雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法建立

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下面是我為大家整理的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法建立,供大家參考。

1.材料與方法1.1檢測(cè)樣品的制備

2C3株抗牛安氏隱孢子蟲(chóng)卵囊壁特異性單抗，其制備和純化方法參照文獻(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性糞便，采自糞栓陽(yáng)性牛糞；標(biāo)準(zhǔn)陰性糞便，為經(jīng)3次不同時(shí)間采糞便集蟲(chóng)后，抗酸染色卵囊均為陰性的牛糞，交錯(cuò)回響糞便，為集蟲(chóng)糞檢僅球蟲(chóng)或結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)感染而無(wú)隱袍子蟲(chóng)感染的牛糞。

1.2.酶標(biāo)單克隆抗體的制備，參照文獻(xiàn)[2：舉行，其克分子比為1．96。

1.3.

被險(xiǎn)糞便處理方法：取糞2克參與含0.1％聚山梨酸20及2mmol/L乙二胺四乙酸的磷酸緩沖鹽溶液5m1碾碎后過(guò)濾備用。

1.4.雙抗夾心ＥＬＩＳＡ法工作程序聚乙烯回響板經(jīng)0.0025％的戊二醛溶液等處理后，使其更易與抗原或抗體結(jié)合．置4℃冰箱備用。包被液適當(dāng)稀釋兔抗體(ＩｇＧ),于微量酶標(biāo)板每孔加100ｌ,置4℃過(guò)夜后,用洗滌液洗3次。每孔加待測(cè)樣品100ｌ,同時(shí)設(shè)陰性和試劑空白比較,放置37℃回響2ｈ,用洗滌液洗3次。每孔加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗體1001置37℃回響2ｈ,用洗滌液洗滌3次。每孔加底物溶液100ｌ,室溫暗處放置20ｍｉｎ顯色,每孔加中止回響液50ｌ。然后在酶標(biāo)測(cè)定儀上測(cè)定490ｎｍ處的ＯＤ值。以樣品孔的ＯＤ值(Ｐ)與陰性比較孔的ＯＤ值(Ｎ)之比大于2(即Ｐ/Ｎ2)時(shí)定為陽(yáng)性。

1.5.雙抗夾心ＥＬＩＳＡ法工作濃度確實(shí)定通過(guò)交錯(cuò)連續(xù)稀釋分析法確定用于檢測(cè)斷定濃度抗原所需兔抗體(ＩｇＧ)和酶標(biāo)抗體的工作濃度。兔抗體(ＩｇＧ)濃度分別為25ｎｇ/ｍｌ、50ｎｇ/ｍｌ、75ｎｇ/ｍｌ、100ｎｇ/ｍｌ;蟲(chóng)卵濃度分別為107、106、105、104、103和102個(gè)/ｍｌ。酶標(biāo)抗體的稀釋度分別為1：50、1:100、1:200、1:400、1:800。在工作濃度選擇中,以Ｐ/Ｎ2時(shí),兔抗體(ＩｇＧ)濃度最低、酶標(biāo)抗體稀釋度最高為最適條件。

1.6.最正確回響條件確定

經(jīng)方陣滴定，確定單抗和酶標(biāo)單抗的員適工作濃度分別為1：400和1280倍比稀釋。參與糞樣和酶結(jié)合物孵育的時(shí)間可縮短至3min。除參與酶結(jié)合物回響后洗滌5次外，其余洗滌次數(shù)均為3次，洗滌時(shí)間可結(jié)至l0s。

1.7.阻斷試驗(yàn)

將單抗1：100稀釋?zhuān)?m1分裝于各試管，將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性糞便懸液從原液稀釋至512倍并參與試管內(nèi)，37℃水浴30min．60g離心30min．除去沉淀物，孵育后的糞便標(biāo)本舉行雙抗夾心ELISA，1.8.交錯(cuò)回響試驗(yàn)對(duì)4份有Eimeriabovis卵囊而無(wú)隱袍子蟲(chóng)卵囊的牛糞和5份有而無(wú)隱孢子蟲(chóng)卵囊的牛類(lèi)按前述方法處理后舉行ELISA。

1.9.重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)一致樣品不同批次舉行檢測(cè)。

1.10.敏感性試驗(yàn)對(duì)若干牛糞樣分別舉行抗酸染色和ELISA檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果舉行對(duì)比。

2結(jié)果2.1抗牛安氏隱孢子蟲(chóng)單抗(ＩｇＧ)和酶標(biāo)兔抗牛安氏隱孢子蟲(chóng)抗體最正確工作濃度確實(shí)定通過(guò)點(diǎn)陣分析法,在合意選擇條件下,本試驗(yàn)兔抗體(ＩｇＧ)工作濃度為