楊官品分子生物學(xué)試題

基因是什么？基因存在什么地方？如何界定？如何記錄？能用生物學(xué)方法分離大量基因組DNA，為什么還要進(jìn)行DNA克隆。答：1）基因：包含合成某一特定蛋白質(zhì)的所有信息的DNA序列，包括上游調(diào)節(jié)序列、外顯子和內(nèi)含子。2）經(jīng)典的基因概念認(rèn)為，DNA分子是基因的載體（不等于所有生物的基因都是DNA，有的生物eg.某些病毒遺傳體系的基礎(chǔ)是RNA，而不是DNA。），但是，并非每一段DNA都是基因，而是在染色體或DNA分子上呈串珠似的排列，并且它們之間有非遺傳的物質(zhì)連接。信息的交換只在基因間進(jìn)行?；蚣仁沁z傳的功能單位也是交換和突變單位。實際上，在現(xiàn)代的遺傳學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)把基因與順反子通用，即一個順反子就是一個基因，由一個突變單位和重組單位組成的線性結(jié)構(gòu)。3）DNA克?。簯?yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)—同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子—復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴增獲得大量同一DNA分子，即。由于早期研究是從較大的染色體分離、擴增特異性基因，因此DNA克隆又稱基因克隆。“克隆”某一基因或DNA片段過程中，將外源DNA插入載體分子所形成的復(fù)制子是雜合分子--嵌合DNA，所以DNA克隆又稱重組DNA。而生物化學(xué)獲得DNA的方法與之比較起來有幾點不同（不足）之處：a.獲得的DNA的量于其原始材料有關(guān)，不能如DNA克隆一樣進(jìn)行自主擴增；b.提取DNA的純度受到實驗條件，操作步驟的影響；c.不能夠?qū)⑺@得的DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入新的載體DNA，進(jìn)行重新組合，不便于基因重組的研究與應(yīng)用eg.DNA免疫技術(shù)的研究等?，F(xiàn)在最常用的DNA克隆載體有哪些？基因表達(dá)載體與DNA克隆載體是不同的載體嗎？答:1）克隆載體按材料可分質(zhì)粒克隆載體、病毒（噬菌體）克隆載體、質(zhì)粒同病毒（噬菌體）DNA組成的克隆載體、質(zhì)粒同染色體DNA組成的基因整合克隆載體、葉綠體或線粒體DNA構(gòu)建的克隆載體等；按用途分成通用克隆載體、大片段DNA克隆載體、CDNA克隆載體、表達(dá)克隆載體等；以受體分成大腸桿菌克隆載體、植物克隆載體、動物克隆載體等。

