第二章基因工程工具酶(簡(jiǎn)化版)課件

第二章基因工程的工具酶第二章基因工程的工具酶1一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制(restriction)修飾(modification)限制性核酸內(nèi)切酶的生物學(xué)功能：自我保護(hù)功能(只切外來(lái)的DNA，自身DNA被甲基化后切不動(dòng))一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制2核酸酶：水解斷裂多核苷酸鏈的兩個(gè)相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵核糖核酸酶（RNase）：脫氧核糖核酸酶（DNase）：核酸外切酶（exonuclease）：核酸內(nèi)切酶（endonuclease）：限制性核酸內(nèi)切酶：核酸酶：水解斷裂多核苷酸鏈的兩個(gè)相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵3二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM識(shí)別序列特異性非對(duì)稱性序列特異性4-8bp旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列特異性非對(duì)稱性序列切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割距識(shí)別序列下游24-26bp用途無(wú)應(yīng)用價(jià)值應(yīng)用廣泛無(wú)應(yīng)用價(jià)值二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型III4平末端粘性末端1單位酶活性(1unit1U)：在最適反應(yīng)條件下1小時(shí)完全切割1ugλDNA樣品的酶量。同序同裂酶(識(shí)別及酶切位點(diǎn)相同):同序異裂酶(識(shí)別位點(diǎn)相同但酶切位點(diǎn)不同):同尾酶(酶切位點(diǎn)不同但產(chǎn)生相同的粘性末端):平末端5酶切位點(diǎn)的計(jì)算：四核苷酸識(shí)別序列：44=256六核苷酸識(shí)別序列：46=40962個(gè)假設(shè)：a隨機(jī)排列；bGC含量50%如：用BglⅡ(A/GATC/T)酶切λDNA49Kb）:理論上的切點(diǎn)數(shù)：49000/4096=12個(gè)實(shí)際情況？酶切位點(diǎn)的計(jì)算：四核苷酸識(shí)別序列：44=2566三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名1973年H.Smith和D.Nathans提議①每一種酶都由產(chǎn)生并純化生出該酶的細(xì)菌的種屬名中的三個(gè)英文字母合起來(lái)代表：第一個(gè)字母采用細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母大寫(xiě)；第二和第三個(gè)字母小寫(xiě)，采用細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母；如大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示，代表從大腸桿菌中分離出的限制性內(nèi)切酶。②第四個(gè)字母表示菌株的類型（大小寫(xiě)均有），如EcoR中的R代表大腸桿菌R株。③如果一個(gè)菌株有幾種限制酶，則在代表菌株的字母后用羅馬數(shù)字表示。三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名1973年H.Smith和D.Na7思考題：流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）d菌株有三種限制酶，分別怎么表示？HindI、HindII、HindIIIBaciUusamyloliquefaciensH

StreptomycesalbusI思考題：HindI、HindII、HindIIIBaciU8一、天然DNA的制備

1、天然DNA的來(lái)源①染色體DNA②病毒和噬菌體DNA③質(zhì)粒DNA④線粒體和葉綠體DNA第二節(jié)DNA分子片段化一、天然DNA的制備1、天然DNA的來(lái)源第二節(jié)DNA92、天然DNA的提取

①準(zhǔn)備生物材料。②裂解細(xì)胞。③分離和抽提DNA。2、天然DNA的提?、贉?zhǔn)備生物材料。10二、DNA的純化

瓊脂糖凝膠電泳洗脫法適用于小劑量DNA的純化和酶切DNA片段的回收。二、DNA的純化瓊脂糖凝膠電泳洗脫法11三、

DNA的濃縮

乙醇沉淀法在含一價(jià)陽(yáng)離子的DNA溶液中加入2體積的無(wú)水乙醇，使DNA沉淀（-20℃，時(shí)間在30min以上）通過(guò)離心收集沉淀的DNA溶于適量的TE緩沖液或無(wú)菌水中三、DNA的濃縮乙醇沉淀法12四、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)1、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液

四、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)1、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液132、單酶切法

