流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件

什么是流式細胞儀●流式細胞儀實物BDFACSVantageBD-Calibur什么是流式細胞儀●流式細胞儀實物BDFACSVantage1.發(fā)展歷史1934Moldavan1973Steinkamp一、

概述一、

概述2.定義：對在高速流動的鞘液包括下對特異熒光標記的細胞、粒子進行分析和分選的技術.3.特點測量速度快，每秒鐘能測數(shù)千個乃至上萬個細胞可進行多參數(shù)測量在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術。2.定義：對在高速流動的鞘液包括下對特異熒光標記的細胞、粒凡是能被熒光素標記的細胞或顆粒都可用流式細胞儀檢測。前提這種熒光素能被流式細胞儀所配置的激光光源激發(fā)在生物檢測技術中流式細胞儀是不可多得的一機多用的儀器。4.應用范圍4.應用范圍二、流式細胞儀的工作原理和基本結構待測細胞以單個細胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動室。流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細胞液柱。液柱與激光束相交，細胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析。二、流式細胞儀的工作原理和基本結構待測細胞以單個細胞的懸液，流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件基本結構流動室和液流系統(tǒng)；激光源和光學系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機和分析系統(tǒng)。

基本結構流動室和液流系統(tǒng)；流式細胞術檢測細胞表型DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。細胞壞死時，細胞腫脹，F(xiàn)SC？，SSC？二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡1973Steinkamp對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡在生物檢測技術中流式細胞儀是不可多得的一機多用的儀器。FCM分析白血病免疫表型,快速、特異、準確，重復性好，能區(qū)分細胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預后判斷、發(fā)病機理研究等有重要價值。圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為陽性細胞DipS:17.熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖細胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學特征圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，端粒（熒光蛋白）熒光信號大小凋亡細胞的FSC？SSC？三、

流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)

非熒光信號顆粒度細胞大小前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積

側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性流式細胞術檢測細胞表型三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)

非血液涂片血液涂片外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。根據(jù)凋亡細胞的特點來檢測腫瘤組織中的各種DNA倍體在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側顯新月體形、核碎裂；定義：對在高速流動的鞘液包括下對特異熒光標記的細胞、粒子進行分析和分選的技術.流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。各探測通道接收并轉化為電信號。圖報告中常見的幾種流式細胞圖5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，細胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結合于細胞DNA，熒光強度與PI的結合量呈良好的線性關系，根據(jù)這個原理，可測出細胞的DNA含量。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡多熒光標記胞內(nèi)多種組分，實現(xiàn)多參數(shù)測量在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側顯新月體形、核碎裂；圖FCM測試細胞周Mean：平均熒光強度，與被檢測物質(zhì)的表達量有關，在正態(tài)分布時一般用該值。側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性激素結合位點、細胞受體四）白血病的免疫分型圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死熒光信號熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標記的細胞與無熒光標記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細胞與低FL細胞區(qū)分開來（強弱）一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等熒光信號與細胞特性

熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。

定量染色熒光信號大小被標記組分含量的定量多熒光標記胞內(nèi)多種組分，實現(xiàn)多參數(shù)測量熒光信號與細胞特性熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。二色鏡

123帶通濾波片光電倍增管激光束細胞收集透鏡前向散射光側向散射光，熒光光信號分離，導向各探測通道接收并轉化為電信號。光信號收集二色鏡帶通濾波片激光束細胞收集透鏡前向散射光側向散射光，熒光三數(shù)據(jù)處理及流式報告FSCSSCFL1FL2FL3對數(shù)

線性線性

線性

對數(shù)脈沖處理，模數(shù)轉換光信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結果（面積，峰高，寬度）三數(shù)據(jù)處理及流式報告FSCSSCF流式報告的圖一般分為四種，即散點圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點圖和直方圖。幾個概念：%Gated：陽性細胞百分比。反映細胞群體中陽性細胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強度，與被檢測物質(zhì)的表達量有關，在正態(tài)分布時一般用該值。GeoMean：幾何平均熒光強度，在陽性細胞為偏態(tài)分布時一般用該值。流式報告的圖一般分為四種，即散點圖、直方圖、密度圖和二維等高散點圖

