微生物發(fā)酵工程課件

第五章發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制第五章發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制內(nèi)容1.概述2.發(fā)酵液的預(yù)處理3.固液分離4.細(xì)胞破碎5.初步純化6.精細(xì)純化7.成品加工內(nèi)容1.概述1.概述發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制是發(fā)酵工程不可分割的重要組成部分:獲得高品質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)品；提取與精制技術(shù)的進(jìn)步及工藝優(yōu)化可以對(duì)發(fā)酵工程上游提出新的技術(shù)及工藝改進(jìn)要求。1.概述發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制是發(fā)酵工程不可分割的重要組成整個(gè)下游提取精制加工過程應(yīng)遵循如下原則：快速操作低溫環(huán)境溫和條件盡可能小的剪切作用和防止污染對(duì)于基因工程產(chǎn)品，還應(yīng)注意生物安全。整個(gè)下游提取精制加工過程應(yīng)遵循如下原則：1.1提取與精制過程的一般工藝流程圖5-1目的產(chǎn)物提取與精制過程的一般工藝流程1.1提取與精制過程的一般工藝流程圖5-1目的產(chǎn)物提取與整個(gè)分離路線一般可分為以下五個(gè)主要步驟：預(yù)處理、固液分離、初步純化、精細(xì)純化、成品加工。整個(gè)分離路線一般可分為以下五個(gè)主要步驟：預(yù)處理、固液分離、初預(yù)處理：采用加熱、調(diào)整pH、絮凝等措施和單元操作改變發(fā)酵液的理化性質(zhì)，為固液分離作準(zhǔn)備。固液分離：采用珠磨、勻漿、酶溶、過濾、離心等單元操作除去固相，獲得包含目的產(chǎn)物的液相，供進(jìn)一步分離純化用。初步純化：采用萃取、吸附、沉淀、離心等單元操作，將目的成分與大部分雜質(zhì)分離開來。精細(xì)純化：采用層析、電泳、分子蒸餾等單元操作，將目的成分與雜質(zhì)進(jìn)一步分離，使產(chǎn)物達(dá)到預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。成品加工：采用結(jié)晶、濃縮、干燥等單元操作，將目的產(chǎn)物加工成適應(yīng)市場(chǎng)需要的商品。預(yù)處理：采用加熱、調(diào)整pH、絮凝等措施和單元操作改變發(fā)酵液的1.2發(fā)酵產(chǎn)物提取精制方法的優(yōu)化與工藝設(shè)計(jì)目標(biāo)：產(chǎn)率高、品質(zhì)優(yōu)、成本低、操作簡(jiǎn)便、無環(huán)境污染。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的基本原則：采用的分離純化步驟盡可能少，應(yīng)用單元操作的次序和工藝設(shè)計(jì)要合理。在純化方法的選擇和設(shè)計(jì)的過程中，應(yīng)注意充分總結(jié)并參考前人的大量實(shí)踐結(jié)果。在初步選定各個(gè)單元操作方法之后，確定各個(gè)單元操作的先后次序。一般來說，收率高、純度稍低的方法在前，純度高的方法在后。1.2發(fā)酵產(chǎn)物提取精制方法的優(yōu)化與工藝設(shè)計(jì)目標(biāo)：產(chǎn)率高、品內(nèi)容1.概述2.原料與預(yù)處理3.固液分離4.細(xì)胞破碎5.初步純化6.精細(xì)純化7.成品加工內(nèi)容1.概述發(fā)酵液的特性：①發(fā)酵產(chǎn)物濃度低，處理體積大。②微生物細(xì)胞的顆粒小，相對(duì)密度與液相相差不大。③細(xì)胞含水量大，可壓縮性大，一經(jīng)壓縮就會(huì)變形。④液相黏度大，容易吸附在濾布上。⑤產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定。發(fā)酵液的特性：2.1改變發(fā)酵培養(yǎng)物的過濾特性改變發(fā)酵培養(yǎng)物過濾特性的方法：降低發(fā)酵培養(yǎng)物的黏度采用添加絮凝劑調(diào)整發(fā)酵液培養(yǎng)物pH2.1改變發(fā)酵培養(yǎng)物的過濾特性改變發(fā)酵培養(yǎng)物過濾特性的方法2.1.1降低液體黏度濾液通過濾餅的速率與液體的黏度成反比，因此降低液體黏度可以提高過濾效率。（1）加水稀釋法：能降低液體黏度，但會(huì)增加發(fā)酵液的體積，加大后續(xù)過程的處理量。采用此法時(shí)要慎重考慮。（2）加熱升溫法：可以有效降低液體黏度，提高過濾效率。但加熱溫度和時(shí)間必須控制在不影響目的產(chǎn)物活性的范圍內(nèi)，而且要防止加熱導(dǎo)致的細(xì)胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，增加發(fā)酵液的復(fù)雜性和隨后的產(chǎn)物分離純化。（3）酶解法發(fā)酵液中如含有多糖類物質(zhì)，則可用酶將它們降解成寡糖或單糖，以提高過濾效率。2.1.1降低液體黏度濾液通過濾餅的速率與液體的黏度成反比2.1.2

凝聚與絮凝通過有效地改變菌體細(xì)胞和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使其凝聚成較大的顆粒，便于過濾。（1）凝聚：在中性鹽的作用下，由于膠體粒子之間雙電子層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定出現(xiàn)聚集的現(xiàn)象。發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷。在生理pH下，發(fā)酵液中的菌體或蛋白質(zhì)常常帶有負(fù)電荷，由于靜電吸引作用，在界面上形成了雙電層，這種雙電層的結(jié)構(gòu)使膠粒間不容易聚集而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)。向膠體懸液中加入某種電解質(zhì)，在電解質(zhì)中異電離子的作用下，膠粒的雙電層電位降低，使膠體體系不穩(wěn)定，從而相互碰撞而產(chǎn)生凝聚。常用的凝聚電解質(zhì)有硫酸鋁，氯化鋁、氧化鐵等2.1.2凝聚與絮凝通過有效地改變菌體細(xì)胞和蛋白質(zhì)等膠體粒（2）絮凝：是指在某些高分子絮凝劑存在的情況下，基于架橋作用，使膠粒形成絮凝團(tuán)的過程。絮凝劑是一種水溶性的高分子聚合物，具有長鏈結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有相當(dāng)多的活性官能團(tuán)，通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，能強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。當(dāng)一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上產(chǎn)生架橋連接時(shí)，就形成了較大的絮團(tuán)，從而產(chǎn)生絮凝作用。發(fā)酵工業(yè)適宜的絮凝劑包括：有機(jī)高分子類如聚丙烯酰胺類衍生物，無機(jī)高分子聚合物絮凝劑如聚合鋁鹽，以及天然有機(jī)高分子絮凝劑如海藻酸類、明膠、幾丁質(zhì)等。（2）絮凝：是指在某些高分子絮凝劑存在的情況下，基于架橋作用（3）混凝：同時(shí)包括凝聚和絮凝作用的過程。加入電解質(zhì)，使懸浮離子間的雙電層電位降低，脫穩(wěn)，凝聚成微粒，然后再加入非離子型和陰離子型高分子絮凝劑凝聚成較大的顆粒，以提高絮凝效果。（3）混凝：同時(shí)包括凝聚和絮凝作用的過程。2.1.3調(diào)節(jié)發(fā)酵液pHpH直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)。對(duì)于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在等電點(diǎn)下，溶解度最小，因此可利用此特性分離或除去兩性物質(zhì)。調(diào)整pH也可以改變某些物質(zhì)的電荷性質(zhì)，使之轉(zhuǎn)入液相，可以減少膜過濾的堵塞和膜污染。2.1.3調(diào)節(jié)發(fā)酵液pHpH直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離2.1.4加入助濾劑助濾劑可以作為膠體粒子的載體，均勻地分布于濾餅層中，相應(yīng)地改變?yōu)V餅結(jié)構(gòu)，降低濾餅的可壓縮性，從而減少過濾阻力。目前發(fā)酵工業(yè)中常用的助濾劑是硅藻土、珍珠巖粉、活性炭等，其中最常用的是硅藻土。使用方法有兩種：一是在過濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑，另一種是直接加入到發(fā)酵液中，也可兩種方法同時(shí)使用。2.1.4加入助濾劑助濾劑可以作為膠體粒子的載體，均勻地分布2.2發(fā)酵液的相對(duì)純化發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，對(duì)后提取步驟分離影響最大的是雜蛋白和高價(jià)無機(jī)離子等。雜蛋白去除方法：①通過加熱、大幅度改變pH，以及加乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑等方法使雜蛋白變性。②通過加入無機(jī)鹽使雜蛋白沉淀。在酸性溶液中，蛋白質(zhì)能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀。在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等形成沉淀。高價(jià)無機(jī)離子的去除方法：①為去除鈣離子，宜加入草酸。反應(yīng)生成的草酸鈣還能促蛋白質(zhì)凝固，提高濾液質(zhì)量。但草酸價(jià)格較貴，應(yīng)注意回收。②要除去鐵離子，可加入黃血鹽，與鐵離子形成普魯士藍(lán)沉淀。2.2發(fā)酵液的相對(duì)純化發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，對(duì)后提取步驟分離影內(nèi)容1.概述2.原料與預(yù)處理3.固液分離4.細(xì)胞破碎5.初步純化6.精細(xì)純化7.成品加工內(nèi)容1.概述發(fā)酵液或多或少存在懸浮固體，需要使用固液分離手段使清液和固態(tài)物質(zhì)得到很好的分離。常用的方法是過濾和離心分離。發(fā)酵液或多或少存在懸浮固體，需要使用固液分離手段使清液和固態(tài)3.1過濾分離技術(shù)過濾：在壓力（或真空）的情況下將懸浮液通過過濾介質(zhì)以達(dá)到固液分離的目的。微生物的發(fā)酵液大多屬于非牛頓型流體，濾渣是可壓縮性的。濾餅的質(zhì)量比阻γB：表示單位濾餅厚度的阻力系數(shù)，與濾餅的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。對(duì)于不可壓縮性濾餅，比阻值為常數(shù)。但對(duì)于可壓縮性濾餅，比阻γB是操作壓力差的函數(shù)，一般可用下式表示。式中，γ-不可壓縮濾渣的比阻；p-壓力差，Pa；m-壓縮性指數(shù)，一般取0.5-0.8，對(duì)不可壓縮性濾餅，m為0。γB=γ(△p)m(1)3.1過濾分離技術(shù)過濾：在壓力（或真空）的情況下將懸浮液通應(yīng)用較廣的過濾設(shè)備有壓力過濾、真空過濾和錯(cuò)流過濾三種。應(yīng)用較廣的過濾設(shè)備有壓力過濾、真空過濾和錯(cuò)流過濾三種。①壓力過濾最常見的壓力過濾裝置是板框過濾機(jī)。它的過濾介質(zhì)為濾布，當(dāng)懸浮液通過濾布時(shí)，固體顆粒被濾布阻隔而形成濾餅，濾餅達(dá)到一定厚度時(shí)起過濾作用，壓力來自于液壓泵。與其他設(shè)備相比，它的優(yōu)點(diǎn)是：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，過濾面積大；過濾的推動(dòng)力（壓力差）能大幅度調(diào)整，并能耐受較高的壓力差，因而固相含水分低，并能適應(yīng)不同過濾特性的發(fā)酵液的過濾；輔助設(shè)備少、價(jià)格低、動(dòng)力消耗少。主要缺點(diǎn)是：設(shè)備苯重、間歇操作、勞動(dòng)強(qiáng)度大、輔助時(shí)間多、生產(chǎn)效率低。①壓力過濾最常見的壓力過濾裝置是板框過濾機(jī)。②真空過濾最常見的真空過濾是真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)。工作部件是一個(gè)饒著水平軸轉(zhuǎn)動(dòng)的鼓，在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)維持一定的真空度，施加于轉(zhuǎn)鼓外邊的大氣壓力即為過濾的推動(dòng)力。圖5-2真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)工作原理示意圖②真空過濾最常見的真空過濾是真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)。圖5-2真空③錯(cuò)流過濾切向流過濾又稱錯(cuò)流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的技術(shù)。其操作特點(diǎn)是使懸俘液在過濾介質(zhì)表面作切向流動(dòng)，利用流動(dòng)的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走。當(dāng)移走固體的速率與固體的沉積速率相等時(shí)，過濾速率就近似恒定。目前切向流過濾的主要缺點(diǎn)是：切向流所產(chǎn)生的剪切作用可使蛋白質(zhì)產(chǎn)物失活。圖5-3泵循環(huán)式切向流過濾③錯(cuò)流過濾切向流過濾又稱錯(cuò)流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的3.2離心分離離心分離：在離心產(chǎn)生的重力場(chǎng)作用下使懸浮顆粒沉降下來的操作過程。3.2.1離心力場(chǎng)的基本特性分離因數(shù)（Fr）和沉降速度（vg）是離心力場(chǎng)的基本特性。離心機(jī)的分離因數(shù)：離心機(jī)在運(yùn)行過程中產(chǎn)生的離心加速度和重力加速度的比值。式中，r-離心機(jī)轉(zhuǎn)鼓半徑，cm；ω-轉(zhuǎn)鼓的角速度，s-1。Fr=rω2/g(2)ω=2πn/60(3)3.2離心分離離心分離：在離心產(chǎn)生的重力場(chǎng)作用下使懸浮顆粒沉分離因數(shù)越大，物料所受的離心力也越大，分離效果就好。