若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，完全酶切后，產(chǎn)生與識(shí)別序列數(shù)（n）相同的DNA片段數(shù)，并且DNA片段的兩末端相同

若DNA樣品本來(lái)就是線形

DNA片段，完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生n＋1個(gè)

DNA片段數(shù)，其中有兩個(gè)片段的一端仍保留原來(lái)的末端

2、單酶切法若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，完全酶切后，產(chǎn)14

3、雙酶切法

應(yīng)先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)行切割，然后調(diào)節(jié)緩沖液的鹽濃度，再加入需要較高鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)行切割。如果兩種限制性核酸內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，則應(yīng)先用最適反應(yīng)溫度較低的酶進(jìn)行切割，升溫后再加入第二種酶進(jìn)行切割。若兩種限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)系統(tǒng)相差很大，會(huì)明顯影響雙酶切結(jié)果，則可以在第一種酶切割后，經(jīng)過(guò)凝膠電泳回收需要的DNA片段，再選用合適的反應(yīng)系統(tǒng)，進(jìn)行第二種限制性核酸內(nèi)切酶的切割。3、雙酶切法應(yīng)先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)行切割154、部分酶切

當(dāng)某種限制性核酸內(nèi)切酶在待切割的DNA分子上有多個(gè)識(shí)別序列，并且其中一個(gè)識(shí)別序列正好在切割后需要回收待用的DNA片段上，若完全酶切，勢(shì)必將此待用的DNA片段從中切斷。在此情況下，對(duì)DNA樣品進(jìn)行部分酶切，經(jīng)過(guò)凝膠電泳，根據(jù)待用DNA片段的大小，可回收待用的DNA片段

4、部分酶切當(dāng)某種限制性核酸內(nèi)切酶在待切割的DNA分165、DNA分子的限制性圖譜5、DNA分子的限制性圖譜17五

、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素（1）DNA的純度（2）DNA的甲基化程度（3）酶切消化反應(yīng)的溫度（4）DNA的分子結(jié)構(gòu)

（5）星星活性

五、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素（1）DNA的純度18第三節(jié)DNA聚合酶

第三節(jié)DNA聚合酶19一、DNA聚合酶概述DNA聚合酶（polymerase）：以DNA或RNA為模板催化合成互補(bǔ)新鏈的酶。大多需要一個(gè)引物來(lái)起始互補(bǔ)新鏈的合成。

一、DNA聚合酶概述20

間斷(discontinuity)：在DNA的一條鏈上某一位置兩個(gè)相鄰的核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂。缺刻(nick)：某一位置上丟失了一個(gè)或幾個(gè)核苷酸。

間斷(discontinuity)：在DNA的一條鏈上21（1）以DNA聚合酶I為代表的“合成型”

（2）以klenow聚合酶為代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性

（3）逆轉(zhuǎn)錄酶類，以RNA作為聚合模板根據(jù)模板和作用方式的不同分為三類：（1）以DNA聚合酶I為代表的“合成型”

（2）以kleno22二、大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）1、性質(zhì):①5’→3’DNA聚合酶活性②3’→5’外切核酸酶活性③5’→3’外切核酸酶活性二、大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）1、性質(zhì):23三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段

（Klenow片段）

1、性質(zhì)

它具有5’→3’聚合活性和3’→5’外切酶活性,失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性.三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段

（Klenow片段）24四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切核酸酶活性。其3’→5’外切酶活性對(duì)單鏈DNA的作用比對(duì)雙鏈DNA的作用更強(qiáng)。它的外切核酸酶活性比kenow片段要強(qiáng)200倍。2、用途1）補(bǔ)平或標(biāo)記限制性內(nèi)切酶消化DNA后產(chǎn)生的3’凹端。2）對(duì)帶有3’突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記。四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)2、用途25五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)持續(xù)合成能力最強(qiáng)3’→5’外切核酸酶活性為klenow片段的1000倍沒(méi)有5’→3’外切酶活性。2、主要用途1）用于拷貝長(zhǎng)段模板的引物延伸反應(yīng)。2）通過(guò)補(bǔ)平或交換（置換）反應(yīng)進(jìn)行快速末端標(biāo)記。五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)26六、TaqDNA聚合酶

