馬昌杯 第16章 RNA的生物合成 2014-11-26課件

1第十六章RNA的生物合成（轉(zhuǎn)錄）RNABiosynthesis(Transcription)2中南大學生命科學學院生物化學系馬昌杯35吉爾伯特是“RNA世界”一詞的提出者。此外，他也創(chuàng)造了外顯子與內(nèi)含子兩個名詞，來區(qū)分mRNA分子中的兩個部分

轉(zhuǎn)錄（transcription）

生物體以DNA為模板合成RNA的過程

。

轉(zhuǎn)錄RNADNA

6逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成DNA的過程。都是酶促的核苷酸聚合過程都以DNA為模板都需依賴DNA的聚合酶聚合過程都是核苷酸之間生成磷酸二酯鍵都從5’至3’方向延伸聚核苷酸鏈都遵從堿基配對規(guī)律轉(zhuǎn)錄與復制的相似點7復制轉(zhuǎn)錄模板兩股鏈均復制模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對稱轉(zhuǎn)錄）原料dNTPNTP酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代雙鏈DNA(半保留復制）mRNA，tRNA,rRNA等配對A-T、G-CA-U、G-C、T-A引物需要不要轉(zhuǎn)錄和復制的區(qū)別8一、原核生物轉(zhuǎn)錄的模板DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)。

DNA雙鏈中按堿基配對規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(templatestrand)，也稱作有意義鏈或Watson鏈。相對的另一股單鏈是編碼鏈(codingstrand)，也稱為反義鏈或Crick鏈。105335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)

在DNA分子雙鏈上，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；模板鏈并非總是在同一單鏈上。12重點DNA聚合酶在啟動DNA鏈延長時需要RNA引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接啟動RNA鏈的延長。14

(NMP)n+NTP→(NMP)n+1+PPi（二）RNA聚合酶由多個亞基組成

大腸桿菌（E.coli）RNA聚合酶：4種亞基、、’、組成的五聚體蛋白質(zhì)，分子量480kD。

亞基分子量亞基數(shù)目功能

36512

2決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄150618

1催化聚合反應(yīng)’155613

1結(jié)合DNA模板，雙螺旋解鏈70263

1辨認起始點，結(jié)合啟動子15核心酶（coreenzyme）：*2’

能獨立催化模板指導的RNA合成，在轉(zhuǎn)錄延長全過程中均起作用全酶（holoenzyme）：*2’

，即亞基+核心酶

亞基的功能是辨認轉(zhuǎn)錄起始點，細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄起始需要全酶Acompleteenzymeconsistingtheapoenzymeportionplusthecofactorcomponent16Holoenzyme：

RNA聚合酶全酶及核心酶電泳圖譜有證據(jù)表明，大腸桿菌RNA聚合酶還有第五個亞基（ω亞基）的存在，但功能不詳。17RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合1820類風濕性關(guān)節(jié)炎

1959NobelPrizewinnerinPhysiologyorMedicineDNApolyArthurKornberg1918-2007RNApolySeveroOchoa1905-199321轉(zhuǎn)錄是不連續(xù)、分區(qū)段進行的；原核生物一個轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個轉(zhuǎn)錄單位，稱為操縱子(operon)，包括若干個結(jié)構(gòu)基因及其上游(upstream)的調(diào)控序列。

5335結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列RNA-polRNA聚合酶結(jié)合模板DNA的部位，稱為啟動子(promoter)。三、RNA聚合酶結(jié)合到DNA的啟動子上啟動轉(zhuǎn)錄23RNA聚合酶保護法242627282.DNA雙鏈打開，形成開放轉(zhuǎn)錄復合體(opentranscriptioncomplex)；1.RNApol識別并結(jié)合啟動子，形成閉合轉(zhuǎn)錄復合體(closedtranscriptioncomplex)；RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3轉(zhuǎn)錄起始復合物:30一、轉(zhuǎn)錄起始需要RNA聚合酶全酶轉(zhuǎn)錄起始過程：3.RNA

pol催化生成第一個磷酸二酯鍵（GTP，ATP）：5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi31RNApol(2)-DNA-pppG/ApN-OH3轉(zhuǎn)錄起始復合物：二、RNApol核心酶獨立延長RNA鏈1.第一個磷酸二酯鍵生成后，σ亞基即從轉(zhuǎn)錄起始復合物上脫落，并離開啟動子，進入延長階段。