常用的載體包括三大類，即質(zhì)粒（常用的有pBR322、pUC系列）單鏈絲狀噬菌體和噬粒（常用的大腸桿菌絲狀噬菌體包括M13噬菌體f噬菌體等，噬粒兩種.表達(dá)載體:為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體2）基因表達(dá)載體與DNA克隆載體的范圍是不一樣的，后者的范圍要較前者更為廣泛。DNA克隆載體：為“攜帶”感興趣的外源DNA、實現(xiàn)外源DNA的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。而基因表達(dá)載體是DNA克隆載體中按特殊結(jié)構(gòu)創(chuàng)建的，為使插入特定位點的外源編碼DNA序列可以轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計的克隆載體。什么叫做分子標(biāo)記？有哪些分子標(biāo)記？分子標(biāo)記能被開發(fā)利用盡嗎？答：1）廣義的分子標(biāo)記是指可以遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同功酶及等位酶。狹義的分子標(biāo)記是指DNA分子標(biāo)記：能反映生物個體或種群間基因組某些差異特征的DNA片段，它是DNA分子上堿基的突變、缺失、插入、易位、倒位或由于長短與排列不一的重復(fù)序列等機制而產(chǎn)生的。2）分子標(biāo)記種類：a.限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）：是發(fā)展最早的分子標(biāo)記技術(shù)，原理是檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的DNA片段的大小。凡是可以引起酶切位點變異的突變?nèi)琰c突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。此技術(shù)及其從中發(fā)展出來的一些變型均包括以下基本步驟：DNA的提取、用限制性內(nèi)切酶酶切DNA、用凝膠電泳分開DNA片段、把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上、利用放射性標(biāo)記的探針顯示特定的DNA片段（通過Southern雜交）、分析結(jié)果。b.如果RFLP探針是來自拷貝數(shù)可變重復(fù)（VNTR）,則產(chǎn)生另一類因相同或相近序列的拷貝數(shù)變化所引起的多態(tài)性。凡是引起重復(fù)單位的大小和序列不同、基因組中重復(fù)的數(shù)目和分布不同等均可導(dǎo)致這種多態(tài)性的產(chǎn)生。在RFLP技術(shù)中有特殊用途（成為分子標(biāo)記）的重復(fù)序列包括：小衛(wèi)星序列和微衛(wèi)星或簡單重復(fù)序列(SSR)。c.隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）：用一個（有時用兩個）隨機引物（一般8－10個堿基）非定點地擴增DNA片段，然后用凝膠電泳分開擴增片段。d.特定序列位點：（STS）對由其特定引物序列所界定的一類標(biāo)記的統(tǒng)稱。利用特異PCR技術(shù)的最大優(yōu)點是它產(chǎn)生的信息非?？煽浚幌驲APD、AFLP和利用隨機探針產(chǎn)生的RFLP存在某種模糊性（如難以鑒別片段的來源）。這類分子標(biāo)記主要有：SSR、加錨微衛(wèi)星核苷酸、SCAR、CAPS、SPAR、DAMD、ISTR、IFLP、RAMPO、RFLP-PCR。e.擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)：其特點是把RFLP和PCR結(jié)合了起來。其基本步驟是：把DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，然后選擇特定的片段進(jìn)行PCR擴增(在所有的限制性片段兩端加上帶有特定序列的“接頭”，用與接頭互補的但3?端有幾個隨機選擇的核苷酸的引物進(jìn)行特異PCR擴增，只有那些與3’端嚴(yán)格配對的片段才能得到擴增)，再在有高分辨力的測序膠上分開這些擴增產(chǎn)物，用放射性法、熒光法或銀染染色法均可檢測之。這種技術(shù)又稱為“選擇性限制性片段擴增”f.單核苷酸多態(tài)性（SNP）：同一位點的不同等位基因之間常常只有一個或幾個核苷酸的差異，因此在分子水平上對單個核苷酸的差異進(jìn)行檢測是很有意義的。目前SNP作為一種新的分子標(biāo)記，已有2000多個標(biāo)記定位于人類染色體上，在植物上也在進(jìn)行開發(fā)研究?？稍谀z上也可不在膠上就能檢測出SNP，但檢測SNP的最佳方法是新近發(fā)展起來的DNA芯片技術(shù)。（3）分子標(biāo)記能被開發(fā)利用盡。（不知如何解釋）如果我們要測定某個細(xì)菌的基因組序列，你能設(shè)計一個測定序列的策略嗎？答：采用全基因組鳥槍法對該細(xì)菌的基因組序列進(jìn)行測序：建立高度隨機、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫：克隆數(shù)目要達(dá)到一定的數(shù)量，即經(jīng)末端測序的克隆片段的堿基總數(shù)應(yīng)達(dá)到基因組5倍以上。高效、大規(guī)模的末端測序：對文庫中每一個克隆，進(jìn)行兩端測序。序列集合：應(yīng)用軟件修改序列集合規(guī)則，以最大限度的排除錯誤的連鎖匹配。填補缺口：填補沒有相應(yīng)模板DNA的物理缺口或是有模板DNA但未測序的序列缺口?？梢越⒑幸欢ㄆ未笮〔迦肫蔚摩宋膸煲詡淙笨谔钛a。答：基因敲除技術(shù)在細(xì)菌培養(yǎng)基中同時添加葡萄糖而不利用乳糖，當(dāng)葡萄糖消耗完時，細(xì)菌轉(zhuǎn)而利用乳糖。用所學(xué)的知識解釋？假如除葡萄糖外，我們在培養(yǎng)基中添加阿拉伯糖，細(xì)菌如何利用這些糖？