密度圖二維等高圖直方圖圖報告中常見的幾種流式細胞圖散點圖密度圖二維等高圖直方圖圖報告中常見的幾種流圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死流式細胞儀數(shù)據(jù)分析點圖分析流式細胞儀數(shù)據(jù)分析點圖分析流式細胞儀數(shù)據(jù)分析直方圖分析流式細胞儀數(shù)據(jù)分析直方圖分析圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為陽性細胞圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為

五、

流式細胞術的應用

細胞結構細胞大小細胞顆粒度細胞表面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……

細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)/外的細胞因子激素結合位點、細胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細胞膜電位、線粒體膜電位

……五、流式細胞術的應用

細胞結構細胞功能五）細胞內(nèi)蛋白的分析：圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死FALSSensor利用流式細胞儀進行細胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細胞學診斷。三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)FCM分析白血病免疫表型,快速、特異、準確，重復性好，能區(qū)分細胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預后判斷、發(fā)病機理研究等有重要價值。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡凋亡細胞的FSC？SSC？側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性腫瘤組織中的各種DNA倍體細胞壞死時，細胞腫脹，F(xiàn)SC？，SSC？一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側顯新月體形、核碎裂；三數(shù)據(jù)處理及流式報告藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死多熒光標記胞內(nèi)多種組分，實現(xiàn)多參數(shù)測量細胞膜電位、線粒體膜電位1934Moldavan如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術。一）細胞DNA含量檢測細胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結合于細胞DNA，熒光強度與PI的結合量呈良好的線性關系，根據(jù)這個原理，可測出細胞的DNA含量。用于細胞周期、細胞倍體以及凋亡的檢測。

五）細胞內(nèi)蛋白的分析：一）細胞DNA含量檢測細胞固定后用流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件單參數(shù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細胞，4N代表G2/M期細胞，兩者中間代表S期細胞。這是以2倍體和4倍體細胞為主的流式DNA圖單參數(shù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細胞，4N代表G2/M期24DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4N

DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s200400流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體含量與凋亡關系DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。凋亡過程中，細胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標本制備中的固定處理時，細胞膜的完整性被破壞，使細胞內(nèi)降解的DNA片段從細胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。含量與凋亡關系DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究

二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究1.腫瘤診斷DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標志細胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學特征利用流式細胞儀進行細胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細胞學診斷。1.腫瘤診斷DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標志2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體intotesttubes藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。intotesttubes三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。五、流式細胞術的應用DipG2-M:9.在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術。59%at96.側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性五）細胞內(nèi)蛋白的分析：三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡1934MoldavanDNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細胞內(nèi)鈣離子的濃度。123FCM檢測胞內(nèi)鈣離子、對數(shù)線性線性線性對數(shù)CellSorting流式細胞術白血病免疫分型是利用熒光素標記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的免疫表型，了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。intotesttubes2.凋亡研究在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，即凋亡峰。檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。2.凋亡研究在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，即凋亡峰。流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件AnnexinVAssay

AnnexinVAssay

圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48

圖FCM測試細胞周期分布和凋亡Dateacquired:14-Jan-03圖FC根據(jù)凋亡細胞的特點來檢測在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側顯新月體形、核碎裂；細胞漿和細胞器密度增高、細胞體積變小；細胞膜皺折卷曲，但早期細胞膜的完整性未受到破壞凋亡細胞的FSC？SSC？細胞壞死時，細胞腫脹，F(xiàn)SC？，SSC？根據(jù)凋亡細胞的特點來檢測在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究59%at96.流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡AnnexinVAssayDateacquired:14-Jan-03ChargedPlates檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。細胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細胞液柱。圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡Apoptosis:13.對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。定義：對在高速流動的鞘液包括下對特異熒光標記的細胞、粒子進行分析和分選的技術.ChargedPlates熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術。側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細胞內(nèi)鈣離子的濃度。CD3(T細胞，CD4、CD8))、CD19（B細胞）、CD16、CD56（NK細胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細胞增殖病、腫瘤療效觀察與預后判斷、移植免疫檢測等。

三）淋巴細胞分類二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究三）淋巴細胞分類流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件流式細胞術檢測細胞表型

流式細胞術檢測細胞表型

流式細胞術白血病免疫分型是利用熒光素標記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的免疫表型，了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型,快速、特異、準確，重復性好，能區(qū)分細胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預后判斷、發(fā)病機理研究等有重要價值。