分離因數(shù)Fr與離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓半徑r和轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)速n的平方成正比，因此，提高轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)速比增大轉(zhuǎn)鼓半徑對(duì)分離因數(shù)的影響要大得多。分離因數(shù)的極限值取決于轉(zhuǎn)鼓材料的機(jī)械強(qiáng)度，一般超高速離心機(jī)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是小直徑、高轉(zhuǎn)速。分離因數(shù)越大，物料所受的離心力也越大，分離效果就好。3.2.2離心機(jī)的選擇需要根據(jù)發(fā)酵液的特性來選擇離心機(jī)。圖5-4根據(jù)固體顆粒的大小選擇離心機(jī)3.2.2離心機(jī)的選擇圖5-4根據(jù)固體顆粒的大小選擇離內(nèi)容1.概述2.原料與預(yù)處理3.固液分離4.細(xì)胞破碎5.初步純化6.精細(xì)純化7.成品加工內(nèi)容1.概述細(xì)胞破碎技術(shù)：是指利用外力破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物釋放出來的技術(shù)。選擇什么樣的破碎技術(shù)和設(shè)備實(shí)現(xiàn)有效的細(xì)胞破碎，首先要從細(xì)胞的種類，特別是細(xì)胞壁的類型及其堅(jiān)韌程度來考慮。第二是考慮目標(biāo)產(chǎn)品的性質(zhì)，如產(chǎn)物是否能承受剪切力、對(duì)酸堿和溫度的耐受力。第三是考慮破碎的規(guī)模、破碎方法和所花費(fèi)的資金等其他因素。細(xì)胞破碎技術(shù)：是指利用外力破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物最常用的檢測(cè)細(xì)胞破碎效果的方法是通過顯微鏡直接觀察，從中計(jì)算出細(xì)胞破碎率。①用革蘭氏染色劑進(jìn)行染色

破壁的酵母呈粉紅色，而未破壁的酵母呈藍(lán)紫色，分別計(jì)數(shù)，并采用相同的稀釋度用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)，計(jì)算破壁率。破壁率的計(jì)算公式如下式所示。

α=式中，α-破壁率，%；C-破壁前的細(xì)胞數(shù)；C'-破壁后的細(xì)胞數(shù)；n1-染色后呈紫色的細(xì)胞數(shù)；n2-染色后呈粉紅色的細(xì)胞數(shù)。最常用的檢測(cè)細(xì)胞破碎效果的方法是通過顯微鏡直接觀察，從中計(jì)算②用次甲基藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞存活率（因?yàn)榛罴?xì)胞中的酶可使染料還原）

取未經(jīng)滅酶的發(fā)酵液0.5ml，用9g/L的生理鹽水稀釋100倍后，用次甲基藍(lán)染色5min，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算出細(xì)胞的存活率。酵母破壁率=[1-(染色細(xì)胞總數(shù)/酵母細(xì)胞總數(shù))]*100%②用次甲基藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞存活率（因?yàn)榛罴?xì)胞中的酶可使染料還原4.1常用的細(xì)胞破碎方法按照作用方式的不同劃分，常用的細(xì)胞破碎方法可以分為兩類：機(jī)械類包括高速珠磨破碎法、高壓勻漿破碎法、超聲波破碎法等，非機(jī)械類包括化學(xué)滲透法，酶溶破碎法等。4.1常用的細(xì)胞破碎方法按照作用方式的不同劃分，常用的細(xì)胞4.1.1高速珠磨法原理：微生物細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑（通常是直徑<1mm的無鉛玻璃珠）在攪拌漿的作用下充分混合、珠子之間以及珠子和細(xì)胞之間的相互剪切、碰撞促進(jìn)細(xì)胞壁破裂，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。主要缺點(diǎn)：溫度升高較多，對(duì)熱敏感的成分易失活，細(xì)胞碎片較小，清除碎片困難，給后續(xù)操作增加難度。4.1.1高速珠磨法原理：微生物細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑（通4.1.2高壓勻漿破碎法原理：高壓勻漿法所用設(shè)備是高壓勻漿器，它由高壓泵和勻漿閥組成。細(xì)胞在一系列過程中經(jīng)歷了高速造成的剪切、碰撞以及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞的破碎。其實(shí)質(zhì)是將細(xì)胞壁和膜撕裂，靠胞內(nèi)的滲透壓使其內(nèi)含物全部釋放出來。除了較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌以及較小的革蘭氏陽性菌不適于用高壓勻漿器處理外，其他微生物細(xì)胞都可以用高壓勻漿法破碎。高壓勻漿法破碎微生物細(xì)胞速度快，胞內(nèi)產(chǎn)物損失小，設(shè)備容易放大。4.1.2高壓勻漿破碎法原理：高壓勻漿法所用設(shè)備是高壓勻漿器4.1.3超聲破碎原理：超聲波細(xì)胞破碎儀由超聲波發(fā)生器和換能器兩大部分組成。超聲波發(fā)生器將50Hz、220V電流變成20kHz電能供給換能器。換能器隨之做縱向機(jī)械振動(dòng)。振動(dòng)波通過浸入在生物溶液中的鈦合金變幅桿產(chǎn)生空化效應(yīng)，激發(fā)介質(zhì)里的生物顆粒劇烈振動(dòng)，引起的沖擊波和剪切力使細(xì)胞破碎。超聲波破碎法操作簡(jiǎn)便，可連續(xù)操作，最適合實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。超聲振蕩會(huì)使懸浮液溫度升高，因而使用受到限制。4.1.3超聲破碎原理：超聲波細(xì)胞破碎儀由超聲波發(fā)生器和換能4.2

