在滅活仙臺病毒介導(dǎo)下，誘導(dǎo)細(xì)胞融合，發(fā)現(xiàn)與M期細(xì)胞融合的間期細(xì)胞產(chǎn)生了形態(tài)各異的早熟凝集染色體(prematurelycondensedchromosome，PCC)。

G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制；S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始復(fù)制；G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復(fù)制已完成。

不僅同類M期細(xì)胞可以誘導(dǎo)PCC，不同類的M期細(xì)胞也可以誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，如人和蟾蜍的細(xì)胞融合時同樣有這種效果，這就意味著M期細(xì)胞具有某種促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子。

人們猜測，在M期的細(xì)胞中存在著某種物質(zhì)，它能夠促進(jìn)染色體的凝聚和細(xì)胞的分裂。后來，人們在不同類型的M期細(xì)胞中分別提取出了能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂的的因子，統(tǒng)稱為成熟促進(jìn)因子(maturationpromotingfactor，MPF)。

當(dāng)時還不清楚MPF具體的組成和性質(zhì)，但為人們尋找細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制提供了新的方向。

1960sLeland

Hartwell芽殖酵母1970sPaulNurse裂殖酵母利用溫度敏感突變株，發(fā)現(xiàn)許多與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(celldivisioncyclegene,CDC)。例：—芽殖酵母cdc28、裂殖酵母cdc2突變型在限制溫度下無法分裂—wee1突變型則提早分裂，cdc25突變型細(xì)胞體積增大而不分裂—cdc28和cdc2都編碼一個34KD的蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行其產(chǎn)物分別為p34cdc28(G2/S或G2/M)和p34cdc2（G2/M）weel和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進(jìn)CDC2的活性。P34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系Hartwell還通過研究酵母菌細(xì)胞對放射線的感受性，提出了checkpoint（細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)）的概念，意指當(dāng)DNA受到損傷時，細(xì)胞周期會停下來。buddingyeast（芽殖酵母）Fissionyeast

（裂殖酵母）1983年，TimHunt首次發(fā)現(xiàn)海膽卵受精后，在其卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期劇烈振蕩，在每一輪間期開始合成，G2/M時達(dá)到高峰，M結(jié)束后突然消失，下輪間期又重新合成，故命名為周期蛋白(cyclin)。1987年，Paul

Nurse又在人的細(xì)胞中分離出cdc2同源的cdk11988年，M.

J.

Lohka

純化了爪蟾的MPF，經(jīng)鑒定由32KD和45KD兩種蛋白組成，二者結(jié)合可使多種蛋白質(zhì)磷酸化。1990年，Paul

Nurse進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明P32實(shí)際上是cdc2的同源物，而P45是cyclinB的同源物，從而將細(xì)胞周期三個領(lǐng)域的研究聯(lián)系在一起。實(shí)際上，cdc2跟調(diào)節(jié)它的cyclin組成的復(fù)合物就是成熟促進(jìn)因子MPF。1988年M.J.Lohka純化了爪蟾的MPF，經(jīng)鑒定由32KD和45KD兩種蛋白組成，二者結(jié)合可使多種蛋白質(zhì)磷酸化。MPF、Cdc和Cyclin的關(guān)系MPFregulationDemonstrationofregulationofMPFNurse在1990年提出：從酵母到無脊椎動物一直到人類，其所有真核細(xì)胞中存在一個共同的M期啟動調(diào)節(jié)機(jī)制——“M期啟動調(diào)節(jié)的普遍機(jī)制”。Hartwell作為微生物學(xué)家，最先找到了用于研究真核細(xì)胞周期的合適模型——酵母細(xì)胞，同時他率先發(fā)現(xiàn)了cdc基因，為其后20年間細(xì)胞周期研究指明了方向——雖然他的這一工作的意義在10年后才真正顯得尤為重要——并通過大量的研究為細(xì)胞周期理論的大廈奠定了基礎(chǔ)。而TimHunt和PaulNurse在完全不同的方向上進(jìn)行的工作揭示了細(xì)胞周期中的關(guān)鍵分子及其作用，最終這些工作與Hartwell的研究相整和，使人們得到了有關(guān)細(xì)胞分裂的主要概念框架。1998年拉斯克醫(yī)學(xué)獎授予LeeHartwell，YoshioMasui和PaulNurse，表彰在細(xì)胞分裂調(diào)控機(jī)制研究中的開創(chuàng)性工作。諾貝爾頒獎時對三人貢獻(xiàn)的描述利蘭·哈特韋爾的貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)了大量控制細(xì)胞周期的基因，其中一種被稱為“START”的基因?qū)刂聘鱾€細(xì)胞周期的最初階段具有決定性的作用。保羅·納斯的貢獻(xiàn)是，在哈特韋爾的基礎(chǔ)上，通過基因與分子法發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的一種關(guān)鍵物質(zhì)CDK（細(xì)胞周期蛋白依賴激酶），CDK是通過對其他蛋白質(zhì)的化學(xué)作用來驅(qū)動細(xì)胞周期的。蒂莫西·亨特的貢獻(xiàn)是首次發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)CDK功能的物質(zhì)CYCLIN（細(xì)胞周期蛋白）。

