氨基酸的測定

氨基酸的測定一、概述氨基酸分析方法包括測定氨基酸的總含量及測定全氨基酸中每種氨基酸的含量兩個方面。測定氨基酸總量的方法與蛋白質(zhì)分析有密切的關系。許多測定蛋白質(zhì)全氮含量的方法如開氏定氮法及各種比色法均可用于測定氨基酸的總含量。此外，測定氨基酸總含量的方法還有氨基氮的甲醛滴定法、測定氨基氮的范司克萊法及茚三酮比色法。后一方法簡單，快速，廣泛應用于實際工作中。近代發(fā)展起來的各種色譜法是分析全氨基酸的有力工具。薄層層析是60年代發(fā)展起來的分析方法，它操作簡便、設備簡單、層析速度快、靈敏度高，廣泛應用于分離和測定氨基酸。近20年來應用氣相色譜法分析氨基酸已進行了大量的工作。氣相色譜法具有分析速度快、靈敏度高的特點，儀器的成本也比氨基酸自動分析儀低。尤其是在分析氨基酸的對映異構物及超微量（ng）樣品中氣相色譜有特殊的作用。氨基酸自動分析儀是應用最廣泛的分析氨基酸的專用儀器。該儀器的基本原理仍然是Moore和Stein所建立和發(fā)展的離子交換柱層析進行分析?？傊治霭被岬姆椒皟x器種類很多，我們只能有選擇地介紹幾種分析方法。氨基酸分析儀法方法原理氨基酸分析儀的中心是離子交換層析柱，當流動相（緩沖溶液）推動氨基酸流經(jīng)裝有陽離子交換樹脂的色譜柱時（日立835-50為磺酸型Na+柱），氨基酸與樹脂中的交換基團進行離子交換，當用不同的pH值的緩沖溶液進行洗脫時，因交換能力的不同而將氨基酸混合物分開，流出色譜柱的氨基酸再與茚三酮在100℃下反應生成紫色物質(zhì)茚二酮炔-茚二酮胺（DYDA），顯色后的氨基酸由光度計檢測；大多數(shù)氨基酸與茚三酮均有此反應，所形成的DYDA在570mm處有最大的吸收峰。但脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮生成黃色物質(zhì)，在440mm處有一吸收峰，通過光度計對這兩個波段的檢測，由記錄器給出層析圖譜，附有數(shù)據(jù)處理機的氨基酸自動分析儀可直接給出50μg樣品中含有各種氨基酸的納克（ng）數(shù)。主要儀器（1）835型高速氨基酸分析儀。真空裝置。用油旋轉(zhuǎn)泵及真空管（圖14-1）。煤氣噴燈。使用硬質(zhì)玻璃水解管時，使用氧氣。（4）恒溫器。110℃，最好用鋁合金制的熱處理槽。（5）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。（6）水解用玻璃試管。最好用硬質(zhì)玻璃制成（圖14-2)。均化器（旋轉(zhuǎn)式混合器）。試劑(1)6moL·L-HCl。(2)880mL·L-1甲酸。(3)300g·L-'H2O2。(4)β-巰基乙醇。(5)750mL·L-’乙醇。(6)檸檬酸鹽緩沖溶液和水合茚三酮溶液的配制方法見表14-3和表14-4。操作步驟（1）全氨基酸試樣的制備。①取樣。按常法粉碎的試樣，精確稱取含蛋白質(zhì)約10mg的量，置于水解管中，加6mol·L-'HC110mL。如果是液體試樣，加入與試樣等量的濃鹽酸。②脫氣。如圖14-4所示，在真空裝置上安裝水解管，用真空泵脫氣。將旋塞（圖14-2的A）開啟數(shù)次進行脫氣。脫氣完后，在水解管的A處用煤氣噴燈溶化，使其密封。③水解。用110℃恒溫器水解22h。④去除鹽酸。水解完后，把水解管開封，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除鹽酸。干涸后，用蒸餾水溶解，再次干涸（在50℃以下干燥）。⑤試樣溶液的制備。去除鹽酸的試樣，溶于10mL的檸檬酸鈉緩（pH-2）沖溶液中。（2）胱氨酸及色氨酸的水解。由于胱氨酸及色氨酸在用鹽酸水解時被破壞，所以必須另行分解。①胱氨酸。胱氨酸被過甲酸氧化成半胱酸后，用鹽酸水解。將含有胱氨酸0.25～1.00μmol的試樣溶于880mL·L-|的甲酸10mL中，取此試樣溶液0.5mL置于具塞試管中，加入過甲酸溶液（300mL-L-過氧化氫水和880mL·L-1甲酸按溶積1∶9的比例混合，室溫下放置1h后使用）2mL，在0℃下放置4h，氧化終了后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除過甲酸，然后用含0.2~0.4mL·L-4-巰②色氨酸。色氨酸試樣要加堿水解。取含有色氨酸1～2mg的試樣，置于聚乙烯管中，將此管封在玻璃管中（圖14-3）。加入4.2mol·L-1氫氧化鈉溶液100mL和硫代二甘醇0.3mL，脫氣后，封管，在110℃下水解24h。分解物用6mol·L-1HCl7mL中和，再用pH4.2的檸檬酸緩沖溶液調(diào)整pH為4.5，定容至一定量。（3）植物性產(chǎn)品中游離氨基酸試樣的制備。把試樣細切或粉碎，取20～50g置于乙醇中，使乙醇最終濃度為750mL·L-1。通常取10mL左右，用均化器均質(zhì)后，移入茄形燒瓶中，在80℃下加熱回流15min，然后冷卻，用瓷漏斗過濾，殘渣用750g·L-1乙醇50mL再提取兩次，濾液合并定容至250mL，在-20℃下放置一夜。生成沉淀時，用玻璃過濾器（G-3）過濾或離心分離（6000rmin-1，10min），濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除水分，干涸物溶于試樣稀釋用的緩沖溶液中。（4）上機測定。具體的測定操作步驟，應根據(jù)各種不同型號的氨基酸測定儀詳細說明來進行。一般需經(jīng)下列幾個步驟。①樣品的水解。②試樣中氨基酸濃度的估量，以日立835-50型高速氨基酸分析儀為例，上機分析的各種氨基酸濃度應在1～10nmol/50μL為宜。③分析前的儀器檢查，一般有水浴及反應槽的溫度，泵的流速，緩沖液，茚三酮試劑以及N；氣壓力等儀器的各種性能檢查。④分析程序的設定，須按儀器說明書推薦使用的分析程序操作。⑤混合氨基酸標