化學(xué)法4.2.1酸熱法原理：利用鹽酸對(duì)細(xì)胞壁中的某些成分的水解作用，使原來的結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞壁變得疏松，同時(shí)經(jīng)沸水浴處理，造成細(xì)胞膨脹并加速水解，破壞胞壁結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞內(nèi)含物外泄釋放。如酵母和某些霉菌的細(xì)胞破碎可用酸熱法。4.2化學(xué)法4.2.1酸熱法4.2.2化學(xué)滲透法原理：使用某些有機(jī)溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑（如SDS、TritonX-100）、螯合劑（EDTA）等化學(xué)藥品改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來?；瘜W(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成，不同試劑對(duì)各種微生物細(xì)胞作用的部位和方式有所差異。①EDTA可用于處理革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌），對(duì)細(xì)胞的外層膜有破壞作用。②甲苯能溶解細(xì)胞膜的磷脂層。③TritonX-100對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，因此其作用部位主要是內(nèi)膜的雙磷脂層。根據(jù)各種試劑的不同作用機(jī)理，將幾種試劑合理地搭配使用能有效地提高胞內(nèi)物質(zhì)的釋放率。4.2.2化學(xué)滲透法原理：使用某些有機(jī)溶劑（如苯、甲苯）、4.3生物酶溶法主要是利用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等，細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物。溶酶同其他酶一樣具有高度的專一性，蛋白酶只能水解蛋白質(zhì)，葡聚糖酶只對(duì)葡聚糖起作用，因此利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的使用次序。在溶酶系統(tǒng)中，產(chǎn)物抑制是一種不容忽視的問題。4.3生物酶溶法主要是利用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解的方4.4細(xì)胞破碎技術(shù)的發(fā)展方向最佳的細(xì)胞破碎條件應(yīng)從高的產(chǎn)物釋放率、低的能耗和便于后續(xù)提取這三方面進(jìn)行權(quán)衡。主要表現(xiàn)在如下幾個(gè)方面：（1）多種破碎方法相結(jié)合（2）與上游過程相結(jié)合（3）與下游過程相結(jié)合4.4細(xì)胞破碎技術(shù)的發(fā)展方向最佳的細(xì)胞破碎條件應(yīng)從高的產(chǎn)物4.5包含體的處理包含體基本上是由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部分（50%以上）是克隆表達(dá)的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在一級(jí)結(jié)構(gòu)上正確的，但在立體構(gòu)型上卻是錯(cuò)誤的，因此沒有生物學(xué)活性。要分離出具有活性的蛋白質(zhì)，一般要經(jīng)歷下列步驟：破碎細(xì)胞→分離出包含體→溶解包含體→目標(biāo)產(chǎn)物的構(gòu)型復(fù)原。4.5包含體的處理包含體基本上是由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部分（①包含體的分離用溶菌酶或超聲波法處理基因工程菌，破碎細(xì)胞，離心取沉淀，得包含體。再用蔗糖溶液、尿素緩沖液或溫和的表面活性劑沖洗包含體，清除附在包含體上的雜蛋白、DNA、RNA和酶，得到較純的包含體。②包含體的溶解用弱變性劑尿素和表面活性劑十二烷基磺酸鈉溶解包含體，使蛋白質(zhì)肽鏈分離。加入還原劑二巰基蘇糖醇或GSH，使二硫鍵可逆地?cái)嗔?。此時(shí)重組蛋白呈現(xiàn)可溶解和單體肽鏈的狀態(tài)。③蛋白質(zhì)的復(fù)性變性蛋白經(jīng)初步純化濃縮以后，透析除去變性劑和還原劑。大部分蛋白質(zhì)即重新折疊，被空氣中的氧氧化，重建二硫鍵，恢復(fù)活性。①包含體的分離內(nèi)容1.概述2.原料與預(yù)處理3.固液分離4.細(xì)胞破碎5.初步純化6.精細(xì)純化7.成品加工內(nèi)容1.概述5.初步純化目的：把目的產(chǎn)物與大部分雜質(zhì)分離開來，使雜質(zhì)數(shù)量低于目的產(chǎn)物的數(shù)量。初步純化的單元操作有萃取、吸附、沉淀、膜分離等。5.初步純化目的：把目的產(chǎn)物與大部分雜質(zhì)分離開來，使雜質(zhì)數(shù)量5.1萃取萃取是利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相溶劑之間分配系數(shù)的不同而使得溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。在萃取操作中至少有一相為流體，一般稱該流體為萃取劑。以液體為萃取劑時(shí)，如果含有目標(biāo)產(chǎn)物的原料也為液體，則稱此操作為液液萃??；如果含有目標(biāo)產(chǎn)物的原料為固體，則稱此操作為液固萃取或浸取。以超臨界流體為萃取劑時(shí)，含有目標(biāo)產(chǎn)物的原料可以是液體，也可以是固體，稱此操作為超臨界流體萃取。5.1萃取萃取是利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相溶劑之間分配系數(shù)的5.1.1萃取的原理萃取以分配定律作為理論基礎(chǔ)，分配定律即溶質(zhì)的分配平衡規(guī)律。萃取速率:式中，c-料液相溶質(zhì)濃度，mol/L；c*-與萃取相中溶質(zhì)濃度呈相平衡的料液相溶質(zhì)濃度，mol/L；k-傳質(zhì)系數(shù)，m/s；α-以料液相體積為基準(zhǔn)的相間接觸比表面積，m-1。上相(2)下相(1)萃取相料液相時(shí)間t濃度c(a)(b)-dc/dt=kα(c-c*)圖5-5液液萃取(a)兩相接觸狀態(tài)示意；(b)萃取過程中料液相和萃取相溶質(zhì)濃度的變化5.1.1萃取的原理萃取以分配定律作為理論基礎(chǔ)，分配定律即溶5.1.2超臨界流體萃取5.1.2.1超臨界流體較低溫度下，不斷增加氣體壓力時(shí)，氣體會(huì)轉(zhuǎn)化成液體，當(dāng)溫度增高時(shí)，液體的體積增大。對(duì)于某一特定的物質(zhì)而言，總存在一個(gè)臨界溫度(Tc)和臨界壓力(Pc)，高于臨界溫度和臨界壓力后，物質(zhì)不會(huì)成為液體或氣體，這一點(diǎn)就是臨界點(diǎn)。在臨界點(diǎn)以上的范圍內(nèi)，物質(zhì)狀態(tài)處于氣體和液體之間，這個(gè)范圍之內(nèi)的流體成為超臨界流體（SF）。超臨界流體具有類似氣體的較強(qiáng)穿透力和類似于液體的較大密度和溶解度，具有良好的溶劑特性，對(duì)許多物質(zhì)有很強(qiáng)的溶解能力，可作為溶劑進(jìn)行萃取。超臨界流體對(duì)物質(zhì)進(jìn)行溶解和分離的過程就叫超臨界流體萃?。⊿FE）。CO2臨界溫度接近室溫，且無色、無毒、無味、不易燃、化學(xué)惰性、價(jià)廉、易制成高純度氣體，適合作為SF。5.1.2超臨界流體萃取5.1.2.1超臨界流體5.1.2.2超臨界流體萃取的原理超臨界流體萃取是利用超臨界流體的溶解能力與其密度的關(guān)系進(jìn)行的。在超臨界狀態(tài)下，超臨界流體具有很好的流動(dòng)性和滲透性，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小的成分依次萃取出來。當(dāng)然，對(duì)應(yīng)各壓力范圍所得到的萃取物不可能是單一的，但可以控制條件得到最佳比例的混合成分，然后借助減壓、升溫的方法使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質(zhì)則完全或基本析出，從而達(dá)到分離提純的目的，所以在超臨界流體萃取過程是由萃取和分離組合而成的。5.1.2.2超臨界流體萃取的原理超臨界流體萃取是利用超臨界5.1.3反膠團(tuán)萃取5.1.3.1反膠團(tuán)的構(gòu)造表面活性劑在水溶液中所形成的聚集體，親水性的極性端向外指向水溶液，疏水性的非極性“尾”向內(nèi)相互聚集在一起。表面活性劑在非極性溶劑中所形成的聚集體，疏水性的非極性尾部向外，指向非極性溶劑，而極性頭向內(nèi)。由于與在水相中形成的微膠團(tuán)方向相反，因而稱之為反膠團(tuán)。圖5-6表面活性劑的不同聚集體5.1.3反膠團(tuán)萃取5.1.3.1反膠團(tuán)的構(gòu)造圖5-6表面反膠團(tuán)萃取原理是從主體水相向溶解于有機(jī)溶劑相中納米級(jí)的、均一且穩(wěn)定的、分散的反膠團(tuán)微水相中的分配萃取。特點(diǎn)是表面活性劑能不斷包圍水相中的蛋白質(zhì)，形成反膠團(tuán)，并引導(dǎo)入有機(jī)相中，完成對(duì)蛋白質(zhì)的萃取和分離。在反膠團(tuán)中蛋白質(zhì)不與有機(jī)溶劑直接接觸，而是通過水化層與表面活性劑的極性頭接觸，從而避免了蛋白質(zhì)的變性、失活。圖5-7蛋白質(zhì)向反膠團(tuán)溶解的水殼模型反膠團(tuán)萃取原理圖5-7蛋白質(zhì)向反膠團(tuán)溶解的水殼模型反膠團(tuán)萃取不能用于萃取相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)如牛血清蛋白，最適宜于萃取相對(duì)分子量較小或中等的蛋白質(zhì)如-糜蛋白。在使用陰離子表面活性劑時(shí)，在萃取前應(yīng)調(diào)節(jié)水相的pH值比目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)pI值低2-4個(gè)單位，以增加蛋白質(zhì)分子的表面電荷，提高萃取效率。在使用陽離子表面活性劑時(shí)，應(yīng)調(diào)節(jié)水相的pH值高于蛋白質(zhì)的pI值，使蛋白質(zhì)凈電荷為負(fù)值。反膠團(tuán)萃取不能用于萃取相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)如牛血清蛋白，最5.2沉淀分離技術(shù)沉淀：物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)的溶解度降低，生成固體凝聚物的過程。5.2.1蛋白質(zhì)分子在溶液中的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)沉淀的屏障：①在水溶液中，蛋白質(zhì)分子周圍存在與蛋白質(zhì)分子緊密或疏松結(jié)合的水化層②蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥作用可根據(jù)各種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異性來改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度發(fā)生變化，從而出現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)溶解而雜質(zhì)沉淀，或者相反，達(dá)到用沉淀法分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的目的。5.2沉淀分離技術(shù)沉淀：物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)的溶解度降低，5.2.2蛋白質(zhì)沉淀分離方法5.2.2.1鹽析沉淀法在溶液中加入中性鹽，利用鹽離子與蛋白質(zhì)分子表面的帶相反電荷的極性基團(tuán)的互相吸引作用，中和蛋白質(zhì)分子表面的電荷。當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定的濃度時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的排斥力降到很小，于是它們很容易相互聚集，溶解度就會(huì)降到很低，形成沉淀顆粒，從溶液中析出。表面疏水基團(tuán)多的蛋白質(zhì)分子在較低的鹽濃度下就會(huì)析出，而表面親水基團(tuán)多的蛋白質(zhì)分子則需要較高的鹽濃度才能析出。工業(yè)上常用的中性鹽是硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大。5.2.2蛋白質(zhì)沉淀分離方法5.2.2.1鹽析沉淀法5.2.2.1.1影響鹽析的若干因素（1）蛋白質(zhì)濃度高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，但若蛋白濃度過高，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的共沉淀作用；在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，而共沉淀作用比較少。一般認(rèn)為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。（2）離子強(qiáng)度和類型一般說來，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。在進(jìn)行分離的時(shí)候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。（3）pH值一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小。5.2.2.1.1影響鹽析的若干因素（1）蛋白質(zhì)濃度5.2.2.1.2硫酸銨的使用硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對(duì)蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和，放置過夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結(jié)晶，100℃烘干后使用。另外，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（pH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需pH。硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況5.2.2.1.2硫酸銨的使用硫酸銨中常含有少量的重金屬離5.2.2.2有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因主要是有機(jī)溶劑具有脫水作用，其次有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。常用的有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇和丙酮。該法優(yōu)點(diǎn)是溶劑溶液蒸發(fā)除去，不會(huì)殘留在成品中，而且有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。該方法的缺點(diǎn)是易使蛋白質(zhì)變性失活，且有機(jī)溶劑易燃易爆，安全要求高。5.2.2.2有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因在實(shí)際操作時(shí)，應(yīng)注意：1）降低操作溫度能增加收率和減少蛋白質(zhì)的變性。2）所選擇的溶劑必須能與水互溶，而和蛋白質(zhì)不起化學(xué)反應(yīng)。3）蛋白質(zhì)的分子量越大，產(chǎn)生沉淀所需加入的有機(jī)溶劑量越少。4）沉淀的蛋白質(zhì)不能再溶解，就可能已經(jīng)變性。5）少量中性鹽的存在能形成鹽溶作用，增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑水溶液的溶解度，這就使沉淀蛋白質(zhì)所需的有機(jī)溶劑量增大。所以，由鹽析法制得的粗蛋白質(zhì)，用有機(jī)溶劑沉淀法進(jìn)一步精制時(shí)，先必須經(jīng)過透析。在實(shí)際操作時(shí)，應(yīng)注意：5.3吸附分離技術(shù)5.3.1吸附分離原理吸附：理論上講，任何兩相都可以形成界面，其中一相的物質(zhì)在另一相的表面所發(fā)生的密集行為。吸附分離法：通過吸附作用從液體或氣體中提取回收有用目標(biāo)產(chǎn)物的分離方法。吸附介質(zhì)：能夠?qū)⒅車渌肿泳奂侥骋晃镔|(zhì)表面上的物質(zhì)。根據(jù)吸附介質(zhì)的基本性質(zhì)，吸附力可分為物理吸附、化學(xué)吸附等。5.3吸附分離技術(shù)5.3.1吸附分離原理物理吸附：依靠吸附劑與溶質(zhì)之間的分子間力（即范德華力）進(jìn)行吸附的。溶質(zhì)是否在吸附劑上吸附或吸附溶質(zhì)量的多少主要取決于溶質(zhì)與吸附劑極性的相似性和溶劑的極性。吸附是可逆的，被吸附的溶質(zhì)可通過改變溫度、pH和鹽溶液等物理?xiàng)l件脫附?；瘜W(xué)吸附：吸附劑表面活性點(diǎn)與溶質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)結(jié)合、產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移或分子與表面共用電子對(duì)的現(xiàn)象?；瘜W(xué)吸附釋放大量的熱，高于物理吸附?；瘜W(xué)吸附一般為單分子層吸附，吸附穩(wěn)定，不易脫附。物理吸附：依靠吸附劑與溶質(zhì)之間的分子間力（即范德華力）進(jìn)行吸5.3.2吸附介質(zhì)的種類（1）活性炭