哈特韋爾、納斯和亨特三人的發(fā)現(xiàn)對研究細(xì)胞的發(fā)育有重大的影響，特別是對開辟治療癌癥新途徑將具有極其深遠(yuǎn)的意義。細(xì)胞周期的內(nèi)源性調(diào)控主要是通過“Cyclins-CDKs-CKIs”這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)三、細(xì)胞周期的主要調(diào)控因子細(xì)胞周期內(nèi)源性調(diào)控Cyclins–CDKs-CKIs正性調(diào)控核心負(fù)性調(diào)控CDKs（cyclin-dependentkinase，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶）是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心Cyclins（細(xì)胞周期蛋白）對CDKs具有正性調(diào)控作用CKIs（CDKinhibitor，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子）具有負(fù)性調(diào)控作用。CDK激酶與可能結(jié)合的周期蛋白

CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化絲氨酸和蘇氨酸），參與細(xì)胞的多種功能。Cyclins不僅起激活CDK的作用，還決定了CDK何時、何處、將何種底物磷酸化。目前從芽殖酵母、裂殖酵母和各類動物中分離出的周期蛋白有30余種，在脊椎動物中為A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分為G1型、G1/S型S型和M型4類（見表13-1）。各類周期蛋白均含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合。周期蛋白分子結(jié)構(gòu)特征不同類型的CDK/cyclin復(fù)合體*包括D1-3，各亞型cyclinD在不同細(xì)胞中的表達(dá)量不同，但具有相同的功效。M期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱破壞框(destructionbox)，其降解依賴于泛素途徑。泛素由76個氨基酸組成，高度保守。共價結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識別和降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。26S蛋白酶體是一個大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。DestructionBoxinCyclins不同周期蛋白的表達(dá)時期不同，與不同的CDK結(jié)合，調(diào)節(jié)不同CDK激酶的活性。

部分哺乳動物和酵母細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期中的積累及其與CDK激酶活性的關(guān)系。細(xì)胞周期調(diào)控示意圖CKI是CDK抑制劑，可阻止細(xì)胞通過檢驗(yàn)點(diǎn)，其作用方式是直接與CDK或cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，已發(fā)現(xiàn)的CKI有p16家族和p21家族P16,P15,P18,P19特異性抑制cdk4·cyclinD1,cdk6·cyclinD1復(fù)合物P21,P27,P57

抑制大多數(shù)CDK的激酶活性，P21cip1還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA（proliferating

cell

nuclear

antigen）結(jié)合，直接抑制DNA的合成

P21cip1抑制CDK和PCNA1、G1期CyclinD表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，然后釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)其他Cyclin和CDK的轉(zhuǎn)錄；四、CDK-cyclin的變化情況與細(xì)胞周期進(jìn)程2、在G1/S期，cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。3、進(jìn)入S期后，CyclinE降解，CDK2轉(zhuǎn)而與CyclinA結(jié)合，推進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入G2期。4、在G2-M期

cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細(xì)胞周期事件。

5、在M期，當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時，激活后期蛋白復(fù)合體-APC，將遍在蛋白連接在cyclinB上，導(dǎo)致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個細(xì)胞周期M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累。結(jié)合cyclinB的CDK1被Wee1將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不斷積累。在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDKactivatingkinaseCAK)的作用下完成的。

M期CDK的激活細(xì)胞中CDK激酶的活性受到多種因素的調(diào)控CDK1的激活需要Thr14和Tyr15的去磷酸化Tyr161的磷酸化Weel1可以促進(jìn)Thr14和Tyr15的磷酸化Cdc25可以促進(jìn)Thr14和Tyr15的去磷酸化