2.RNApol核心酶留在DNA模板上，并沿DNA鏈不斷前移，催化RNA鏈的延長。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi32RNA-pol（核心酶）

····DNA

····RNA33轉(zhuǎn)錄延長特點：核心酶負責延長反應(yīng)；5’向3’延長；酶沿著模板鏈的3’端向5’方向前進；存在8bp的RNA-DNA雜合雙鏈；模板DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)隨著核心酶的移動發(fā)生解鏈和再復合的動態(tài)變化3453DNA核糖體RNARNA聚合酶在同一DNA模板上，有多個轉(zhuǎn)錄同時在進行；mRNA鏈上結(jié)合多個核糖體（轉(zhuǎn)錄尚未完成，翻譯已在進行）轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象：35三、原核生物的轉(zhuǎn)錄延長與蛋白質(zhì)的翻譯同時進行E.coli的轉(zhuǎn)錄起始和延長

36依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止非依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止四、原核生物轉(zhuǎn)錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復合物上脫落下來。分類371、依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止

ρ因子是rho基因的產(chǎn)物，廣泛存在于原核和真核細胞中，由6個亞基組成，結(jié)合在新生的RNA鏈上，由5’端向3’端的方向移動。協(xié)助RNA聚合酶識別新生RNA鏈上的終止信號，停止轉(zhuǎn)錄ρ因子有ATP酶的活性和解螺旋酶的活性38Rho因子與RNA結(jié)合后，Rho因子和RNA聚合酶發(fā)生構(gòu)象變化，聚合終止；ATP酶及解螺旋酶使DNA/RNA雜化鏈拆離，利于產(chǎn)物從轉(zhuǎn)錄復合物中釋放。39Rho因子結(jié)合RNARho因子作用原理402、非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止DNA模板上靠近終止部位，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’－末端常有多個連續(xù)的U，其上游的一段特殊堿基序列又可形成鼓槌狀的莖環(huán)或發(fā)夾形式的二級結(jié)構(gòu)。41莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機理5′pppG5335RNA-pol②RNA產(chǎn)物3’端往往形成特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使RNA聚合酶變構(gòu)，阻礙RNA聚合酶前移，轉(zhuǎn)錄停頓。③轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中有密集的G-C配對，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使得RNA/DNA雜化鏈更不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)錄復合物趨于解體。①轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’-末端發(fā)現(xiàn)多個連續(xù)的U，所有堿基配對中，rU:dA最不穩(wěn)定。42真核生物RNA的生物合成RNABiosynthesisinEukaryote

第三節(jié)43一、真核生物有三種DNA依賴的RNA聚合酶44環(huán)八肽毒素種類IIIIII轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物rRNA的前體45SrRNAmRNA前體hnRNA,miRNA5SrRNA,tRNA,snRNA對鵝膏蕈堿的反應(yīng)耐受敏感高濃度下敏感細胞內(nèi)定位核仁核內(nèi)核內(nèi)三種真核RNA聚合酶都由兩個不同的大亞基和12-15個小亞基構(gòu)成45RNA聚合酶Ⅱ最大亞基（RBP1）的羧基末端有一段共有序列為Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser

的重復片段序列，稱為CTD，是該酶起始RNA轉(zhuǎn)錄所必需的。轉(zhuǎn)錄起始階段會出現(xiàn)CTD中Ser（絲氨酸）、Tyr(酪氨酸）及Thr（蘇氨酸）的磷酸化。羧基末端結(jié)構(gòu)域(Carboxyl-terminaldomain,CTD)46Science,2001,186347二、轉(zhuǎn)錄因子在真核生物轉(zhuǎn)錄起始中具有重要作用真核生物的基因轉(zhuǎn)錄過程：起始階段、延長階段、轉(zhuǎn)錄終止；顯著不同的是，起始和延長過程都需要眾多相關(guān)的蛋白質(zhì)因子參與，這些因子被稱為轉(zhuǎn)錄因子或反式作用因子。481、轉(zhuǎn)錄前起始復合體的形成不同物種、不同細胞或不同的基因，轉(zhuǎn)錄起始點上游都有不同的特異DNA序列，包括啟動子、增強子等，統(tǒng)稱為順式作用元件(cis-actingelement)。49增強子是能夠結(jié)合特異基因調(diào)節(jié)蛋白，促進鄰近或遠隔特定基因表達的DNA序列。50能直接或間接識別和結(jié)合啟動子及其上游調(diào)節(jié)序列等順式作用原件的蛋白質(zhì)屬于轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)，其中直接或間接結(jié)合RNA聚合酶，為轉(zhuǎn)錄起始前復合體裝配所必需的，又稱為通用轉(zhuǎn)錄因子或基本轉(zhuǎn)錄因子。51轉(zhuǎn)錄因子參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ的作用