制備活性炭的材料來源不同，得到的活性炭種類也不一樣。一般有三類活性炭，即動(dòng)物炭、植物炭和礦物炭。動(dòng)物炭是用動(dòng)物骨骼為原料經(jīng)高溫炭化而成；植物炭是以木屑為原料，加一定的氯化鋅在700-800℃高溫加工而成，礦物炭是以煤粉為原料經(jīng)高溫處理而成?；钚蕴磕軐?duì)化合物產(chǎn)生吸附力主要是活性炭分子中的活性基團(tuán)與被分離物質(zhì)分子中的某些基團(tuán)產(chǎn)生范德華力形成的吸附作用。5.3.2吸附介質(zhì)的種類（1）活性炭（2）硅膠

硅膠是一種廣泛使用的極性吸附介質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，吸附量大。硅膠是以硅酸鹽為原料制成的。在硅膠的制備過程中，絮凝作用的快慢決定著硅膠表面積的大小，也就決定著硅膠吸附能力的大小。而絮凝作用的速度與酸化時(shí)的pH有密切關(guān)系。一般在pH3-4的條件下凝聚的硅膠比較疏松，每克硅膠產(chǎn)生的表面積大；在pH6的環(huán)境中凝聚的硅膠比較結(jié)實(shí)密集，每克硅膠產(chǎn)生的表面積小。硅膠的吸附活性決定于其含水量。當(dāng)含水量小于1%時(shí)，吸附活性最高；含水量大于20%時(shí)吸附活性最低。使用過的硅膠，其吸附量有明顯的下降，需要進(jìn)行再生處理。（2）硅膠（3）氧化鋁

氧化鋁是一種呈化學(xué)惰性且具有較高的吸附容量的吸附劑，主要是用于分離非極性化合物。吸附原理一般認(rèn)為是被分離的物質(zhì)與氧化鋁表面的一些羥基相互作用形成氫鍵，而鋁原子提供一個(gè)親電子中心，吸引電子供體的某些基團(tuán)，如-OH、-NH2等。氧化鋁的優(yōu)點(diǎn)是吸附容量大，分離效果好，尤其對(duì)于脂溶性的天然小分子，如醛、酮、醌類化合物的分離效果好，應(yīng)用廣泛，價(jià)格低廉。（3）氧化鋁（4）聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺屬于一類化學(xué)合成的極性吸附介質(zhì)，分子中的酰胺基與被分離物質(zhì)之間的羥基和羧基可以形成氫鍵。吸附能力的大小，取決于與被分離物質(zhì)分子中的羧酸、氨基酸等與聚丙烯酰胺分子中酰胺基形成氫鍵的強(qiáng)弱。在聚丙烯酰胺色譜的過程中，洗脫劑與被分離物質(zhì)在聚丙烯酰胺顆粒表面上競(jìng)爭(zhēng)性形成氫鍵，洗脫劑與聚丙烯酰胺形成氫鍵的能力比被分離物質(zhì)強(qiáng)。在洗脫過程中被分離物質(zhì)與聚丙烯酰胺形成氫鍵的能力不斷減弱，洗脫劑與聚丙烯酰胺形成氫鍵的能力不斷增強(qiáng)，最終將被分離物質(zhì)從聚丙烯酰胺介質(zhì)上洗脫下來。（4）聚丙烯酰胺5.3.3離子交換吸附離子交換吸附是基于離子交換劑上可電離的離子與溶液中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對(duì)溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。離子交換樹脂是一種不溶于酸、堿和有機(jī)溶劑的固態(tài)高分子化合物，它的化學(xué)穩(wěn)定性良好，且具有離子交換能力。其巨大的分子可以分成兩部分，即樹脂的骨架和活性離子，它在樹脂骨架中的進(jìn)進(jìn)出出就發(fā)生離子交換現(xiàn)象。高分子的惰性骨架和單分子的活性離子，帶有相反的電荷，而共處于離子交換樹脂中。5.3.3離子交換吸附離子交換吸附是基于離子交換劑上可電離5.4膜分離膜分離技術(shù)是指利用天然或人工合成的無機(jī)或有機(jī)薄膜,以外界能量或化學(xué)位差為推動(dòng)力,對(duì)雙組分或多組分溶質(zhì)和溶劑進(jìn)行分離、分級(jí)、提純和富集的方法。膜分離具有以下優(yōu)點(diǎn):①分離過程中不發(fā)生相的變化,能耗小;②在常溫下進(jìn)行,特別適用于熱敏感物質(zhì)的分離、分級(jí)、濃縮和富集;③應(yīng)用范圍廣,對(duì)無機(jī)物、有機(jī)物及生物制品都可適用;④設(shè)備簡(jiǎn)單,操作容易,制造方便。膜分離技術(shù)是人類最早應(yīng)用的分離技術(shù)之一，根據(jù)膜的孔徑大小可細(xì)分為透析、微濾、超濾、納濾、反滲透五種。5.4膜分離膜分離技術(shù)是指利用天然或人工合成的無機(jī)或有機(jī)薄5.4.1反滲透反滲透是基于滲透壓的作用而實(shí)現(xiàn)分離。當(dāng)在濃溶液一側(cè)加一外界壓力P,且此壓力大于濃溶液與稀溶液的滲透壓之差時(shí),溶劑就會(huì)向相反的方向轉(zhuǎn)移，這種操作稱為反滲透。反滲透膜孔徑為0.1-1nm，因此，反滲透法適用于1nm以下小分子的濃縮。圖5-8(a)滲透(b)滲透平衡(c)反滲透5.4.1反滲透反滲透是基于滲透壓的作用而實(shí)現(xiàn)分離。當(dāng)在濃溶5.4.2超濾與微濾超濾和微濾膜具有明顯的孔道結(jié)構(gòu)，是一種篩孔分離過程，即其中分子量較小的溶質(zhì)和水分透過膜，而分子量較大的溶質(zhì)被截留。兩者主要區(qū)別在于超濾膜的孔徑（0.001-0.05μm）較微濾膜?。?.05-10μm）。因而超濾法適用于分離或濃縮直徑1-50nm的生物大分子（如蛋白質(zhì)、病毒等）；微濾法適用于細(xì)胞、細(xì)菌和微粒子的分離，目標(biāo)物質(zhì)的大小范圍為0.01-10μm。5.4.2超濾與微濾超濾和微濾膜具有明顯的孔道結(jié)構(gòu)，是一種篩5.4.3透析分離透析膜一般是孔徑為5-10nm的親水膜，例如纖維素膜、聚酰胺膜等。一般制成管狀透析袋使用，將含有高分子溶質(zhì)的料液裝入透析袋中，封口后浸入到純水或緩沖液中，由于透析膜內(nèi)外的溶質(zhì)濃度不同，在濃度差的作用下，透析袋內(nèi)的小分子溶質(zhì)（如無機(jī)鹽）透向膜外，透析袋外部的水透向袋內(nèi)，這就是透析。溶質(zhì)以擴(kuò)散的形式移動(dòng)。在生物分離方面，主要用于生物大分子溶液的脫鹽。透析過程以濃度差為傳質(zhì)推動(dòng)力，膜的透過通量很小，因此不適于大規(guī)模生物分離過程，僅在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用較多。5.4.3透析分離透析膜一般是孔徑為5-10nm的親水膜，內(nèi)容1.概述2.原料與預(yù)處理3.固液分離4.細(xì)胞破碎5.初步純化6.精細(xì)純化7.成品加工內(nèi)容1.概述6.精細(xì)純化采用一些特殊的高新技術(shù)進(jìn)一步把雜質(zhì)與目的產(chǎn)物分離開來，包括層析、分子蒸餾等。6.精細(xì)純化采用一些特殊的高新技術(shù)進(jìn)一步把雜質(zhì)與目的產(chǎn)物分離6.1層析層析技術(shù)又叫色譜分離技術(shù)。是一種物理分離方法，利用多組分混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分能以不同程度分布在兩相中。其中一相是固定的，稱為固定相；另一相則流過此固定相，稱為流動(dòng)相。當(dāng)多組分混合物隨流動(dòng)相流動(dòng)時(shí)，由于各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別而以不同的速率移動(dòng)，使之分開。根據(jù)固定相在色譜分離系統(tǒng)中存在的形狀，色譜分離法可分為柱色譜法、平面色譜法等方法。與其他分離純化方法相比，色譜分離具有以下基本特點(diǎn)：分離效率高、應(yīng)用范圍廣、選擇性強(qiáng)、高靈敏度的在線檢測(cè)、快速分離、易于實(shí)現(xiàn)過程控制和自動(dòng)化操作。6.1層析層析技術(shù)又叫色譜分離技術(shù)。是一種物理分離方法，利6.1.1柱色譜中的常用術(shù)語①固定相和流動(dòng)相