答：在細(xì)菌中（如大腸桿菌為例），有兩種蛋白質(zhì)為乳糖代謝所必需，他們是?-半乳糖苷酶，該酶分解乳糖（?-半乳糖苷）產(chǎn)生半乳糖和葡萄糖以及乳糖透性酶。在乳糖代謝中?-半乳糖苷酶的作用是裂解乳糖產(chǎn)生葡萄糖（另一種裂解產(chǎn)物半乳糖通過半乳糖操縱子產(chǎn)生的酶的作用最終也轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟牵Ｒ虼巳绻谏L培養(yǎng)基中同時存在葡萄糖和乳糖，就不需要lac操縱子的活性；事實上，?-半乳糖苷酶一直不合成，直到培養(yǎng)基中所有的葡萄糖耗盡為止。沒有l(wèi)acmRNA合成就沒有?-半乳糖苷酶的合成。在有葡萄糖時，就沒有l(wèi)acmRNA的合成.這是因為除了誘導(dǎo)物使lacⅠ阻遏物失活外，需有另一個因子起始lacRNA的合成，這個因子的活性由葡萄糖的濃度來調(diào)節(jié)。葡萄糖對lac操縱子表達(dá)的抑制效應(yīng)是相當(dāng)間接的。當(dāng)葡萄糖消耗晚時，該因子活性增強，起始lacRNA的合成，從而促使lacmRNA以及?-半乳糖苷酶的合成。使得細(xì)菌轉(zhuǎn)而進(jìn)行乳糖代謝。附：乳糖操縱子的調(diào)控機制1.乳糖操縱子（元）的結(jié)構(gòu)

E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調(diào)節(jié)基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子（元）受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白（CAP）結(jié)合位點。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū)，三個酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)。

阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)

在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時，I序列在PI啟動序列操縱下表達(dá)的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起動。當(dāng)有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導(dǎo)。在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)b－半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一種作用極強的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實驗室廣泛應(yīng)用。

CAP的正性調(diào)節(jié)

分解(代謝)物基因激活蛋白CAP是同二聚體，在其分子內(nèi)有DNA結(jié)合區(qū)及cAMP結(jié)合位點。當(dāng)沒有葡萄糖及cAMP濃度較高時，cAMP與CAP結(jié)合，這時CAP結(jié)合在lac啟動序列附近的CAP位點，可刺激RNA轉(zhuǎn)錄活性，使之提高50倍；當(dāng)有葡萄糖存在時，cAMP濃度降低，cAMP與CAP結(jié)合受阻，因此lac操縱子表達(dá)下降。由此可見，對lac操縱子（元）來說CAP是正性調(diào)節(jié)因素，lac阻遏蛋白是負(fù)性調(diào)節(jié)因素。兩種調(diào)節(jié)機制根據(jù)存在的碳源性質(zhì)及水平協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)lac操縱子的表達(dá)。

協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)lac阻遏蛋白負(fù)性調(diào)節(jié)與CAP正性調(diào)節(jié)兩種機制協(xié)調(diào)合作：當(dāng)Lac阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時，CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；但是如果沒有CAP存在來加強轉(zhuǎn)錄活性，即使阻遏蛋白從操縱序列上解聚仍幾無轉(zhuǎn)錄活性。可見，兩種機制相輔相成、互相協(xié)調(diào)、相互制約。由于野生型lac啟動序列作用很弱，所以CAP是必不可少的。

lac操縱子（元）的負(fù)性調(diào)節(jié)能很好地解釋：單純?nèi)樘谴嬖跁r，細(xì)菌是如何利用乳糖作碳源的。然而，細(xì)菌生長環(huán)境是復(fù)雜的，倘若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在時，細(xì)菌首先利用葡萄糖才是最節(jié)能的。這時，葡萄糖通過降低cAMP濃度，阻礙cAMP與CAP結(jié)合而抑制lac操縱子轉(zhuǎn)錄，使細(xì)菌只能利用葡萄糖。葡萄糖對lac操縱子的阻遏作用稱分解代謝阻遏。lac操縱子強的誘導(dǎo)作用既需要乳糖存在又需缺乏葡萄糖