四）白血病的免疫分型

四）白血病的免疫分型

五）細胞內(nèi)蛋白的分析：

細胞破膜后將細胞內(nèi)某一蛋白成分進行熒光標記，用流式細胞儀進行測量分析，同表型分析一樣，可以測量出這種陽性細胞的數(shù)量和這種蛋白的相對含量。熒光探針多為FITC。五）細胞內(nèi)蛋白的分析：細胞破膜后將細胞熒光信號使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光信號使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光樣本制備雙色直接染色熒光樣本制備雙色直接染色

端粒（熒光蛋白）端粒（熒光蛋白）

六）細胞內(nèi)鈣離子測定1×106/ml的細胞懸液，加入終濃度為1-5μmol/mlFluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hank’s平衡鹽溶液洗三次，重懸于0.5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細胞內(nèi)鈣離子的濃度。

50FCM檢測胞內(nèi)鈣離子、膜電位和線粒體功能FCM檢測胞內(nèi)鈣離子、M1陰性界限劃分完全是根據(jù)陰性對照！如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。M1陰性界限劃分完全是根據(jù)陰性對照！如下圖：紅色部分代表陰性12%at48.Apoptosis:13.檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積熒光探針多為FITC。如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。123一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡期分布和凋亡Fluorescencedetector圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，intotesttubes流式細胞術白血病免疫分型是利用熒光素標記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的免疫表型，了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。三數(shù)據(jù)處理及流式報告如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。

六.分選：用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，大型機分選速度可達到每秒上萬個細胞12%at48.六.分選：用熒光探針標記的細胞488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector488nmlaser+-FluorescenceAct對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡流式細胞儀顯微鏡流動的細胞靜止的細胞樣本數(shù)量大數(shù)量少高速分選樣本難以再利用細胞群體特征量分布揭示細胞內(nèi)部結構信息對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡流式細胞儀顯微鏡流流式細胞儀蛋白電泳多參數(shù)單參數(shù)量化的分布平均值容易檢測各個參數(shù)間的相關性不容易流式細胞儀蛋白電泳多參數(shù)單參數(shù)量化的分布平均值容易檢測各個參謝謝大家謝三、

流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)

非熒光信號顆粒度細胞大小前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積

側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)

非熒光信號顆粒度細胞大小三數(shù)據(jù)處理及流式報告FSCSSCFL1FL2FL3對數(shù)

線性線性

線性

對數(shù)脈沖處理，模數(shù)轉換光信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結果（面積，峰高，寬度）三數(shù)據(jù)處理及流式報告FSCSSCF圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為陽性細胞圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為

六）細胞內(nèi)鈣離子測定1×106/ml的細胞懸液，加入終濃度為1-5μmol/mlFluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hank’s平衡鹽溶液洗三次，重懸于0.5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細胞內(nèi)鈣離子的濃度。

61前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞漿和細胞器密度增高、細胞體積變??；以HEPES緩沖的Hank’s平衡鹽溶液洗三次，重懸于0.藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死多熒光標記胞內(nèi)多種組分，實現(xiàn)多參數(shù)測量這是以2倍體和4倍體細胞為主的流式DNA圖在生物檢測技術中流式細胞儀是不可多得的一機多用的儀器。腫瘤組織中的各種DNA倍體流式細胞術檢測細胞表型以HEPES緩沖的Hank’s平衡鹽溶液洗三次，重懸于0.四）白血病的免疫分型用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，Singlecellssorted腫瘤組織中的各種DNA倍體在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側顯新月體形、核碎裂；流式細胞術白血病免疫分型是利用熒光素標記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的免疫表型，了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。五、流式細胞術的應用M1陰性界限劃分完全是根據(jù)陰性對照！如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積M1陰性界限劃分