固定相由色譜基質(zhì)組成。其基質(zhì)包括固體物質(zhì)和液體物質(zhì)，這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用。流動(dòng)相是在色譜過程中推動(dòng)固定相上的物質(zhì)向一定方向移動(dòng)的液體或氣體。在柱色譜時(shí)，流動(dòng)相又稱洗脫劑。在薄層色譜時(shí)流動(dòng)相又稱為展層劑。6.1.1柱色譜中的常用術(shù)語①固定相和流動(dòng)相VoViVt圖5-9色譜床的外水體積(Vo)、內(nèi)水體積(Vi)和總體積(Vt)②床體積(Vt)通常床體積是指膨脹后的基質(zhì)在色譜柱中占有的體積。是基質(zhì)的外水體積和內(nèi)水體積以及自身體積(Vg)的總和。即Vt=Vo+Vi+Vg式中，Vo指基質(zhì)顆粒之間體積的總和；Vi是指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和；Vg指基質(zhì)自身所具有的體積。微生物發(fā)酵工程課件③洗脫體積(Ve)：洗脫體積是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積。④膨脹度(WB)：在一定溶液中，單位質(zhì)量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積。⑤操作容量：在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，一般以每克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來表示。其數(shù)值大，表明基質(zhì)對(duì)某種成分的結(jié)合力越強(qiáng)；數(shù)值小，表明基質(zhì)對(duì)某種成分的結(jié)合力弱。⑥分配系數(shù)和遷移率：分配系數(shù)是指一組分在固定相與流動(dòng)相中含量的比值。常用K表示。遷移率是指一組分在相同時(shí)間內(nèi)，在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相移動(dòng)距離的比值，常用Rf表示。K值大，就表明規(guī)定的組分對(duì)固定相結(jié)合力大，遷移率小。反之則結(jié)合力小，遷移率大。不同物質(zhì)的分配系數(shù)和遷移率差異程度越大分離效果就越好。③洗脫體積(Ve)：洗脫體積是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫6.1.2吸附色譜吸附色譜：利用固定相介質(zhì)表面的活性基團(tuán)對(duì)不同溶質(zhì)分子發(fā)生吸附作用的強(qiáng)弱不同而進(jìn)行分離的方法。6.1.2.1吸附柱色譜的基本原理圖5-10吸附柱色譜原理1-吸附色譜柱；2-加入A、B混合樣品；3-洗脫時(shí)，A與B開始分離；4-A與B完全分離；5-先收集A物質(zhì)6.1.2吸附色譜吸附色譜：利用固定相介質(zhì)表面的活性基團(tuán)對(duì)6.1.2.2吸附介質(zhì)和洗脫條件的選擇吸附介質(zhì)的選擇一般要通過小樣預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定。值得注意的是，有時(shí)同一種吸附介質(zhì)由于其制備工藝和處理方法不同，其吸附能力有較大的差異。選擇溶劑和洗脫劑時(shí)主要考慮的因素是對(duì)樣品的溶解度和穩(wěn)定性以及對(duì)檢測(cè)器不敏感性。一種好的溶劑應(yīng)該對(duì)樣品有很好的溶解性，有利于吸附介質(zhì)對(duì)溶質(zhì)的吸附；而洗脫劑則對(duì)被吸附在吸附劑上的樣品有強(qiáng)的解吸附能力，被洗脫下的物質(zhì)具有較好的穩(wěn)定性，不發(fā)生聚合、沉淀、變性和相關(guān)的化學(xué)反應(yīng)；對(duì)光譜檢測(cè)器的波長不敏感、對(duì)檢測(cè)器的導(dǎo)電性不敏感、對(duì)pH檢測(cè)器的酸堿度不敏感等。6.1.2.2吸附介質(zhì)和洗脫條件的選擇吸附介質(zhì)的選擇一般要6.1.2.3常用吸附劑①活性炭

具有價(jià)格低廉、吸附力強(qiáng)、分離效果較好的特點(diǎn)。活性炭是非極性吸附劑，因此在水溶液中吸附力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中吸附力較弱。對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；對(duì)分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。發(fā)酵液的pH與活性炭的吸附效率有關(guān)，一般堿性抗生素在中性情況下吸附，在酸性條件下解吸；酸性抗生素在中性情況下吸附，堿性條件下解吸。6.1.2.3常用吸附劑①活性炭②大孔吸附樹脂

大孔吸附樹指是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)人工合成的聚合物吸附劑，是利用它和被吸附的分子（吸附質(zhì)）之間的范德華力進(jìn)行物理吸附的。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)有機(jī)物質(zhì)具有良好的選擇性；吸附樹脂的物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，機(jī)械強(qiáng)度好，經(jīng)久耐用；吸附樹脂品種多，可根據(jù)不同需要選擇不同品種；吸附樹脂吸附速度快，易解吸，易再生。主要缺點(diǎn)：價(jià)格較貴，吸附效果易受流速和溶質(zhì)濃度等因素影響。②大孔吸附樹脂6.1.3離子交換色譜離子交換色譜是基于離子交換劑上可電離的離子與溶液中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，按這些離子在交換劑中親和力的不同而被分離。6.1.3.1離子交換色譜的基本原理離子交換樹脂的分子可以分成兩部分：一部分是不能移動(dòng)的、多價(jià)的高分子基團(tuán)，構(gòu)成樹脂的骨架；另一部分是可移動(dòng)的離子，稱為活性離子，它在樹脂骨架中的進(jìn)進(jìn)出出就發(fā)生離子交換現(xiàn)象。從膠體化學(xué)觀點(diǎn)看，離子交換樹脂是一種均勻的彈性凝膠，活性離子是陽離子的稱為陽離子交換樹脂，活性分子是陰離子的稱為陰離子交換樹脂。離子交換劑一般是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。6.1.3離子交換色譜離子交換色譜是基于離子交換劑上可電離的離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換的方式進(jìn)行，或者借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對(duì)溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。反應(yīng)式如下：

RA+B+RB+A+離子交換劑的選擇性可用其反應(yīng)的平衡常數(shù)K表示。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換的方離子交換劑與各種水合離子的結(jié)合力與離子的電荷量成正比，而與水合離子半徑的平方成反比。所以，離子價(jià)數(shù)越高，結(jié)合力越大。在離子間電荷相同時(shí)，則離子的原子序數(shù)越高，水合離子半徑越小，結(jié)合力也越大。對(duì)于呈兩性離子的蛋白質(zhì)、酶類、多肽等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的物理化學(xué)性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。當(dāng)pH低于等電點(diǎn)時(shí)，它們能被陽離子交換劑吸附；反之，pH高于等電點(diǎn)時(shí)，它們能被陰離子交換劑吸附。離子交換劑與各種水合離子的結(jié)合力與離子的電荷量成正比，而與水6.1.3.2離子交換過程離子交換過程包括以下一系列擴(kuò)散和交換過程。1.外擴(kuò)散（進(jìn)）：

交換劑表面總存在薄薄一層靜止不動(dòng)的、具有濃度差的液膜，溶液中的溶質(zhì)離子必須擴(kuò)散通過這層液膜，才能達(dá)到離子交換樹脂表面。2.內(nèi)擴(kuò)散（進(jìn)）：

離子擴(kuò)散透過樹脂表面的半透膜，進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。3.交換：

來自溶液中的溶質(zhì)離子與樹脂上的離子發(fā)生交換作用。4.內(nèi)擴(kuò)散（出）：交換下來的離子通過樹脂內(nèi)部及表面的半透膜，擴(kuò)散離開樹脂相。5.外擴(kuò)散（出）：

內(nèi)擴(kuò)散出來的離子，經(jīng)過樹脂表面這層靜止不動(dòng)的液膜，擴(kuò)散進(jìn)入溶液。凡能影響擴(kuò)散速度的因素也就影響整個(gè)交換過程的速度：溫度、顆粒大小。6.1.3.2離子交換過程離子交換過程包括以下一系列擴(kuò)散和6.1.3.3離子交換色譜的操作（1）離子交換劑的處理

加水浸泡，待充分膨脹。加過量的水懸浮除去細(xì)顆粒，再改用酸堿浸泡，以便除去雜質(zhì)并使其帶上需要的反離子。酸堿處理的次序決定了離子交換劑攜帶反離子的類型。在每次用酸（或堿）處理后，均應(yīng)先用水洗滌至近中性，再用堿（或酸）處理。最后用水洗滌至中性，經(jīng)緩沖液平衡后即可使用或裝柱。6.1.3.3離子交換色譜的操作（1）離子交換劑的處理（2）離子交換劑的再生再生：使用過的離子交換劑，可采用一定的方法令其恢復(fù)原來的性狀的過程。去除雜質(zhì)的過程應(yīng)在不破壞離子交換劑的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，不影響其原有的交換容量的前提下進(jìn)行。經(jīng)長期使用的樹脂含有很多雜質(zhì)，欲將其除掉，可以先用沸水處理，然后用酸、堿處理。轉(zhuǎn)型是指離子交換劑由一種反離子轉(zhuǎn)到另一種反離子的過程。轉(zhuǎn)型后的離子交換劑則按使用要求帶上了一定種類的離子或基團(tuán)。（2）離子交換劑的再生（3）分離物質(zhì)的交換

使用離子交換劑的方法有兩種：一是柱色譜法，即將離子交換劑裝入色譜柱內(nèi)，讓溶液連續(xù)通過。該法交換效率高，應(yīng)用范圍廣。另一種是分批法，即使離子交換劑置入盛溶液的容器內(nèi)不斷緩慢攪拌。該法交換率低，不能連續(xù)進(jìn)行，但需要的設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易。一般認(rèn)為用于分離物質(zhì)的離子交換劑的總用量要依據(jù)其全部交換量和待吸附物質(zhì)的總量來計(jì)算。當(dāng)溶液含有各種雜質(zhì)時(shí)，必須考慮使交換容量留有充分的余地。（3）分離物質(zhì)的交換（4）物質(zhì)的洗脫與收集