52轉(zhuǎn)錄前起始復合體轉(zhuǎn)錄起始時，真核生物RNApol不直接識別和結(jié)合模板的起始區(qū)，而是依靠轉(zhuǎn)錄因子識別并結(jié)合起始序列，生成轉(zhuǎn)錄前起始復合體

(preinitiationcomplex,PIC)。5354真核RNA聚合酶II與通用TF的作用過程55少數(shù)幾個反式作用因子之間相互作用，再與基本轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶搭配而有針對性地結(jié)合并轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。拼板理論(piecingtheory)2、少數(shù)幾個反式作用因子的搭配啟動特定基因的轉(zhuǎn)錄

三、轉(zhuǎn)錄延長過程中沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。RNApol的前移處處都遇上核小體。通過體外轉(zhuǎn)錄實驗可以觀察到轉(zhuǎn)錄延長中核小體移位和解聚現(xiàn)象。56RNApolRNApolRNApol核小體轉(zhuǎn)錄延長中的核小體移位轉(zhuǎn)錄方向575------AAUAAA-5------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點55333加尾AAAAAAA······3mRNA四、轉(zhuǎn)錄終止和加尾修飾同時進行58真核生物RNA的加工和降解第四節(jié)59轉(zhuǎn)錄的直接產(chǎn)物→初級RNA轉(zhuǎn)錄物加工

成熟的RNA（mRNA、tRNA、rRNA）加工主要在細胞核中進行605pppGp…5GpppGp…pppGppi鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶5m7GpppGp…甲基轉(zhuǎn)移酶SAM（一）前體mRNA在5’-端加入“帽”結(jié)構(gòu)5ppGp…磷酸酶Pi61一、核不均一RNA經(jīng)首、尾修飾和剪接后成為mRNA帽子結(jié)構(gòu)7-甲基鳥嘌呤62movie63（二）前體mRNA在3’-端特異位點斷裂并加上多聚腺苷酸尾結(jié)構(gòu)★

5’-末端的帽結(jié)構(gòu)：m7G-5ppp5’-Np保護RNA免受核酸外切酶的水解促進核糖體與mRNA的結(jié)合、加速翻譯的起始速度★

3’-末端的polyA結(jié)構(gòu):增強mRNA的穩(wěn)定性，提高翻譯效率參與mRNA從核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移真核生物mRNA的特點

（閱讀框）64重點外顯子（exon）

在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達為成熟RNA的核酸序列。結(jié)構(gòu)基因中有表達活性的編碼序列。

內(nèi)含子（intron）

隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列。結(jié)構(gòu)基因中無表達活性的非編碼序列。65（三）前體mRNA的剪接主要是去除內(nèi)含子前體mRNA分子有剪接和剪切兩種模式

剪接就是去除初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的內(nèi)含子，把外顯子連接為成熟的RNA；內(nèi)含子區(qū)段彎曲，使相鄰的兩個外顯子靠近而利于剪接，稱為套索RNA（lariatRNA）；剪接過程的化學反應(yīng)稱為二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)；66

剪切就是剪去某些內(nèi)含子，然后在上游的外顯子3’端直接進行多聚腺苷酸化，不進行相鄰外顯子之間的連接反應(yīng)。(ppG,pppG-OH)U-OHGpUpA第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)UpAGpU外顯子1內(nèi)含子外顯子2G-OHUpUpA剪接過程的二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

(twicetransesterification)剪接體（spliceosome）是內(nèi)含子剪接場所；68雜化核RNA：hetero-nuclearRNA,hnRNA