具有5’→3’外切核酸酶活性。最佳作用溫度為75-80℃。無(wú)3’

→5’外切核酸酶活性，糾錯(cuò)功能較差。用途

1）可使特定序列擴(kuò)增106倍。2）用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），對(duì)DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增。六、TaqDNA聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活27七、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

依賴于RNA的DNA聚合酶商品化逆轉(zhuǎn)錄酶：①禽源反轉(zhuǎn)錄酶（AMV），②鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（Mo—MLV）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈

雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈七、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）28第四節(jié)PCR反應(yīng)及應(yīng)用PCR（PolymeraseChainReaction）稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、對(duì)標(biāo)本的純度要求低等特點(diǎn)。第四節(jié)PCR反應(yīng)及應(yīng)用PCR（PolymeraseCha29變性94?C延伸72?C退火Tm-5?C基本反應(yīng)步驟變性延伸退火基本反應(yīng)步驟30

PCR技術(shù)的特點(diǎn)

高特異性

高靈敏度

簡(jiǎn)便快速

低純度標(biāo)本也可使用PCR技術(shù)的特點(diǎn)

高特異性

高靈敏度

簡(jiǎn)便快速31第五節(jié)

DNA連接酶（ligase）

第五節(jié)DNA連接酶（ligase）32DNA連接酶：將兩個(gè)DNA片段通過(guò)催化形成3’，5’－磷酸二酯鍵而連接起來(lái)的酶。T4

DNA連接酶：可連接DNA鏈（平粘端均可），也可連RNA鏈，應(yīng)用廣泛。E.coliDNA連接酶：平端連接效率遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶，不能連接RNA分子。T4

RNA連接酶：可催化兩個(gè)單鏈DNA或RNA分子的連接。DNA連接酶：將兩個(gè)DNA片段通過(guò)催化形成3’，5’－磷酸二33一、連接酶功能1、間斷修復(fù)功能2、連接功能一、連接酶功能34三、粘性末端連接技術(shù)1、銜接體(linker)技術(shù)2、結(jié)合體(adaptor)技術(shù)3、同聚體(homopolymer)加尾技術(shù)三、粘性末端連接技術(shù)1、銜接體(linker)35第六節(jié)結(jié)合體技術(shù)的應(yīng)用

—AFLP第六節(jié)結(jié)合體技術(shù)的應(yīng)用

—AFLP36AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）AFLP一詞是1991年Gustavo提出的;該方法結(jié)合了RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)技術(shù)和RAPD技術(shù)的特點(diǎn);使用人工接頭（Adaptor）與限制性內(nèi)切酶酶切的基因組DNA片段連接并以此為DNA模板，合成系列3`—末端隨機(jī)變化數(shù)個(gè)堿基且與人工接頭序列相互補(bǔ)的PCR引物，來(lái)進(jìn)行PCR特異條帶擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)后可獲得DNA指紋圖譜。AFLP37此項(xiàng)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)（1）穩(wěn)定，重復(fù)性好；（2）需用的DNA量少，適用于分析的DNA大小范圍寬；（3）能產(chǎn)生更多的多態(tài)性標(biāo)志，得到的條帶也更密集，一般比RFLP和RAPD多10～100倍，便于比較分析；（4）操作易于標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化，適于大批量的樣品分析。第二章基因工程工具酶(簡(jiǎn)化版)課件38

第七節(jié)基因工程的其它酶類第七節(jié)基因工程的其它酶類39一、DNA及RNA的修飾酶（一）未端（脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶（二）堿性磷酸酶(alkalinephosphatase）（三）多核苷酸激酶(polynucleotidekinase)一、DNA及RNA的修飾酶（二）堿性磷酸酶(alkaline40二、單鏈核酸內(nèi)切酶（一）S1核酸酶（二）Bal31核酸酶二、單鏈核酸內(nèi)切酶（一）S1核酸酶41