六.分選：用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，大型機分選速度可達到每秒上萬個細胞六.分選：用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector488nmlaser+-FluorescenceAct前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積被標記組分含量的定量五、流式細胞術的應用細胞破膜后將細胞內(nèi)某一蛋白成分進行熒光標記，用流式細胞儀進行測量分析，同表型分析一樣，可以測量出這種陽性細胞的數(shù)量和這種蛋白的相對含量。二、流式細胞儀的工作原理和基本結構在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術。1973Steinkamp1934Moldavan側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析1934MoldavanDip%CV:6.intotesttubes圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死五）細胞內(nèi)蛋白的分析：熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。細胞表面/胞漿/核的特異性抗原檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。圖中2N代表G0/G1期細胞，4N代表G2/M期細胞，兩者中間代表S期細胞。intotesttubes在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術。三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為陽性細胞對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。利用流式細胞儀進行細胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細胞學診斷。1×106/ml的細胞懸液，1934Moldavan側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性1973Steinkamp對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡端粒（熒光蛋白）被標記組分含量的定量對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡intotesttubes對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。圖中2N代表G0/G1期細胞，4N代表G2/M期細胞，兩者中間代表S期細胞。Singlecellssorted流式細胞術檢測細胞表型根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細胞內(nèi)鈣離子的濃度。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡流式細胞儀顯微鏡流動的細胞靜止的細胞樣本數(shù)量大數(shù)量少高速分選樣本難以再利用細胞群體特征量分布揭示細胞內(nèi)部結構信息前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積在分析的同時可把什么是流式細胞儀●流式細胞儀實物BDFACSVantageBD-Calibur什么是流式細胞儀●流式細胞儀實物BDFACSVantage1.發(fā)展歷史1934Moldavan1973Steinkamp一、

概述一、

概述2.定義：對在高速流動的鞘液包括下對特異熒光標記的細胞、粒子進行分析和分選的技術.3.特點測量速度快，每秒鐘能測數(shù)千個乃至上萬個細胞可進行多參數(shù)測量在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術。2.定義：對在高速流動的鞘液包括下對特異熒光標記的細胞、粒凡是能被熒光素標記的細胞或顆粒都可用流式細胞儀檢測。前提這種熒光素能被流式細胞儀所配置的激光光源激發(fā)在生物檢測技術中流式細胞儀是不可多得的一機多用的儀器。4.應用范圍4.應用范圍二、流式細胞儀的工作原理和基本結構待測細胞以單個細胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動室。流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細胞液柱。液柱與激光束相交，細胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析。二、流式細胞儀的工作原理和基本結構待測細胞以單個細胞的懸液，流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件基本結構流動室和液流系統(tǒng)；激光源和光學系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機和分析系統(tǒng)。

基本結構流動室和液流系統(tǒng)；流式細胞術檢測細胞表型DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。細胞壞死時，細胞腫脹，F(xiàn)SC？，SSC？二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡1973Steinkamp對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡在生物檢測技術中流式細胞儀是不可多得的一機多用的儀器。FCM分析白血病免疫表型,快速、特異、準確，重復性好，能區(qū)分細胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預后判斷、發(fā)病機理研究等有重要價值。圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為陽性細胞DipS:17.熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖細胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學特征圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，端粒（熒光蛋白）熒光信號大小凋亡細胞的FSC？SSC？三、

流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)

非熒光信號顆粒度細胞大小前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積

側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性流式細胞術檢測細胞表型三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)

非血液涂片血液涂片外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。根據(jù)凋亡細胞的特點來檢測腫瘤組織中的各種DNA倍體在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側顯新月體形、核碎裂；定義：對在高速流動的鞘液包括下對特異熒光標記的細胞、粒子進行分析和分選的技術.流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。各探測通道接收并轉化為電信號。圖報告中常見的幾種流式細胞圖5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，細胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結合于細胞DNA，熒光強度與PI的結合量呈良好的線性關系，根據(jù)這個原理，可測出細胞的DNA含量。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡多熒光標記胞內(nèi)多種組分，實現(xiàn)多參數(shù)測量在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側顯新月體形、核碎裂；圖FCM測試細胞周Mean：平均熒光強度，與被檢測物質(zhì)的表達量有關，在正態(tài)分布時一般用該值。側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性激素結合位點、細胞受體四）白血病的免疫分型圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死熒光信號熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標記的細胞與無熒光標記的區(qū)分開來（陰陽）高FL細胞與低FL細胞區(qū)分開來（強弱）一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等熒光信號與細胞特性

熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。

定量染色熒光信號大小被標記組分含量的定量多熒光標記胞內(nèi)多種組分，實現(xiàn)多參數(shù)測量熒光信號與細胞特性熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。二色鏡

123帶通濾波片光電倍增管激光束細胞收集透鏡前向散射光側向散射光，熒光光信號分離，導向各探測通道接收并轉化為電信號。光信號收集二色鏡帶通濾波片激光束細胞收集透鏡前向散射光側向散射光，熒光三數(shù)據(jù)處理及流式報告FSCSSCFL1FL2FL3對數(shù)