在離子交換色譜過程中，常用梯度溶液進(jìn)行洗脫，而溶液的梯度則是由鹽濃度或酸堿度的變化形成的。制備梯度溶液的裝置是由兩個(gè)彼此相通的圓筒容器和一個(gè)攪拌器組成的。圖5-11產(chǎn)生梯度溶液的三種裝置及其各自形成的梯度變化曲線（4）物質(zhì)的洗脫與收集圖5-11產(chǎn)生梯度溶液的三種裝置6.1.4凝膠層析凝膠層析是利用生物大分子的分子量差異進(jìn)行的色譜分離的方法。凝膠色譜介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的色譜介質(zhì)。6.1.4凝膠層析凝膠層析是利用生物大分子的分子量差異進(jìn)行6.1.4.1凝膠色譜基本原理凝膠色譜介質(zhì)是一種在球體內(nèi)部具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠微粒，可以把大小不同的生物大分子按一定的順序進(jìn)行分離，也稱為分子篩。凝膠色譜參數(shù)之間的關(guān)系洗脫體積與Vo、Vi的關(guān)系式為Ve=Vo+KdViKd-樣品組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)

Kd=(Ve-Vo)/Vi式中，Ve為實(shí)驗(yàn)測(cè)得的實(shí)際洗脫體積；

Vo-可用不被凝膠滯留的大分子量組分測(cè)得的洗脫體積；

Vi-干膠的吸水量6.1.4.1凝膠色譜基本原理凝膠色譜介質(zhì)是一種在球體內(nèi)部具在凝膠柱色譜分離過程中，Kd可以有以下幾種情況。①Kd=0時(shí)，Ve=Vo。全排阻②Kd=1時(shí)，Ve=Vo+Vi。全滲透③0<Kd<1時(shí)，Ve=Vo+KdVi。表示凝膠顆粒內(nèi)部一部分空隙可以被不同大小的分子利用，可以有不同程度的滲入。④Kd>1時(shí)，表示凝膠具有一定的吸附作用，此時(shí)Ve>Vo+Vi。例如某些芳香族化合物的洗脫體積遠(yuǎn)超出理論計(jì)算的最大值，這些化合物的Kd值一般都是大于1的。在凝膠柱色譜分離過程中，Kd可以有以下幾種情況。6.1.4.2凝膠色譜介質(zhì)（1）葡聚糖凝膠

葡聚糖凝膠是由多聚葡聚糖通過與環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而合成的，是一類具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的珠狀凝膠顆粒。葡聚糖凝膠交聯(lián)的程度與凝膠顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑大小有直接關(guān)系，交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑越小，分離的分子量就越小。交聯(lián)的葡聚糖結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基，又具有很強(qiáng)的親水性，能迅速在水和電解質(zhì)溶液中溶脹，在色譜過程中非常容易與水溶性溶質(zhì)接觸。在酸性條件下合成的葡聚糖凝膠糖苷鍵容易被水解，在堿性環(huán)境中比較穩(wěn)定。常用稀堿溶液處理葡聚糖凝膠色譜介質(zhì)，以除去殘留在凝膠介質(zhì)上的變性蛋白和其他雜質(zhì)。SephadexG系列產(chǎn)品，英文字母G后面的阿拉伯?dāng)?shù)字，表示凝膠吸水量乘以10?！盙”后面的阿拉伯?dāng)?shù)字越大，表示交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，分子量分離范圍越大，凝膠的溶脹體積越大。6.1.4.2凝膠色譜介質(zhì)（1）葡聚糖凝膠（2）聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠是一種化學(xué)合成的凝膠，組成的基本單位是丙烯酰胺，交聯(lián)劑是N,N-亞甲基雙丙烯酰胺。通過控制丙烯酰胺濃度和N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的比例，就可以得到不同交聯(lián)度的聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯酰胺凝膠在酸性條件下不穩(wěn)定。因此，聚丙烯酰胺凝膠色譜應(yīng)當(dāng)盡量避免使用酸性較強(qiáng)的緩沖液。最常用的聚丙烯酰胺凝膠色譜介質(zhì)是Bio-Gel-P系列產(chǎn)品，在Bio-Gel-P系列產(chǎn)品中，“P”后面的阿拉伯?dāng)?shù)字越大，表示交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，分子量分離范圍越大，凝膠的溶脹體積越大。（2）聚丙烯酰胺凝膠（3）瓊脂糖凝膠色譜介質(zhì)

瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來的天然凝膠，由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖交替結(jié)合而成，交聯(lián)主要依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵如氫鍵來穩(wěn)定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠改變瓊脂糖濃度的方法來控制。瓊脂糖凝膠不帶電荷，吸附能力非常小，是凝膠色譜的一種良好的惰性支持物。瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠，其工作范圍遠(yuǎn)大于葡聚糖凝膠色譜介質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠色譜介質(zhì)，主要用于分離分子量為400000以上的物質(zhì)，例如核酸和病毒等。最常用的瓊脂糖凝膠色譜介質(zhì)是SepharoseB系列產(chǎn)品。在SepharoseB系列產(chǎn)品中，“B”前面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示瓊脂糖的百分含量，瓊脂糖的百分含量越高表示交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小，分子量分離范圍越小。（3）瓊脂糖凝膠色譜介質(zhì)6.1.4.3凝膠色譜技術(shù)的操作（1）凝膠色譜介質(zhì)的選擇與處理

根據(jù)分子量分離范圍選擇相應(yīng)型號(hào)的凝膠介質(zhì)，確定是組別分離還是組分分離。組別分離是指分子量之間相差很大的樣品；組分分離是指分子量之間相差較小的生物大分子。組別分離一般選用交聯(lián)度較大的凝膠色譜介質(zhì)，例如蛋白質(zhì)脫鹽可選用葡聚糖凝膠SephadexG-25。組分分離要根據(jù)被分離組分所預(yù)測(cè)的最大分子量的上限值和最小分子量的下限值的分離范圍來選擇合適的凝膠。如分離分子量在5000-60000之間的多種組分，可選用葡聚糖凝膠SephadexG-75。6.1.4.3凝膠色譜技術(shù)的操作（1）凝膠色譜介質(zhì)的選擇與凝膠使用前處理在欲使用的洗脫液中浸泡溶脹。為了縮短時(shí)間，多用“熱法”溶脹?！盁岱ā比苊涍€可以消毒，殺滅凝膠中污染的細(xì)菌，同時(shí)也排出了凝膠內(nèi)的氣泡。使用氣流浮選法或水力浮選法除去影響流速的過細(xì)顆粒。在凝膠溶脹和處理過程中，不能進(jìn)行劇烈的攪拌。凝膠使用前處理（2）色譜柱和流動(dòng)相的選擇

色譜柱的選擇，主要考慮被分離組分分子量的差異，選用相應(yīng)的柱長與柱內(nèi)徑之比的色譜柱。對(duì)于組別分離的色譜柱，由于被分離的組分分子量差別較大可采用短粗的色譜柱；對(duì)組分分級(jí)分離的色譜柱，用細(xì)長的色譜柱。（2）色譜柱和流動(dòng)相的選擇凝膠色譜所使用的緩沖溶液比較簡(jiǎn)單，一般只使用一種緩沖液。但是在選擇緩沖溶液時(shí)主要考慮三方面的因素?？紤]被分離物質(zhì)的穩(wěn)定性，包括緩沖液的pH、離子強(qiáng)度及保護(hù)劑等?？紤]凝膠介質(zhì)的穩(wěn)定性能，不與介質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、不變形、不降解。考慮分離物質(zhì)的后處理，被分離組分經(jīng)凝膠色譜分離后還需采用其他色譜方法進(jìn)行分離，最好選用與后續(xù)色譜方法相同的緩沖液。如果后處理是冷凍干燥，可選用易揮發(fā)性的溶液，如NH4HCO3、NH4OH等。凝膠色譜所使用的緩沖溶液比較簡(jiǎn)單，一般只使用一種緩（3）凝膠介質(zhì)的后處理

色譜柱在使用一段時(shí)間后必須做適當(dāng)?shù)奶幚?，除去凝膠表面的污染物。處理所用的溶液和溶液濃度略有不同，一般對(duì)交聯(lián)的葡聚糖凝膠類介質(zhì)可以用0.1mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合處理，聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠類介質(zhì)可以用0.5-1mol/LNaCl溶液處理。（3）凝膠介質(zhì)的后處理凝膠柱內(nèi)的色譜介質(zhì)一般浸泡在溶液中，容易長菌。為了避免微生物的生長，殘留在凝膠柱內(nèi)的磷酸鹽和有機(jī)物必須要洗凈，然后將色譜柱真空或低溫保存。防止微生物生長最常用的方法是在凝膠溶液中加入一定的抑菌劑，如0.02%疊氮鈉、0.01-0.02%三氯丁醇等。凝膠色譜介質(zhì)如果在較長時(shí)間不使用，可以將其干燥長期保存。使用過的凝膠色譜介質(zhì)，首先按一般的再生程序?qū)⒔橘|(zhì)再生處理、漂洗干凈，然后用乙醇從低濃度到高濃度逐級(jí)脫水（先后用30%、50%、70%、80%、95%無水乙醇、乙醚），脫水后的介質(zhì)在室溫下晾干，將乙醇（乙醚）揮發(fā)盡即可。凝膠柱內(nèi)的色譜介質(zhì)一般浸泡在溶液中，容易長菌。為了避免微生物內(nèi)容1.概述2.原料與預(yù)處理3.固液分離4.細(xì)胞破碎5.初步純化6.精細(xì)純化7.成品加工內(nèi)容1.概述7.1結(jié)晶技術(shù)結(jié)晶的目的就是為了獲得更純凈的固體的發(fā)酵產(chǎn)品。由于結(jié)晶過程具有高度選擇性，因此析出的晶體純度非常高。7.1.1結(jié)晶的基本原理晶體：許多性質(zhì)相同的粒子在空間有規(guī)律地排列成格子狀的固體。結(jié)晶的全過程應(yīng)包括形成過飽和溶液、晶核形成和晶體生長等三個(gè)階段。溶液達(dá)到過飽和后，過量的溶質(zhì)才會(huì)以固體態(tài)結(jié)晶出來。晶體的產(chǎn)生最初形成極細(xì)小的晶核，然后這些晶核再成長為一定大小形狀的晶體。7.1結(jié)晶技術(shù)結(jié)晶的目的就是為了獲得更純凈的固體的發(fā)酵產(chǎn)品。和過飽和曲線把溫度-濃度圖分成三個(gè)區(qū)域:飽和曲線穩(wěn)定區(qū)：不會(huì)發(fā)生結(jié)晶不穩(wěn)定區(qū)：結(jié)晶能自動(dòng)進(jìn)行介穩(wěn)區(qū)：在穩(wěn)定區(qū)與不穩(wěn)定區(qū)之間若在結(jié)晶過程中晶核的形成速率大于晶體的成長速率，則產(chǎn)一般晶中的晶體小而數(shù)目多；反之亦然。圖5-12飽和曲線與過飽和曲線和過飽和曲線把溫度-濃度圖分成三個(gè)區(qū)域:圖5-12飽和曲7.1.2工業(yè)發(fā)酵中常用的結(jié)晶方法結(jié)晶法優(yōu)點(diǎn)：成本較低、設(shè)備較簡(jiǎn)單、操作方便。結(jié)晶的首要條件是過飽和，創(chuàng)造過飽和條件在工業(yè)生產(chǎn)中常用的方法是將熱飽和溶液冷卻、添加晶種結(jié)晶、將部分溶劑蒸發(fā)結(jié)晶、添加有機(jī)溶劑結(jié)晶、鹽析結(jié)晶等。7.1.2工業(yè)發(fā)酵中常用的結(jié)晶方法結(jié)晶法優(yōu)點(diǎn)：成本較低、設(shè)7.2濃縮濃縮：將低溶質(zhì)濃度的溶液通過除去溶劑變?yōu)楦呷苜|(zhì)濃度的溶液。發(fā)酵工業(yè)中常用的濃縮方法有蒸發(fā)濃縮法、冷凍濃縮法、吸收濃縮法等。7.2濃縮濃縮：將低溶質(zhì)濃度的溶液通過除去溶劑變?yōu)楦呷苜|(zhì)濃7.2.1蒸發(fā)濃縮法