核酸外切酶底物切割位點(diǎn)大腸桿菌核酸外切酶ⅠssDNA5’—OH末端大腸桿菌核酸外切酶ⅢdsDNA3’—OH末端大腸桿菌核酸外切酶ⅤDNA3’—OH末端大腸桿菌核酸外切酶ⅦssDNA

3’末端，5’P末端λ噬菌體λ核酸外切酶dsDNA5’P末端T7噬菌體核酸外切酶dsDNA5’P末端三、核酸外切酶(exonucleases)核酸外切酶底物42本章復(fù)習(xí)要點(diǎn)限制性內(nèi)切酶三種類型酶及各自特征；II型酶的相關(guān)概念；酶切位點(diǎn)的估算；酶切反應(yīng)。DNA聚合酶

DNA聚合酶I、Klenow酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶及Taq酶各自的作用特點(diǎn)及用途；PCR的作用原理及幾種延伸技術(shù)。DNA連接酶

T4DNA連接酶的作用特點(diǎn)；銜接體、人工接頭及同聚物加尾三種技術(shù)的原理；AFLP技術(shù)的原理。其它工具酶末端轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶及T4多聚核苷酸激酶的特點(diǎn)及用途。本章復(fù)習(xí)要點(diǎn)限制性內(nèi)切酶43第二章基因工程的工具酶第二章基因工程的工具酶44一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制(restriction)修飾(modification)限制性核酸內(nèi)切酶的生物學(xué)功能：自我保護(hù)功能(只切外來(lái)的DNA，自身DNA被甲基化后切不動(dòng))一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制45核酸酶：水解斷裂多核苷酸鏈的兩個(gè)相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵核糖核酸酶（RNase）：脫氧核糖核酸酶（DNase）：核酸外切酶（exonuclease）：核酸內(nèi)切酶（endonuclease）：限制性核酸內(nèi)切酶：核酸酶：水解斷裂多核苷酸鏈的兩個(gè)相鄰核苷酸的3,5磷酸二酯鍵46二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM識(shí)別序列特異性非對(duì)稱性序列特異性4-8bp旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列特異性非對(duì)稱性序列切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割距識(shí)別序列下游24-26bp用途無(wú)應(yīng)用價(jià)值應(yīng)用廣泛無(wú)應(yīng)用價(jià)值二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型III47平末端粘性末端1單位酶活性(1unit1U)：在最適反應(yīng)條件下1小時(shí)完全切割1ugλDNA樣品的酶量。同序同裂酶(識(shí)別及酶切位點(diǎn)相同):同序異裂酶(識(shí)別位點(diǎn)相同但酶切位點(diǎn)不同):同尾酶(酶切位點(diǎn)不同但產(chǎn)生相同的粘性末端):平末端48酶切位點(diǎn)的計(jì)算：四核苷酸識(shí)別序列：44=256六核苷酸識(shí)別序列：46=40962個(gè)假設(shè)：a隨機(jī)排列；bGC含量50%如：用BglⅡ(A/GATC/T)酶切λDNA49Kb）:理論上的切點(diǎn)數(shù)：49000/4096=12個(gè)實(shí)際情況？酶切位點(diǎn)的計(jì)算：四核苷酸識(shí)別序列：44=25649三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名1973年H.Smith和D.Nathans提議①每一種酶都由產(chǎn)生并純化生出該酶的細(xì)菌的種屬名中的三個(gè)英文字母合起來(lái)代表：第一個(gè)字母采用細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母大寫(xiě)；第二和第三個(gè)字母小寫(xiě)，采用細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母；如大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示，代表從大腸桿菌中分離出的限制性內(nèi)切酶。②第四個(gè)字母表示菌株的類型（大小寫(xiě)均有），如EcoR中的R代表大腸桿菌R株。③如果一個(gè)菌株有幾種限制酶，則在代表菌株的字母后用羅馬數(shù)字表示。三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名1973年H.Smith和D.Na50思考題：流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）d菌株有三種限制酶，分別怎么表示？HindI、HindII、HindIIIBaciUusamyloliquefaciensH