核小RNA：smallnuclearRNA,snRNA多種蛋白質(zhì)

5種核小核糖核蛋白顆粒(snRNP)5種snRNAsnRNP與hnRNA結(jié)合成為剪接體

69Publishedonline20April2014“一對手拉手的情侶”活細胞內(nèi)單個mRNA剪接變體的定量成像Averagenumberofexonspergenedoesvarywithorganism.釀酒酵母果蠅哺乳動物70

從酵母到哺乳動物，基因的大小差異極大，主要取決于內(nèi)含子的大小。71Y:percentX:sizeofgene(kb)雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接成熟的mRNA卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾72卵清蛋白成熟mRNA與DNA模板鏈雜交電鏡示意圖DNAmRNA7374（四）mRNA編輯是對基因的編碼序列進行轉(zhuǎn)錄后加工RNA編輯（RNAediting):

有些基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列與基因的初級轉(zhuǎn)錄物序列并不完全對立，mRNA上的一些序列在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生了改變，稱為RNA編輯。二、真核rRNA前體經(jīng)過剪接形成不同類別的rRNA轉(zhuǎn)錄45S-rRNA剪接18S-rRNA5.8S和28S-rRNArDNA內(nèi)含子內(nèi)含子28S5.8S18S75三、前體tRNA的加工包括核苷酸的堿基修飾tRNA前體RNApolⅢTGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNA761、剪切核糖核酸酶77tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶、連接酶ATPADP2、加上CCA-OH的3’-末端78（2）還原反應(yīng)如：UDHU

（3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)如：Uψ（4）脫氨反應(yīng)如：AI

如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）3、堿基修飾為稀有堿基79四、RNA催化一些真核和原核基因內(nèi)含子的自剪接具有酶促活性（酶的活性）的RNA稱為核酶。核酶(ribozyme)Ribonucleicacidwithcatalyticabilitywhosesubstrateisribonucleicacid8081四膜蟲rRNA內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)四膜蟲rRNA的剪接采用內(nèi)含子自我剪接方式5′-端核苷酸序列82最簡單的核酶二級結(jié)構(gòu)——錘頭結(jié)構(gòu)(hammerheadstructure)底物部分通常為60個核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份催化部份和底物部份組成錘頭結(jié)構(gòu)

核酶能起作用的結(jié)構(gòu)要求，至少含有3個莖（RNA分子內(nèi)配對形成的局部雙鏈），1至3個環(huán)（RNA分子局部雙鏈鼓出的單鏈）和至少有13個一致性的堿基位點。83核酶研究的意義核酶的發(fā)現(xiàn)，對中心法則作了重要補充；核酶的發(fā)現(xiàn)是對傳統(tǒng)酶學的挑戰(zhàn)；利用核酶的結(jié)構(gòu)設(shè)計合成人工核酶。84人工設(shè)計的核酶粗線表示合成的核酸分子細線表示天然的核酸分子X表示一致性序列箭頭表示切斷點85NatureBiotechnology,2001,5686脫氧核酶（DNAzyme)1.脫氧核酶在腫瘤治療中的應(yīng)用研究

脫氧核酶是利用體外分子進化技術(shù)獲得的一種具有催化功能的短片段單鏈DNA…

2.脫氧核酶分子診斷系統(tǒng)及其在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用研究

腫瘤的個體化靶向治療已成為臨床腫瘤治療的重要手段之一…

3、新型脫氧核酶DeliverySystem的研究

脫氧核酶將高效的催化降解能力與反義的靶向識別能力結(jié)合，能夠特異地針對靶標從mRNA水平關(guān)閉靶基因，從而調(diào)控目標蛋白質(zhì)的表達，是一種高效特異的靶向基因治療的新策略…

脫氧核酶的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究8788SunLQ,etal(CSU)Inamousetumorxenograftmodel,thecomplexwasshowntobedeliveredefficientlytotumortissue,downregulatingexpressionofLMP1andsuppressingtumorgrowth.TheseresultssuggestthatArg-nHAPmaybeanefficientvectorfornucleicacid-baseddrugswithpotentialclinicalapplication.腫瘤異種移植模型ACSNANO,2012,915089Importa