蒸發(fā)：使溶液中的溶劑在一定的溫度和壓力下加熱后汽化除去，從而提高溶液中的溶質(zhì)濃度。影響蒸發(fā)速率的因素①溫度②蒸發(fā)面積有關(guān)，液體表面積越大，單位時(shí)間內(nèi)汽化的分子越多，蒸發(fā)越快③蒸汽壓。當(dāng)液面上的溶劑蒸汽分子密度很小，處于不飽和的低壓狀態(tài)時(shí)，溶液中的溶劑分子就會(huì)不斷地汽化逸出，以維持其一定的飽和蒸汽壓。蒸發(fā)濃縮裝置常按照加熱、擴(kuò)大液面表面積、減壓和加速空氣流動(dòng)等因素而設(shè)計(jì)。對(duì)于熱敏性發(fā)酵產(chǎn)品的濃縮，常采用真空減壓蒸發(fā)、薄膜蒸發(fā)以及分子蒸餾等方法進(jìn)行。7.2.1蒸發(fā)濃縮法蒸發(fā)：使溶液中的溶劑在一定的溫度和壓7.2.1.1分子蒸餾原理：液體分子受熱會(huì)從液面逸出，而不同種類的分子在氣相中運(yùn)動(dòng)的平均自由程不同來達(dá)到分離的目的。分子蒸餾的原理是根據(jù)分子運(yùn)動(dòng)理論，液體混合物的分子受熱后運(yùn)動(dòng)會(huì)加劇，當(dāng)接受到足夠能量時(shí)，就會(huì)從液面逸出而成為氣相分子。隨著液面上方氣相分子的增加，有一部分氣體就會(huì)返回液體。在外界條件保持恒定情況下，最終會(huì)達(dá)到分子運(yùn)動(dòng)的動(dòng)態(tài)平衡。7.2.1.1分子蒸餾原理：液體分子受熱會(huì)從液面逸出，而不同分子運(yùn)動(dòng)的平均自由程與分子的有效直徑的平方成反比。此時(shí)如果在小分子能達(dá)到而大分子不能達(dá)到的距離上放一冷凝器，將小分子冷凝為液體，不斷從氣相中分離，平衡就被打破，液相混合物中的分子又會(huì)逸出成為氣相分子。只要時(shí)間足夠長，混合物就被分離提純了。主要結(jié)構(gòu)由加熱器、捕集器、高真空系統(tǒng)組成。

圖5-13分子蒸餾的原理分子運(yùn)動(dòng)的平均自由程與分子的有效直徑的平方成反比。此時(shí)如果在7.2.2冷凍濃縮法

原理：是利用水溶液在共晶點(diǎn)前，部分水分呈冰晶析出的原理，來提高提取液的濃度。冷凍的溫度越低，析出的冰晶越多，溶液的濃度也愈高。提取液的濃度要求，可由析出的冰晶數(shù)量（即去水量）來計(jì)算得出百分濃度。冷凍濃縮系統(tǒng)可分為冷卻過程、冰結(jié)晶生成與長大的結(jié)晶過程及冰和濃縮液的分離過程。圖5-14冷凍濃縮過程7.2.2冷凍濃縮法原理：是利用水溶液在共晶點(diǎn)前，部分水分7.3干燥干燥的主要目的是除去發(fā)酵產(chǎn)品中的水分，使發(fā)酵產(chǎn)品能夠長期保存而不變質(zhì)，同時(shí)減少發(fā)酵產(chǎn)品的體積和質(zhì)量，便于包裝和運(yùn)輸。根據(jù)水分在固體中的分布情況，可分為表面水分、毛細(xì)管水分和被膜所包圍的水分等三種。表面水分不與物料結(jié)合而是附著于固體表面，蒸發(fā)時(shí)完全暴露于外界空氣中，干燥最快、最均勻。毛細(xì)管水分是一種結(jié)合水分，存在于固體極細(xì)孔隙的毛細(xì)管中，水分子逸出比較困難，蒸發(fā)時(shí)間長并需較高溫度。膜包圍的水分，需經(jīng)緩慢擴(kuò)散于胞外才能蒸發(fā)，最難除去。目前，工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)較常用的干燥方法有三種：對(duì)流加熱干燥法、接觸加熱干燥法和真空冷凍干燥法。7.3干燥干燥的主要目的是除去發(fā)酵產(chǎn)品中的水分，使發(fā)酵產(chǎn)品7.3.1對(duì)流加熱干燥法空氣通過加熱器后變?yōu)闊峥諝?，將熱量帶給干燥器并傳給物料。這種方法利用對(duì)流傳熱方式向濕物料供熱，使物料中的水分汽化，形成的水汽同時(shí)被空氣帶走。該法在工業(yè)發(fā)酵中獲得廣泛使用，常用的有氣流干燥、沸騰干燥和噴霧干燥等。（1）氣流干燥：利用熱的空氣與粉狀或粒狀的濕物料接觸，使水分迅速汽化而獲得干燥物料的方法。干燥所需的時(shí)間很短，氣流干燥的時(shí)間一般為1-5s。7.3.1對(duì)流加熱干燥法空氣通過加熱器后變?yōu)闊峥諝猓瑢崃浚?）沸騰干燥沸騰干燥：利用熱的空氣流使孔板上的粉狀狀物料呈流化沸騰狀態(tài)，使水分迅速汽化達(dá)到干燥的目的。干燥時(shí)，使氣流速率與顆粒的沉降速率相等，脫水后的顆粒則浮動(dòng)在上層，由溢流裝置流出干燥顆粒產(chǎn)品，這種干燥裝置可以連續(xù)進(jìn)料出料。沸騰床：氣固、氣液、液固相溶液系統(tǒng)中，當(dāng)重量較小的一相（氣相或液體）以一定的速率自下而上通過重量較大的相層（固體顆?；蛞后w）時(shí)，即形成沸騰床。在沸騰中固體顆粒或液體都實(shí)現(xiàn)脈動(dòng)或湍動(dòng)，使水分迅速汽化揮發(fā)溢出，使固體物料獲得干燥。沸騰干燥的時(shí)間稍長，適用于顆粒物料的干燥。（2）沸騰干燥（3）噴霧干燥