StreptomycesalbusI思考題：HindI、HindII、HindIIIBaciU51一、天然DNA的制備

1、天然DNA的來(lái)源①染色體DNA②病毒和噬菌體DNA③質(zhì)粒DNA④線粒體和葉綠體DNA第二節(jié)DNA分子片段化一、天然DNA的制備1、天然DNA的來(lái)源第二節(jié)DNA522、天然DNA的提取

①準(zhǔn)備生物材料。②裂解細(xì)胞。③分離和抽提DNA。2、天然DNA的提?、贉?zhǔn)備生物材料。53二、DNA的純化

瓊脂糖凝膠電泳洗脫法適用于小劑量DNA的純化和酶切DNA片段的回收。二、DNA的純化瓊脂糖凝膠電泳洗脫法54三、

DNA的濃縮

乙醇沉淀法在含一價(jià)陽(yáng)離子的DNA溶液中加入2體積的無(wú)水乙醇，使DNA沉淀（-20℃，時(shí)間在30min以上）通過(guò)離心收集沉淀的DNA溶于適量的TE緩沖液或無(wú)菌水中三、DNA的濃縮乙醇沉淀法55四、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)1、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液

四、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)1、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液562、單酶切法

若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，完全酶切后，產(chǎn)生與識(shí)別序列數(shù)（n）相同的DNA片段數(shù)，并且DNA片段的兩末端相同

若DNA樣品本來(lái)就是線形

DNA片段，完全酶切的結(jié)果，產(chǎn)生n＋1個(gè)

DNA片段數(shù)，其中有兩個(gè)片段的一端仍保留原來(lái)的末端

2、單酶切法若DNA樣品是環(huán)狀DNA分子，完全酶切后，產(chǎn)57

3、雙酶切法

應(yīng)先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)行切割，然后調(diào)節(jié)緩沖液的鹽濃度，再加入需要較高鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)行切割。如果兩種限制性核酸內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，則應(yīng)先用最適反應(yīng)溫度較低的酶進(jìn)行切割，升溫后再加入第二種酶進(jìn)行切割。若兩種限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)系統(tǒng)相差很大，會(huì)明顯影響雙酶切結(jié)果，則可以在第一種酶切割后，經(jīng)過(guò)凝膠電泳回收需要的DNA片段，再選用合適的反應(yīng)系統(tǒng)，進(jìn)行第二種限制性核酸內(nèi)切酶的切割。3、雙酶切法應(yīng)先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)行切割584、部分酶切

當(dāng)某種限制性核酸內(nèi)切酶在待切割的DNA分子上有多個(gè)識(shí)別序列，并且其中一個(gè)識(shí)別序列正好在切割后需要回收待用的DNA片段上，若完全酶切，勢(shì)必將此待用的DNA片段從中切斷。在此情況下，對(duì)DNA樣品進(jìn)行部分酶切，經(jīng)過(guò)凝膠電泳，根據(jù)待用DNA片段的大小，可回收待用的DNA片段

4、部分酶切當(dāng)某種限制性核酸內(nèi)切酶在待切割的DNA分595、DNA分子的限制性圖譜5、DNA分子的限制性圖譜60五

、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素（1）DNA的純度（2）DNA的甲基化程度（3）酶切消化反應(yīng)的溫度（4）DNA的分子結(jié)構(gòu)

（5）星星活性

五、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素（1）DNA的純度61第三節(jié)DNA聚合酶

第三節(jié)DNA聚合酶62一、DNA聚合酶概述DNA聚合酶（polymerase）：以DNA或RNA為模板催化合成互補(bǔ)新鏈的酶。大多需要一個(gè)引物來(lái)起始互補(bǔ)新鏈的合成。

一、DNA聚合酶概述63

間斷(discontinuity)：在DNA的一條鏈上某一位置兩個(gè)相鄰的核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂。缺刻(nick)：某一位置上丟失了一個(gè)或幾個(gè)核苷酸。

間斷(discontinuity)：在DNA的一條鏈上64（1）以DNA聚合酶I為代表的“合成型”