DNA的復(fù)制是由起始復(fù)制點(diǎn)（originsofreplication）開始的，起始復(fù)制點(diǎn)是一種自主復(fù)制序列，散布在染色體上。在整個細(xì)胞周期中，起始復(fù)制點(diǎn)上結(jié)合有復(fù)制起始點(diǎn)識別復(fù)合體（Originrecognitioncomplex,Orc），其作用就象一個停泊點(diǎn)，供其它調(diào)節(jié)因子?？俊dc6是其中的一個調(diào)節(jié)因子，在G1期Cdc6含量瞬間提高，Cdc6結(jié)合在Orc上，在ATP供能下，促進(jìn)6個亞單位構(gòu)成的MCM復(fù)合體和其他一些蛋白結(jié)合到ORC上，形成前復(fù)制復(fù)合體（pre-replicativecomplex，pre-RC）DNA復(fù)制執(zhí)照因子學(xué)說；MCM實(shí)際上就是DNA解旋酶。DNA復(fù)制的控制五、細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)checkpoint細(xì)胞要分裂，必須正確復(fù)制DNA和達(dá)到一定的體積，在獲得足夠物質(zhì)支持分裂以前，細(xì)胞不可能進(jìn)行分裂。細(xì)胞周期的運(yùn)行，是在一系列稱為檢驗(yàn)點(diǎn)（checkpoint）的嚴(yán)格檢控下進(jìn)行的，當(dāng)DNA發(fā)生損傷，復(fù)制不完全或紡錘體形成不正常，周期將被阻斷。細(xì)胞周期的限制點(diǎn)有四個：

G1檢驗(yàn)點(diǎn):在酵母中稱start點(diǎn)，在哺乳動物中稱R點(diǎn)(restrictionpoint)，控制細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)的G1進(jìn)入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？

S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？

G2檢驗(yàn)點(diǎn)：是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？

M期檢驗(yàn)點(diǎn)（紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)）：任何一個著絲點(diǎn)沒有正確連接到紡錘體上，都會抑制APC的活性，引起細(xì)胞周期中斷。Fourcheckpoints一、G1期檢測點(diǎn)

G1期檢測點(diǎn)是最重要的檢測點(diǎn)。細(xì)胞在該檢測點(diǎn)對各類生長因子、分裂原以及DNA損傷等復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)外信號進(jìn)行整合和傳遞,決定細(xì)胞是否進(jìn)行分裂、發(fā)生凋亡或是進(jìn)入G0期。

G1期檢測點(diǎn)中最重要的控制點(diǎn)是G1晚期的START(在動物細(xì)胞中稱為Restrictionpoint)，START調(diào)節(jié)失靈，將導(dǎo)致細(xì)胞越過正常的程序限制進(jìn)入s期，并允許細(xì)胞復(fù)制未修復(fù)的突變DNA，從而積累形成腫瘤表型的基因改變。

pRB與R檢測點(diǎn)的控制

二、S期檢測點(diǎn)控制DNA復(fù)制？三、G2期檢測點(diǎn)

控制進(jìn)入M期的檢測點(diǎn)(G2期檢測點(diǎn))可防止受損的DNA和未完成復(fù)制的DNA進(jìn)入有絲分裂。p53是DNA損傷誘導(dǎo)G2期阻滯的關(guān)鍵機(jī)制,因此p53缺失導(dǎo)致的G2期檢測點(diǎn)缺陷與許多腫瘤的發(fā)生有關(guān)。

四、M期檢測點(diǎn)

M期檢測點(diǎn)又叫紡錘體組裝檢測點(diǎn)。主要是阻止細(xì)胞分裂、阻止細(xì)胞兩極形成紡錘體、阻止染色體附著到紡錘體上。ATM(ataxiatelangiectasia-mutated)andATR(ATM-andRad3-related)kinases

最早發(fā)現(xiàn)于毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥患者，人類中大約有1%的人是ATM缺失的雜合子，表現(xiàn)出對電離輻射敏感和易患癌癥。ATM編碼一個蛋白激酶，結(jié)合在損傷的DNA上，其信號通路有兩條。①激活Chk1（checkpointkinase）,使CDC25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中斷細(xì)胞周期。②激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作為轉(zhuǎn)錄因子