噴霧干燥原理是利用不同的噴霧器，將懸浮液或黏滯的液體噴成霧狀，使其在干燥室中與熱空氣接觸，由于物料呈微粒狀，表面積大，蒸發(fā)面積大，微粒中水分急速蒸發(fā)，在幾秒或幾十秒鐘內(nèi)獲得干燥，干燥后的粉末狀固體則沉降于干燥室底部，由卸料器排出而成為產(chǎn)品。噴霧干燥最大的特點(diǎn)是干燥速率快、干燥時(shí)間短、產(chǎn)品質(zhì)量高，整個(gè)噴霧干燥過程進(jìn)行得非常迅速。（3）噴霧干燥7.3.2接觸加熱干燥法接觸加熱干燥法：用某種加熱面與物料直接接觸，將熱量傳給物料，使其中水分汽化。在工業(yè)發(fā)酵中也較普遍使用，例如箱式干燥和真空干燥等。7.3.2接觸加熱干燥法接觸加熱干燥法：用某種加熱面與物料7.3.3真空冷凍干燥法真空冷凍干燥：先將濕物料凍結(jié)到共晶點(diǎn)溫度以下，使水分變成固態(tài)的冰，然后在適當(dāng)?shù)臏囟群驼婵斩认?，使冰升華為水蒸汽，再用真空系統(tǒng)的捕水器將水蒸汽冷凝，從而獲得干燥制品的技術(shù)整個(gè)過程分為三個(gè)階段：①預(yù)凍階段：將物料中游離態(tài)的水凍結(jié)成冰，為干燥階段作準(zhǔn)備；②升華干燥階段：將物料中游離態(tài)水的水升華出來；③解析干燥階段：將未能干燥的約10%的結(jié)合水升華出物料。此法適宜于具有生理活性的生物大分子和酶制劑、維生素及抗生素等熱敏發(fā)酵產(chǎn)品的干燥。7.3.3真空冷凍干燥法真空冷凍干燥：先將濕物料凍結(jié)到共晶圖5-15水的三相點(diǎn)示意圖圖5-15水的三相點(diǎn)示意圖第五章發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制第五章發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制內(nèi)容1.概述2.發(fā)酵液的預(yù)處理3.固液分離4.細(xì)胞破碎5.初步純化6.精細(xì)純化7.成品加工內(nèi)容1.概述1.概述發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制是發(fā)酵工程不可分割的重要組成部分:獲得高品質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)品；提取與精制技術(shù)的進(jìn)步及工藝優(yōu)化可以對(duì)發(fā)酵工程上游提出新的技術(shù)及工藝改進(jìn)要求。1.概述發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制是發(fā)酵工程不可分割的重要組成整個(gè)下游提取精制加工過程應(yīng)遵循如下原則：快速操作低溫環(huán)境溫和條件盡可能小的剪切作用和防止污染對(duì)于基因工程產(chǎn)品，還應(yīng)注意生物安全。整個(gè)下游提取精制加工過程應(yīng)遵循如下原則：1.1提取與精制過程的一般工藝流程圖5-1目的產(chǎn)物提取與精制過程的一般工藝流程1.1提取與精制過程的一般工藝流程圖5-1目的產(chǎn)物提取與整個(gè)分離路線一般可分為以下五個(gè)主要步驟：預(yù)處理、固液分離、初步純化、精細(xì)純化、成品加工。整個(gè)分離路線一般可分為以下五個(gè)主要步驟：預(yù)處理、固液分離、初預(yù)處理：采用加熱、調(diào)整pH、絮凝等措施和單元操作改變發(fā)酵液的理化性質(zhì)，為固液分離作準(zhǔn)備。固液分離：采用珠磨、勻漿、酶溶、過濾、離心等單元操作除去固相，獲得包含目的產(chǎn)物的液相，供進(jìn)一步分離純化用。初步純化：采用萃取、吸附、沉淀、離心等單元操作，將目的成分與大部分雜質(zhì)分離開來。精細(xì)純化：采用層析、電泳、分子蒸餾等單元操作，將目的成分與雜質(zhì)進(jìn)一步分離，使產(chǎn)物達(dá)到預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。成品加工：采用結(jié)晶、濃縮、干燥等單元操作，將目的產(chǎn)物加工成適應(yīng)市場(chǎng)需要的商品。預(yù)處理：采用加熱、調(diào)整pH、絮凝等措施和單元操作改變發(fā)酵液的1.2發(fā)酵產(chǎn)物提取精制方法的優(yōu)化與工藝設(shè)計(jì)目標(biāo)：產(chǎn)率高、品質(zhì)優(yōu)、成本低、操作簡(jiǎn)便、無環(huán)境污染。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的基本原則：采用的分離純化步驟盡可能少，應(yīng)用單元操作的次序和工藝設(shè)計(jì)要合理。在純化方法的選擇和設(shè)計(jì)的過程中，應(yīng)注意充分總結(jié)并參考前人的大量實(shí)踐結(jié)果。在初步選定各個(gè)單元操作方法之后，確定各個(gè)單元操作的先后次序。一般來說，收率高、純度稍低的方法在前，純度高的方法在后。1.2發(fā)酵產(chǎn)物提取精制方法的優(yōu)化與工藝設(shè)計(jì)目標(biāo)：產(chǎn)率高、品內(nèi)容1.概述2.原料與預(yù)處理3.固液分離4.細(xì)胞破碎5.初步純化6.精細(xì)純化7.成品加工內(nèi)容1.概述發(fā)酵液的特性：①發(fā)酵產(chǎn)物濃度低，處理體積大。②微生物細(xì)胞的顆粒小，相對(duì)密度與液相相差不大。③細(xì)胞含水量大，可壓縮性大，一經(jīng)壓縮就會(huì)變形。④液相黏度大，容易吸附在濾布上。⑤產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定。發(fā)酵液的特性：2.1改變發(fā)酵培養(yǎng)物的過濾特性改變發(fā)酵培養(yǎng)物過濾特性的方法：降低發(fā)酵培養(yǎng)物的黏度采用添加絮凝劑調(diào)整發(fā)酵液培養(yǎng)物pH2.1改變發(fā)酵培養(yǎng)物的過濾特性改變發(fā)酵培養(yǎng)物過濾特性的方法2.1.1降低液體黏度濾液通過濾餅的速率與液體的黏度成反比，因此降低液體黏度可以提高過濾效率。（1）加水稀釋法：能降低液體黏度，但會(huì)增加發(fā)酵液的體積，加大后續(xù)過程的處理量。采用此法時(shí)要慎重考慮。（2）加熱升溫法：可以有效降低液體黏度，提高過濾效率。但加熱溫度和時(shí)間必須控制在不影響目的產(chǎn)物活性的范圍內(nèi)，而且要防止加熱導(dǎo)致的細(xì)胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，增加發(fā)酵液的復(fù)雜性和隨后的產(chǎn)物分離純化。（3）酶解法發(fā)酵液中如含有多糖類物質(zhì)，則可用酶將它們降解成寡糖或單糖，以提高過濾效率。2.1.1降低液體黏度濾液通過濾餅的速率與液體的黏度成反比2.1.2

凝聚與絮凝通過有效地改變菌體細(xì)胞和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使其凝聚成較大的顆粒，便于過濾。（1）凝聚：在中性鹽的作用下，由于膠體粒子之間雙電子層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定出現(xiàn)聚集的現(xiàn)象。發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷。在生理pH下，發(fā)酵液中的菌體或蛋白質(zhì)常常帶有負(fù)電荷，由于靜電吸引作用，在界面上形成了雙電層，這種雙電層的結(jié)構(gòu)使膠粒間不容易聚集而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)。向膠體懸液中加入某種電解質(zhì)，在電解質(zhì)中異電離子的作用下，膠粒的雙電層電位降低，使膠體體系不穩(wěn)定，從而相互碰撞而產(chǎn)生凝聚。常用的凝聚電解質(zhì)有硫酸鋁，氯化鋁、氧化鐵等2.1.2凝聚與絮凝通過有效地改變菌體細(xì)胞和蛋白質(zhì)等膠體粒（2）絮凝：是指在某些高分子絮凝劑存在的情況下，基于架橋作用，使膠粒形成絮凝團(tuán)的過程。絮凝劑是一種水溶性的高分子聚合物，具有長鏈結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有相當(dāng)多的活性官能團(tuán)，通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，能強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。當(dāng)一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上產(chǎn)生架橋連接時(shí)，就形成了較大的絮團(tuán)，從而產(chǎn)生絮凝作用。發(fā)酵工業(yè)適宜的絮凝劑包括：有機(jī)高分子類如聚丙烯酰胺類衍生物，無機(jī)高分子聚合物絮凝劑如聚合鋁鹽，以及天然有機(jī)高分子絮凝劑如海藻酸類、明膠、幾丁質(zhì)等。（2）絮凝：是指在某些高分子絮凝劑存在的情況下，基于架橋作用（3）混凝：同時(shí)包括凝聚和絮凝作用的過程。加入電解質(zhì)，使懸浮離子間的雙電層電位降低，脫穩(wěn)，凝聚成微粒，然后再加入非離子型和陰離子型高分子絮凝劑凝聚成較大的顆粒，以提高絮凝效果。（3）混凝：同時(shí)包括凝聚和絮凝作用的過程。2.1.3調(diào)節(jié)發(fā)酵液pHpH直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)。對(duì)于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在等電點(diǎn)下，溶解度最小，因此可利用此特性分離或除去兩性物質(zhì)。調(diào)整pH也可以改變某些物質(zhì)的電荷性質(zhì)，使之轉(zhuǎn)入液相，可以減少膜過濾的堵塞和膜污染。2.1.3調(diào)節(jié)發(fā)酵液pHpH直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離2.1.4加入助濾劑助濾劑可以作為膠體粒子的載體，均勻地分布于濾餅層中，相應(yīng)地改變?yōu)V餅結(jié)構(gòu)，降低濾餅的可壓縮性，從而減少過濾阻力。目前發(fā)酵工業(yè)中常用的助濾劑是硅藻土、珍珠巖粉、活性炭等，其中最常用的是硅藻土。使用方法有兩種：一是在過濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑，另一種是直接加入到發(fā)酵液中，也可兩種方法同時(shí)使用。2.1.4加入助濾劑助濾劑可以作為膠體粒子的載體，均勻地分布2.2發(fā)酵液的相對(duì)純化發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，對(duì)后提取步驟分離影響最大的是雜蛋白和高價(jià)無機(jī)離子等。雜蛋白去除方法：①通過加熱、大幅度改變pH，以及加乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑等方法使雜蛋白變性。②通過加入無機(jī)鹽使雜蛋白沉淀。在酸性溶液中，蛋白質(zhì)能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀。在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等形成沉淀。高價(jià)無機(jī)離子的去除方法：①為去除鈣離子，宜加入草酸。反應(yīng)生成的草酸鈣還能促蛋白質(zhì)凝固，提高濾液質(zhì)量。但草酸價(jià)格較貴，應(yīng)注意回收。②要除去鐵離子，可加入黃血鹽，與鐵離子形成普魯士藍(lán)沉淀。2.2發(fā)酵液的相對(duì)純化發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，對(duì)后提取步驟分離影內(nèi)容1.概述2.原料與預(yù)處理3.固液分離4.細(xì)胞破碎5.初步純化6.精細(xì)純化7.成品加工內(nèi)容1.概述發(fā)酵液或多或少存在懸浮固體，需要使用固液分離手段使清液和固態(tài)物質(zhì)得到很好的分離。常用的方法是過濾和離心分離。發(fā)酵液或多或少存在懸浮固體，需要使用固液分離手段使清液和固態(tài)3.1過濾分離技術(shù)過濾：在壓力（或真空）的情況下將懸浮液通過過濾介質(zhì)以達(dá)到固液分離的目的。微生物的發(fā)酵液大多屬于非牛頓型流體，濾渣是可壓縮性的。濾餅的質(zhì)量比阻γB：表示單位濾餅厚度的阻力系數(shù)，與濾餅的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。對(duì)于不可壓縮性濾餅，比阻值為常數(shù)。但對(duì)于可壓縮性濾餅，比阻γB是操作壓力差的函數(shù)，一般可用下式表示。式中，γ-不可壓縮濾渣的比阻；p-壓力差，Pa；m-壓縮性指數(shù)，一般取0.5-0.8，對(duì)不可壓縮性濾餅，m為0。γB=γ(△p)m(1)3.1過濾分離技術(shù)過濾：在壓力（或真空）的情況下將懸浮液通應(yīng)用較廣的過濾設(shè)備有壓力過濾、真空過濾和錯(cuò)流過濾三種