（2）以klenow聚合酶為代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性

（3）逆轉(zhuǎn)錄酶類，以RNA作為聚合模板根據(jù)模板和作用方式的不同分為三類：（1）以DNA聚合酶I為代表的“合成型”

（2）以kleno65二、大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）1、性質(zhì):①5’→3’DNA聚合酶活性②3’→5’外切核酸酶活性③5’→3’外切核酸酶活性二、大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）1、性質(zhì):66三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段

（Klenow片段）

1、性質(zhì)

它具有5’→3’聚合活性和3’→5’外切酶活性,失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性.三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段

（Klenow片段）67四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切核酸酶活性。其3’→5’外切酶活性對(duì)單鏈DNA的作用比對(duì)雙鏈DNA的作用更強(qiáng)。它的外切核酸酶活性比kenow片段要強(qiáng)200倍。2、用途1）補(bǔ)平或標(biāo)記限制性內(nèi)切酶消化DNA后產(chǎn)生的3’凹端。2）對(duì)帶有3’突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記。四、T4噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)2、用途68五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)持續(xù)合成能力最強(qiáng)3’→5’外切核酸酶活性為klenow片段的1000倍沒(méi)有5’→3’外切酶活性。2、主要用途1）用于拷貝長(zhǎng)段模板的引物延伸反應(yīng)。2）通過(guò)補(bǔ)平或交換（置換）反應(yīng)進(jìn)行快速末端標(biāo)記。五、T7噬菌體DNA聚合酶1、性質(zhì)69六、TaqDNA聚合酶

具有5’→3’外切核酸酶活性。最佳作用溫度為75-80℃。無(wú)3’

→5’外切核酸酶活性，糾錯(cuò)功能較差。用途

1）可使特定序列擴(kuò)增106倍。2）用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），對(duì)DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增。六、TaqDNA聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活70七、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

依賴于RNA的DNA聚合酶商品化逆轉(zhuǎn)錄酶：①禽源反轉(zhuǎn)錄酶（AMV），②鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（Mo—MLV）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈

雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈七、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）71第四節(jié)PCR反應(yīng)及應(yīng)用PCR（PolymeraseChainReaction）稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、對(duì)標(biāo)本的純度要求低等特點(diǎn)。第四節(jié)PCR反應(yīng)及應(yīng)用PCR（PolymeraseCha72變性94?C延伸72?C退火Tm-5?C基本反應(yīng)步驟變性延伸退火基本反應(yīng)步驟73

PCR技術(shù)的特點(diǎn)

高特異性

高靈敏度

簡(jiǎn)便快速

低純度標(biāo)本也可使用PCR技術(shù)的特點(diǎn)

高特異性

高靈敏度

簡(jiǎn)便快速74第五節(jié)

DNA連接酶（ligase）

第五節(jié)DNA連接酶（ligase）75DNA連接酶：將兩個(gè)DNA片段通過(guò)催化形成3’，5’－磷酸二酯鍵而連接起來(lái)的酶。T4

DNA連接酶：可連接DNA鏈（平粘端均可），也可連RNA鏈，應(yīng)用廣泛。E.coliDNA連接酶：平端連接效率遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶，不能連接RNA分子。T4

RNA連接酶：可催化兩個(gè)單鏈DNA或RNA分子的連接。DNA連接酶：將兩個(gè)DNA片段通過(guò)催化形成3’，5’－磷酸二76一、連接酶功能1、間斷修復(fù)功能2、連接功能一、連接酶功能77三、粘性末端連接技術(shù)1、銜接體(linker)技術(shù)2、結(jié)合體(adaptor)技術(shù)3、同聚體(homopolymer)加尾技術(shù)三、粘性末端連接技術(shù)1、銜接體(linker)78第六節(jié)結(jié)合體技術(shù)的應(yīng)用

—AFLP第六節(jié)結(jié)合體技術(shù)的應(yīng)用

—AFLP79AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）AFLP一詞是1991年Gustavo提出的;該方法結(jié)合了RFLP(restrictionfragmentleng