線性線性

線性

對數(shù)脈沖處理，模數(shù)轉換光信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結果（面積，峰高，寬度）三數(shù)據(jù)處理及流式報告FSCSSCF流式報告的圖一般分為四種，即散點圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點圖和直方圖。幾個概念：%Gated：陽性細胞百分比。反映細胞群體中陽性細胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強度，與被檢測物質(zhì)的表達量有關，在正態(tài)分布時一般用該值。GeoMean：幾何平均熒光強度，在陽性細胞為偏態(tài)分布時一般用該值。流式報告的圖一般分為四種，即散點圖、直方圖、密度圖和二維等高散點圖

密度圖二維等高圖直方圖圖報告中常見的幾種流式細胞圖散點圖密度圖二維等高圖直方圖圖報告中常見的幾種流圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死流式細胞儀數(shù)據(jù)分析點圖分析流式細胞儀數(shù)據(jù)分析點圖分析流式細胞儀數(shù)據(jù)分析直方圖分析流式細胞儀數(shù)據(jù)分析直方圖分析圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為陽性細胞圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為

五、

流式細胞術的應用

細胞結構細胞大小細胞顆粒度細胞表面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……

細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)/外的細胞因子激素結合位點、細胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細胞膜電位、線粒體膜電位

……五、流式細胞術的應用

細胞結構細胞功能五）細胞內(nèi)蛋白的分析：圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死FALSSensor利用流式細胞儀進行細胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細胞學診斷。三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)FCM分析白血病免疫表型,快速、特異、準確，重復性好，能區(qū)分細胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預后判斷、發(fā)病機理研究等有重要價值。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡凋亡細胞的FSC？SSC？側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性腫瘤組織中的各種DNA倍體細胞壞死時，細胞腫脹，F(xiàn)SC？，SSC？一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側顯新月體形、核碎裂；三數(shù)據(jù)處理及流式報告藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死多熒光標記胞內(nèi)多種組分，實現(xiàn)多參數(shù)測量細胞膜電位、線粒體膜電位1934Moldavan如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術。一）細胞DNA含量檢測細胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因為PI特異性結合于細胞DNA，熒光強度與PI的結合量呈良好的線性關系，根據(jù)這個原理，可測出細胞的DNA含量。用于細胞周期、細胞倍體以及凋亡的檢測。

五）細胞內(nèi)蛋白的分析：一）細胞DNA含量檢測細胞固定后用流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件單參數(shù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細胞，4N代表G2/M期細胞，兩者中間代表S期細胞。這是以2倍體和4倍體細胞為主的流式DNA圖單參數(shù)直方圖圖中2N代表G0/G1期細胞，4N代表G2/M期89DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s2004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4N

DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s200400流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體含量與凋亡關系DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。凋亡過程中，細胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標本制備中的固定處理時，細胞膜的完整性被破壞，使細胞內(nèi)降解的DNA片段從細胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。含量與凋亡關系DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究

二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究1.腫瘤診斷DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標志細胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學特征利用流式細胞儀進行細胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細胞學診斷。1.腫瘤診斷DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標志2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體intotesttubes藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。intotesttubes三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。五、流式細胞術的應用DipG2-M:9.在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術。59%at96.側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性五）細胞內(nèi)蛋白的分析：三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡1934MoldavanDNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細胞內(nèi)鈣離子的濃度。123FCM檢測胞內(nèi)鈣離子、對數(shù)線性線性線性對數(shù)CellSorting流式細胞術白血病免疫分型是利用熒光素標記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的免疫表型，了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。intotesttubes2.凋亡研究在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，即凋亡峰。檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。2.凋亡研究在G0/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，即凋亡峰。流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件AnnexinVAssay

AnnexinVAssay

圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死Dateacquired:14-Jan-03File:7Gy4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%DipG0-G1:73.12%at48.16DipG2-M:9.59%at96.33DipS:17.29%G2/G1:2.00Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48

圖FCM測試細胞周期分布和凋亡Dateacquired:14-Jan-03圖FC根據(jù)凋亡細胞的特點來檢測在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側顯新月體形、核碎裂；細胞漿和細胞器密度增高、細胞體積變?。患毎ぐ櫿劬砬?，但早期細胞膜的完整性未受到破壞凋亡細胞的FSC？SSC？細胞壞死時，細胞腫脹，F(xiàn)SC？，SSC？根據(jù)凋亡細胞的特點來檢測在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究59%at96.流動室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡AnnexinVAssayDateacquired:14-Jan-03ChargedPlates檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。細胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細胞液柱。圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡Apoptosis:13.對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。定義：對在高速流動的鞘液包括下對特異熒光標記的細胞、粒子進行分析和分選的技術.ChargedPlates熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。在分析的同時可把具有指定特征的細胞分離出來，即分選技術。側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細胞內(nèi)鈣離子的濃度。CD3(T細胞，CD4、CD8))、CD19（B細胞）、CD16、CD56（NK細胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細胞增殖病、腫瘤療效觀察與預后判斷、移植免疫檢測等。

三）淋巴細胞分類二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究三）淋巴細胞分類流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期等應用完美版課件流式細胞術檢測細胞表型

流式細胞術檢測細胞表型

流式細胞術白血病免疫分型是利用熒光素標記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的免疫表型，了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型,快速、特異、準確，重復性好，能區(qū)分細胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預后判斷、發(fā)病機理研究等有重要價值。

四）白血病的免疫分型

四）白血病的免疫分型

五）細胞內(nèi)蛋白的分析：

細胞破膜后將細胞內(nèi)某一蛋白成分進行熒光標記，用流式細胞儀進行測量分析，同表型分析一樣，可以測量出這種陽性細胞的數(shù)量和這種蛋白的相對含量。熒光探針多為FITC。五）細胞內(nèi)蛋白的分析：細胞破膜后將細胞熒光信號使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光信號使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光樣本制備雙色直接染色熒光樣本制備雙色直接染色

端粒（熒光蛋白）端粒（熒光蛋白）

六）細胞內(nèi)鈣離子測定1×106/ml的細胞懸液，加入終濃度為1-5μmol/mlFluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hank’s平衡鹽溶液洗三次，重懸于0.5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細胞內(nèi)鈣離子的濃度。

115FCM檢測胞內(nèi)鈣離子、膜電位和線粒體功能FCM檢測胞內(nèi)鈣離子、M1陰性界限劃分完全是根據(jù)陰性對照！如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。M1陰性界限劃分完全是根據(jù)陰性對照！如下圖：紅色部分代表陰性12%at48.Apoptosis:13.檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。熒光強度（FL）：細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。DNA亞G1峰的檢測：利用PI染色，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積熒光探針多為FITC。如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。123一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出6個FL。對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡期分布和凋亡Fluorescencedetector圖AnnexinV/PI雙標記分析細胞凋亡和壞死用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，intotesttubes流式細胞術白血病免疫分型是利用熒光素標記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的免疫表型，了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。藍色部分即陽性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。三數(shù)據(jù)處理及流式報告如下圖：紅色部分代表陰性對照，即：所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎表達量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎水平、未受刺激時等。5ml同樣的溶液，上流式細胞儀檢測。檢測調(diào)亡，可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細胞的損傷機理的研究。

六.分選：用熒光探針標記的細胞，可被有效地分離出來，用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細胞，大型機分選速度可達到每秒上萬個細胞12%at48.六.分選：用熒光探針標記的細胞488nmlaser+-FluorescenceActivatedCellSortingChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector488nmlaser+-FluorescenceAct對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡流式細胞儀顯微鏡流動的細胞靜止的細胞樣本數(shù)量大數(shù)量少高速分選樣本難以再利用細胞群體特征量分布揭示細胞內(nèi)部結構信息對比-----流式細胞儀是一種特殊的顯微鏡流式細胞儀顯微鏡流流式細胞儀蛋白電泳多參數(shù)單參數(shù)量化的分布平均值容易檢測各個參數(shù)間的相關性不容易流式細胞儀蛋白電泳多參數(shù)單參數(shù)量化的分布平均值容易檢測各個參謝謝大家謝三、

流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)

非熒光信號顆粒度細胞大小前向角散射光（FSC）細胞相對大小及其表面積

側向角散射光（SSC）細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復雜性三、流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)

非熒光信號顆粒度細胞大小三數(shù)據(jù)處理及流式報告FSCSSCFL1FL2FL3對數(shù)

線性線性

線性

對數(shù)脈沖處理，模數(shù)轉換光信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結果（面積，峰高，寬度）三數(shù)據(jù)處理及流式報告FSCSSCF圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為陽性細胞圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為

六）細胞內(nèi)鈣離子測定1×106/ml的細胞懸液，加入終濃度為1-5μmol/mlFluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用